Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

Bu protokol, inkübasyon tamponu, FXI kazein çözeltisi ve ilgilenilen proteazı içeren numunenin bir mikro santrifüj tüpüne eklenmesiyle başlar; ardından karışım nazikçe karıştırılır ve karanlıkta 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edilir. İnkübasyon süresinin sonunda proteolitik reaksiyonu durdurmak için TCA çözeltisi ekleyin, nazikçe karıştırın ve tekrar karanlıkta 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu adım, reaksiyona girmeyen substratın çökelmesini sağlayacaktır.

Numuneyi 10.000 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Asit çözünür FXI işaretli fragmanları içeren süpernatantı uzaklaştırın. Süpernatantı bir tüpe veya çok kuyucuklu plakaya aktarın, analiz tamponu ile seyreltin ve numuneyi bir florimetre ile okuyun.

Merhaba, ben Carrie Cup Vineyard; Missouri, St. Louis'teki Sigma Aldridge DeKalb tesisinde görev yapan bir bilim insanıyım. Bugün sizlere florometrik proteaz aktivitesi tayini prosedürünü göstereceğim. Bu prosedürü, düşük proteaz aktivitesini belirlemek için kalite kontrol laboratuvarımızda kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Bu prosedür için inkübasyon tamponu, assay tamponu ve 0,6 normal trikloroasetik asit veya TCA çözeltisi, kullanıma hazır çözeltiler olarak sağlanmıştır. Cain etiketli fite çözeltisini daha küçük hacimlerde alikotlayın ve -20 °C'de saklayın. Kehribar rengi flakonlar kullanarak veya şeffaf tüpleri folyoya sararak ışıktan koruduğunuzdan emin olun.

Fitik asit substratını alıkoymak, tekrarlanan dondurma-çözme döngüleri ihtiyacını minimize eder; tekrarlanan dondurma-çözme döngüleri veya fitik asidin şiddetli şekilde çalkalanması veya karıştırılması, fitik asidin ayrışmasına yol açarak daha yüksek arka plan gürültüsüne neden olabilir. Florimetreyi kalibre ederken veya fit sinyali için doğrusal aralığı belirlerken, fit kontrol çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi, uygun konsantrasyona getirmek için assay tamponu ile yeniden çözerek taze olarak hazırlayın.

Hazır olduğunda, çözeltiyi ışıktan koruyun. Son olarak, liyofilize tripsin şişesine 100 µL 1 mM hidroklorik asit ekleyerek ve tripsinin tamamen çözündüğünden emin olmak için kısa bir süre karıştırarak tripsin proteaz kontrolünü hazırlayın. Tripsinin asidik koşullar altında saklanması stabilitesini artırır.

Tripsin kontrol solüsyonunun sıcaklığa duyarlı olduğunu ve düşük konsantrasyonlarda stabil olmadığını unutmayın. Ardından, analiz boyunca kullanılacak test örnekleri, kontrol ve boş örnekleri içeren tüm analiz örneklerini hazırlamaya başlayın. Her bir test örneğini ışıktan koruyun.

Bir mikrosantrifüj tüpünde 20 µL inkübasyon tamponu, 20 µL fit c kian substratı ve 10 µL test örneğini birleştirin. Örnek karanlıkta inkübe edildiği sürece şeffaf bir mikrosantrifüj tüpü kullanılabilir. Ayrıca, yüksek proteaz aktivitesine sahip test örneklerinin seyreltilmesi gerekeceğini unutmayın.

Tripsin kontrol örneği, analizinin düzgün çalıştığını belirlemek, saptama sınırını tespit etmek veya genel bir standart eğrisi oluşturmak için pozitif kontrol olarak kullanılır; tripsin kontrolünü hazırlamak için, bir birim asitlendirilmiş tripsini dokuz birim inkübasyon tamponu veya test örnekleri için kullanılan tamponla birleştirin ve iyice karıştırın. Tripsinin nihai çalışma konsantrasyonu 20 µg/mL'dir. Farklı bir spesifik proteaz kullanılacaksa, kontrol çözeltisi bu spesifik proteaz ve uygun bir tampon ile hazırlanmalıdır.

Bir mikrosantrifüj tüpünde 20 µL inkübasyon tamponu, 20 µL fz cain substratı ve 10 µL tripsin kontrolünü birleştirerek kontrol örneğini hazırlamaya devam edin. Her analizle birlikte en az bir adet 5 ng tripsin kontrol örneğinin çalıştırılması veya seri dilüsyon kullanılması önerilir. Son örnek, bir mikrosantrifüj tüpünde 20 µL inkübasyon tamponu, 20 µL Fitz Caine substratı ve 10 µL ultra saf suyun birleştirilmesiyle hazırlanan boş örnektir (blank).

Üç tip örnek hazırlandıktan sonra, her tüpü nazikçe karıştırın ve 37 °C'de karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe edin. Aşırı türbülans yüksek floresan arka planına neden olabileceği ve assay hassasiyetini azaltabileceği için çok şiddetli karıştırmamaya dikkat edin. Hassasiyeti artırmak için 24 saate kadar inkübasyon yapılabilir, ancak FXI kazein degrade olmaya başlayabileceği için daha uzun süreli inkübasyonlar önerilmez.

İnkübasyon tamamlandığında yüksek floresan arka planına yol açmamak için, her bir mikro santrifüj tüpüne 150 µL TCA çözeltisi eklemek üzere uygun koruyucu ekipman kullanın. TCA ile inkübasyon sırasında, tüpte çökelmiş, sindirilmemiş ve çözünmeyen kazein olan beyaz bir pus gözlemlenmelidir; karışımı nazikçe karıştırın ve 37 °C'de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. TCA çözeltisi ile inkübasyonun sonunda, tüpleri oda sıcaklığında 10.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatant, floresans ölçümünde kullanılan asit çözünür fite etiketli Cain fragmanlarını içerir; pelletle birlikte çöken kısımdan herhangi bir maddenin pipet ucuna çekilmemesi için tüpün üst kısmından nazikçe pipetleme yapın, aksi takdirde sonraki floresan deteksiyonu sırasında yanlış pozitif bir okuma gerçekleşecektir. Bir florimetre kullanarak proteaz aktivitesini ölçmek için, 10 µL TCA süpernatantını bir tüpte bir mililitre analiz tamponu ile birleştirin ve nazikçe karıştırın. Ek olarak, 1 mL analiz tamponuna 10 µL FE ekleyerek analiz için FE standardını seyreltin. FE kontrolü ve Tripsin standardı, örneğin aşmaması gereken bir floresans seviyesi sağlar. TCA süpernatantı ve analiz tamponu çözeltisi, floresans ölçümü yapılmadan önce 2 ila 8 °C'de karanlıkta 24 saate kadar saklanabilir.

Bir küvet kullanılarak ölçüm yapılacaksa, çözeltiden bir mililitre uygun bir küvete aktarın; eğer çok sayıda örnek çalışılacaksa, florometrik verileri elde etmek için 96 kuyucuklu bir plaka ve floresan plaka okuyucu kullanılabilir. Bu analizde, olası cihaz kalibrasyonu için kontrol olarak floresein izotiyosiyanat sağlanmıştır. Burada, açıklanan prosedürü takiben FITC sinyalinin temsili bir lineerlik aralığı gösterilmektedir.

Bu kitin, ilk inkübasyon adımı için 30 dakikalık bir inkübasyon süresiyle kullanılması, 1,5 nanogram ile 25 nanogram aralığındaki tripsin ve kontrol örnekleri için bu tipik standart eğriyi verir. Floresans ölçümleri çok kuyucuklu bir plakada yapılmıştır. Analizin tespit limiti, boş örnekle elde edilen değerin üzerinde anlamlı bir floresans okuması üreten proteaz miktarıdır.

Bugün, biyolojik bir örnekteki florimetrik proteaz aktivitesini saptamak için Sigma Aldridge proteaz tayin kitinin nasıl kullanılacağını gösterdik. Bu kit kullanımınız için optimize edilmiş olsa da, çalıştırdığınız özel proteazlar için küçük modifikasyonlar yapmanız gerekebileceğini unutmamak önemlidir. Şimdilik anlatacaklarımız bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.