Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Giriş. Merhaba. Brezilya'daki Federal Universidade de Faja Biyometrik Bilimler Enstitüsü'nden geliyoruz. Bu videoda, olası kromozom değişikliklerini tespit etmek amacıyla insan embriyonik kök hücrelerinin kromozom yayılımlarını hazırlayacağız. İnsan embriyonik kök hücrelerinin stabil bir karyotip sergilediği gösterilmiş olsa da, birçok çalışma kültür koşullarına bağlı olarak kromozomların tamamının veya kısımlarının eklenmesi gibi kromozom anomalileri kazanmaya meyilli olduklarını bildirmiştir.

HASS'nin in vitro genetik bütünlüğünün karakterizasyonu, temel bir araç ve embriyogenez çalışmaları ile ilaç testleri göz önüne alındığında kritik öneme sahiptir. Ayrıca, gelecekteki terapötik öneriler için, karsinogenez ile sıklıkla ilişkili olduğu için kromozomal değişiklikler gerçek bir endişe kaynağıdır. Öyleyse başlayalım.

Hücrelerin ate ile tedavisi. Bu prosedürde, bunu kullanıyoruz. Sekiz ila dokuz adet, %20 fetal bovine serum yerine koyucu ve 80 ila 9 g/mL fibroblast büyüme faktörü ile desteklenmiş F 12 içerisinde kültüre edilmiştir. İnkübatörden kültür balonunu çıkararak başlayın ve laminer akışlı bir kabin altında, nihai konsantrasyonu 0.1 µg/mL olacak şekilde coit ekleyin.

Ortama Coit eklenmesi mitoz, dinlenme ve metafaz evrelerini tetikler. Kromozomlar yeterince yoğunlaştığında ve mikroskop altında daha kolay görüntülenebildiğinde, kontaminasyonu önlemek için steril teknikler kullandığınızdan emin olun. Coit ekledikten sonra flaskı kapatın ve hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.

İnkübasyon süresinin ardından hücrelerin fikse edilmesi; hücreler bu aşamada henüz fikse edilmeye hazır değildir. Steril koşullar altında çalışmaya gerek yoktur. Besiyerini aspire ederek başlayın ve işlem bittiğinde tripsin ekleyin.

Flaska %0,05 DTA ekleyin. Hücrelerin taban yüzeyini kapatmaya yetecek miktarda tripsin eklediğinizden emin olun. Flaskın kapağını kapatın ve eşit şekilde dağıtmak için nazikçe sallayın.

Tripsin sonrası hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Oda sıcaklığındaki beş dakikalık inkübasyonun ardından, hücreler artık flaskın tabanına tutunmamış olmalıdır; bu noktada tripsini ya serum içeren besiyerini ekleyerek ya da hücrelere nazikçe serum ekleyerek inaktive etmeniz gerekir. Flaskın kapağını dikkatlice açın ve sıvının hücrelerin bulunduğu flask tabanına yayılmasını sağlayacak şekilde besiyerini veya serumu ekleyin.

Hücreleri tamamen ayrıştırmak için hücre süspansiyonunu pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekin. Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, ancak bunu yapmadan önce hücrelerin iyice ayrıştığından ve süspansiyonda gözle görülür herhangi bir hücre kümesi bulunmadığından emin olun. Aktarma işlemi tamamlandığında tüpün kapağını kapatın ve santrifüj edin.

Süspansiyonu beş dakika boyunca karıştırın. Santrifüj sonrası 800 RPM'de, tüpün altında bir hücre peleti oluşmuş olmalıdır. Hücre peletini bozmamaya dikkat edin.

Sıvıyı, yaklaşık 200 µL kalana kadar bir P 1000 ile aspire edin. Bu hacim Resus için uygundur. Pelleti Resus içerisinde süspande edin.

Paleti süspanse edin. Tüpü parmaklarınızla birkaç kez hafifçe vurun. Çözeltide hücre kümesi kalmadığını kontrol ederek hücrelerin iyice süspanse olduğundan emin olun.

Bu noktada çözelti bulanık olmalıdır. Ardından, 37 °C'ye önceden ısıtılmış 75 mM potasyum klorür çözeltisinden beş mililitre eklemeniz gerekir. Hipotonik çözelti, tüpü döndürürken alt kısımdan çok yavaş bir şekilde eklenmelidir.

İlk üç mililitreyi ekledikten sonra, tüpün kapağını sıkıca ve dikkatlice kapatın. Hücre süspansiyonunu hipotonik bir çözelti ile, tüpü nazikçe yatay olarak çevirip yavaşça döndürerek homojenize edin.

Kalan iki mililitre, daha önce yapıldığı şekilde yavaşça eklenerek işleme devam edilir. Hipotonik çözeltinin amacı, kromozomların çözülmesine olanak sağlamak için hücre hacmini artırmaktır. Dolayısıyla bu inkübasyon süresi, iyi kromozom yayılımları elde etmek için kritik öneme sahiptir; beş mililitrenin tamamı eklendiğinde tüpün kapağını kapatın ve hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika boyunca inkübe edin.

15 dakikalık inkübasyon süresi tamamlandığında, tüpü su banyosundan çıkarın. Fiksasyon çözeltisinin ürettiği buharlar toksik olduğundan, bu aşamadan itibaren işlemi bir çeker ocak altında gerçekleştirebilirsiniz. Çeker ocağa erişiminiz yoksa, iyi havalandırılan bir alanda çalıştığınızdan emin olun.

Tüpün kapağını çıkarın ve üç damla fiksasyon çözeltisi ekleyin. Bu çözelti, metanol ve asetik asidin 3:1 oranındaki karışımıdır ve kullanım gününde hazırlanmalıdır. Tüpün kapağını sıkıca kapatın ve tüpü önce saat yönünde, ardından saat yönünün tersine yavaşça döndürürken nazikçe yatay olarak çevirin.

Tüpü, duraklama yapmadan 800 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj sonrası hücre aşınmasının neden olduğu materyal kaybını önlemek için döngünün yavaşça durmasına izin verilmesi çok önemlidir. Bu kardiyositler yaklaşık 200'de yaşarlar.

Pelleti askıya almak için tüpe parmaklarınızla birkaç kez hafifçe vurun. Hücre kümelerinin kalıp kalmadığını kontrol ederek hücrelerin iyice askıya alındığından emin olun. İlk üç mililitreyi ekledikten sonra, tüpü döndürerek üç mililitre fiksasyon çözeltisini tüp duvarı boyunca yavaşça ekleyin.

T tüpünün kapağını sıkıca kapatın ve tüpü yatay olarak nazikçe döndürerek ve yavaşça çevirerek hücre süspansiyonunu dikkatlice homojenize edin. En az bir tam tur döndürdüğünüzden emin olun. Bu karıştırma işlemini en üst düzeye çıkarmak için daha fazla ekleyin.

Hücreleri çöktürmek için tüp duvarı boyunca iki mililitre fiksasyon çözeltisi ekleyin. Hücre süspansiyonunu dört derece Celsius'ta gece boyunca saklayın. Fikse edilmiş bu hücreler, fiksasyon çözeltisi içinde dört derece Celsius'ta aylarca saklanabilir.

Ertesi gün hücreleri yıkamak için hücreleri 800 RP'de beş dakika boyunca ara vermeden santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve yaklaşık 200 µL sıvı bırakın. Tüpe parmaklarınızla birkaç kez hafifçe vurarak pelletin süspanse olmasını sağlayın.

Hücrelerin iyi bağlandığından ve süspansiyonda gözle görülür herhangi bir hücre kümesi bulunmadığından emin olun. Tüp duvarı boyunca beş mililitre taze fiksatif çözeltiyi yavaşça ekleyin. Tüpün kapağını kapatın ve tüpü yavaşça döndürürken aynı zamanda yatay olarak hafifçe çevirerek hücreleri homojenize edin.

İçerideki hücreleri korumanın yanı sıra, tespit çözeltisi lipidleri uzaklaştırır ve ardından proteinlere yardımcı olur; sonuç olarak kromozom yayılımını kolaylaştırır. Tüpü, durmaksızın 800 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Lamların hazırlanması: Santrifüj adımında, hücre peletini homojenize etmek için yeterli miktarda çözelti bırakın.

Sıvı miktarı hücre sayısına bağlı olarak değişebilir. Tüpü parmaklarınızla birkaç kez nazikçe vura vura çalkalayın. Görünürde hücre topaklaşması olmadığını kontrol ederek hücrelerin iyi karıştığından emin olun.

Bu noktada, pipeti düzleğe paralel hareket ettirerek, temiz ve kuru bir lam üzerine 20 ila 30 µL hücre süspansiyonu eklenmelidir. Fiksasyon çözeltisi buharlaştıkça, yüzey hemen pürüzlü bir görünüm alır. Hücrelerin şişmesini sağlamak için lamı, yüzü yukarı bakacak şekilde 30 saniye boyunca sıcak su buharına maruz bırakın.

Bu ışıkların analizi. Bu lamlar hazırlandıktan sonra, hücre yoğunluğunun ileri analizler için uygun olup olmadığını görmek amacıyla 10'luk ve furry objektifleri kullanarak faz kontrast mikroskobunda inceleyin. Bu lam, çok konsantre olan bir örnektir.

Hücre çekirdeklerinin metafaz yayılımlarına çok yakın olduğuna dikkat edin. Hücre yoğunluğunun çok yüksek olduğu bir lamınız varsa, daha fazla tespit çözeltisi ekleyerek hücre süspansiyonunu seyreltin. Bu lam, istenen hücre yoğunluğunu göstermektedir.

Metafaz yayılımlarının iyi dağılmış ve izole olduğuna dikkat edin. Optimal hücre yoğunluğuna sahip bir lam elde edildiğinde, boyama ve analiz işlemi gerçekleştirilebilir. Kromozomlar gizlenmiş olabileceği veya görüş alanı engellenebileceği için çekirdeğe yakın olan metafazları seçmekten kaçının.

Yuvarlak olan metafazları arayın, ancak hiçbir kromozomun metafaz plakasından uzaklaşmadığından emin olun; yuvarlak ve iyi izole edilmiş metafazları seçin. Bir sonraki slaytta olduğu gibi, iki veya daha fazla yayılımla oluşan kromozom artışını veya düz kromozomlar tarafından oluşturulan kromozom kaybını yanlış IES olarak rapor etmekten kaçınmaya çalışın.

Bu videonun sonraki deneylerinizde size yardımcı olacağını umuyoruz. Herhangi bir sorunuz olursa bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin. Keyifli izlemeler ve başarılar dileriz.