Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Giriş. Merhaba. Brezilya'daki Federal Universidade de Faja Biyometrik Bilimler Enstitüsü'nden geliyoruz. Bu videoda, olası kromozom değişikliklerini tespit etmek amacıyla insan embriyonik kök hücrelerinin kromozom yayılımlarını hazırlayacağız. İnsan embriyonik kök hücrelerinin stabil bir karyotip sergilediği gösterilmiş olsa da, birçok çalışma kültür koşullarına bağlı olarak, kromozomların tamamının veya kısımlarının eklenmesi gibi kromozom anomalileri edinmeye meyilli olduklarını bildirmiştir.

HASS'nin in vitro genetik bütünlüğünün karakterizasyonu, temel bir araç ve embriyogenez çalışmaları ile ilaç testleri göz önüne alındığında kritik öneme sahiptir. Ayrıca, gelecekteki terapötik öneriler için, karsinojenez ile sıklıkla ilişkilendirildiği için kromozomal değişiklikler gerçek bir endişe kaynağıdır. Öyleyse başlayalım.

Hücrelerin ate ile işlenmesi. Bu prosedürde, bunu kullanıyoruz. Sekiz ila dokuz, %20 fetal sığır serumu ikamesi ve 80 ila 9 g/mL fibroblast büyüme faktörü ile desteklenmiş F 12 içerisinde kültüre edilmiştir. Kültür flaskını inkübatörden çıkararak başlayın ve laminer akışlı kabin altında, final konsantrasyonu 0,1 µg/mL olacak şekilde coit ekleyin.

Ortama Coit eklenmesi mitoz, dinlenme ve metafaz evrelerini indükler. Kromozomlar yeterince yoğunlaştığında ve mikroskop altında daha kolay gözlemlenebildiğinde, kontaminasyonu önlemek için steril teknikler kullandığınızdan emin olun. Coit ekledikten sonra flaskı kapatın ve hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.

İnkübasyon süresi sonrası hücrelerin fikse edilmesi; hücreler bu aşamada henüz fikse edilmeye hazır değildir. Steril koşullar altında çalışmaya gerek yoktur. Öncelikle besiyerini aspire ederek başlayın ve işlem bittiğinde tripsin ekleyin.

Balona %0,05 DTA ekleyin. Hücrelerin taban yüzeyini tamamen kaplayacak kadar yeterli tripsin eklediğinizden emin olun. Balonun kapağını kapatın ve eşit şekilde dağılması için nazikçe sallayın.

Trypsinin hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe etmesine izin verin. Oda sıcaklığındaki beş dakikalık inkübasyonun ardından hücreler artık flaskın alt tarafına tutunmamış olmalıdır; bu aşamada, serum içeren kültür medyumu ekleyerek veya hücrelere nazikçe serum ekleyerek tripsini inaktive etmeniz gerekecektir. Flaskın kapağını dikkatlice açın ve sıvının hücrelerin üzerinde, flaskın alt tarafına yayılmasına izin vererek kültür medyumunu veya serumu ekleyin.

Hücreleri tamamen ayrıştırmak için hücre süspansiyonunu pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı çekin. Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, ancak bunu yapmadan önce hücrelerin iyice ayrıştığından ve süspansiyonun gözle görülür herhangi bir hücre kümesi içermediğinden emin olun. Aktarımı tamamladığınızda tüpün kapağını kapatın ve santrifüjleyin.

Süspansiyonu beş dakika boyunca karıştırın. Santrifüj sonrası 800 RPM'de tüpün dibinde bir hücre peleti oluşmalıdır. Hücre peletini bozmamaya dikkat edin.

Sıvıyı, yaklaşık 200 µL kalana kadar P 1000 ile aspire edin. Bu hacim, Resus için orta derecedir. Peleti Resus içinde süspande edin.

Peleti süspande edin. Tüpü parmaklarınızla birkaç kez hafifçe vurun. Çözeltide hücre kümesi kalıp kalmadığını kontrol ederek hücrelerin iyice süspande olduğundan emin olun.

Bu aşamada çözelti bulanık olmalıdır. Ardından, 37 °C'ye önceden ısıtılmış 75 mM potasyum klorür çözeltisinden beş mililitre eklemeniz gerekir. Hipotonik çözelti, tüpü döndürürken tüpün alt kısmından çok yavaş bir şekilde eklenmelidir.

İlk üç mililitreyi ekledikten sonra, tüpün kapağını dikkatlice ve sıkıca kapatın. Hücre süspansiyonunu, tüpü yatay olarak nazikçe çevirip yavaşça döndürerek hipotonik bir solüsyonla homojenize edin.

Kalan iki mililitre, daha öncekiyle aynı şekilde yavaşça eklenerek işleme devam edilir. Hipotonik çözeltinin amacı, kromozomların çözülmesini sağlamak için hücre hacmini artırmaktır. Bu nedenle, beş mililitrenin tamamı eklendiğinde, iyi kromozom yayılımları elde etmek için bu inkübasyon süresi kritik öneme sahiptir; tüpün kapağı kapatılır ve hücreler 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda 15 dakika boyunca inkübe edilir.

15 dakikalık inkübasyon süresi tamamlandığında, tüpü su banyosundan çıkarın. Fiksasyon solüsyonu tarafından üretilen buharlar toksik olduğundan, bu aşamada çeker ocak altında çalışmanız önerilir. Çeker ocak imkanınız yoksa, iyi havalandırılan bir alanda çalıştığınızdan emin olun.

Tüpün kapağını çıkarın ve üç damla tespit çözeltisi ekleyin. Bu çözelti, metanol ve asetik asidin 3:1 oranındaki karışımıdır ve kullanım gününde hazırlanmalıdır. Tüpün kapağını sıkıca kapatın ve tüpü önce saat yönünde, ardından saat yönünün tersine yavaşça döndürerek nazikçe yatay olarak çevirin.

Tüpü, frenleme yapmadan 800 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj sonrası hücre aşınmasının neden olacağı materyal kaybını önlemek için dönüş döngüsünün yavaşça durmasına izin verilmesi çok önemlidir. Bu kardiyositler yaklaşık 200'de yaşar.

Pelleti askıya almak için tüpü parmaklarınızla birkaç kez hafifçe vurun. Hücre kümelerinin kalıp kalmadığını kontrol ederek hücrelerin iyice askıya alındığından emin olun. İlk 3 mL fiksasyon çözeltisini ekledikten sonra, tüpü döndürürken 3 mL fiksasyon çözeltisini tüp duvarı boyunca yavaşça ekleyin.

T tüpünün kapağını sıkıca kapatın ve tüpü yatay olarak nazikçe çevirip yavaşça döndürerek hücre süspansiyonunu dikkatlice homojenize edin. En az bir tam dönüş yaptığınızdan emin olun. Bu karıştırma işlemini en üst düzeye çıkarmak için miktar artırın.

Hücreleri çöktürmek için tüp duvarından iki mililitre tespit çözeltisi ekleyin. Hücre süspansiyonunu dört derece Celsius'ta gece boyunca bekletin. Tespit edilmiş bu hücreler, tespit çözeltisi içerisinde dört derece Celsius'ta aylarca saklanabilir.

Ertesi gün hücreleri yıkamak için, hücreleri 800 RP hızında beş dakika boyunca kesintisiz olarak santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve yaklaşık 200 µL içinde bırakın. Tüpü parmaklarınızla birkaç kez hafifçe vurarak peleti süspande edin.

Hücrelerin iyi ilişkilendirildiğinden ve süspansiyonun gözle görülür herhangi bir hücre kümesi içermediğinden emin olun. Tüp duvarı boyunca beş mililitre taze tespit çözeltisini yavaşça ekleyin. Tüpün kapağını kapatın ve tüpü yavaşça döndürürken nazikçe yatay olarak çevirerek hücreleri homojenize edin.

Buradaki hücreleri korumanın yanı sıra, tespit çözeltisi lipidleri uzaklaştırır ve ardından proteinlere etki eder; sonuç olarak kromozomların kolayca yayılmasını sağlar. Tüpü, ara vermeden 800 RRP M hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Lamların Hazırlanması Santrifüj aşamasında, hücre pelletini homojenize etmek için yeterli miktarda çözelti bırakın.

Bu sıvı miktarı hücre sayısına bağlı olarak değişebilir. Tüpü parmaklarınızla birkaç kez hafifçe vurun. Görsel bir hücre kümesi olup olmadığını kontrol ederek hücrelerin iyi dağıldığından emin olun.

Bu noktada, pipeti lam yüzeyine paralel hareket ettirerek, temiz ve kuru bir lama 20 ila 30 µL hücre süspansiyonu eklenmelidir. Fiksasyon çözeltisi buharlaştıkça, lam yüzeyi hemen pürüzlü bir görünüm alır. Hücrelerin şişmesini sağlamak için lam, yüzeyi yukarı bakacak şekilde 30 saniye boyunca sıcak su buharına maruz bırakılır.

Bu ışıkların analizi. Bu lamlar hazırlandıktan sonra, hücre yoğunluğunun daha ileri analizler için uygun olup olmadığını görmek amacıyla 10x ve 40x objektifleri kullanarak faz kontrast mikroskobunda analiz edin. Bu lam, konsantrasyonu çok yüksek olan bir örnektir.

Hücre çekirdeklerinin metafaz yayılımlarına çok yakın olduğuna dikkat edin. Hücre yoğunluğunun çok yüksek olduğu bir lamınız varsa, daha fazla tespit çözeltisi ekleyerek hücre süspansiyonunu seyreltin. Bu lam, istenen hücre yoğunluğunu göstermektedir.

Metafaz yayılımlarının iyi dağılmış ve izole olduğuna dikkat edin. Optimal hücre yoğunluğuna sahip bir lam elde edildiğinde, boyama ve analiz işlemlerine geçilebilir. Kromozomlar gizlenmiş olabileceği veya görüş alanı engellenebileceği için çekirdek yakınındaki metafazların seçilmesinden kaçının.

Yuvarlak olan metafazları arayın, ancak hiçbir kromozomun metafaz plağından uzaklaşmadığından emin olarak yuvarlak ve iyi izole edilmiş iki metafaz seçin. Bir sonraki slaytta olduğu gibi, iki veya daha fazla yayılımın üst üste gelmesiyle oluşan kromozom kazancı veya düzleşmiş kromozomların neden olduğu kromozom kaybı gibi yanlış IES raporlamaktan kaçınmaya çalışın.

Bu videonun sonraki deneylerinizde size yardımcı olacağını umuyoruz. Herhangi bir sorunuz olursa bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin. Keyifli seyirler ve başarılar dileriz.