Name: Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: Öğrenin, canlı farelerde in vivo elektroporasyon ile plazmid DNA transfeksiyonunu. Bu yöntem, iskelet kaslarında gen ifadesini görselleştirmek ve gen tedavisi çalışmalarını ilerletmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr T. Otis, Nörobiyoloji Bölümü, UCLA, Biz bize TPLSM tesis paylaşımı için teşekkür eder, Dr. C. pEYFP ClC1 plazmid tür bağış için Fahlke, Fizyoloji Enstitüsü, RWTH Aachen, Almanya, ve Sn. teknik destek için R. Serrano. Bu çalışma NIH / NIAMS hibe AR047664 ve AR54816 bağışları ile desteklenmiştir.

FDB ve IO kasları in vivo elektroporasyon Deneysel Prosedürler <ol><li> In vivo elektroporasyon protokolleri başlamadan önce, memeli ifade plazmid konsantrasyonu 2-5 mg / ul TE plazmid Not aralığında verim amplifiye olmalıdır: Biz rutin olarak ticari amplifikasyon kitleri kullanın ve üreticinin prosedürleri takip . In vivo transfections iskelet kası çok iyi CMV organizatörü çalışma taşıyan Ticari ifade plazmid. </li><li> Kısım plazmid çözüm gerekli hacmi (10-20 ul) ve iki adet 0.5 ml Eppendorf tüpleri (fare her bir ayak için bir tane) kaydedin. </li><li> Steril Tyrode 2 mg / ml hiyalüronidaz içeren bir solüsyon hazırlayın. </li><li> Bir anestezi kutusunu kullanarak, derin bir fare kullanarak onaylı bir gaz anestezi makinası ile O2% 4 izofluran anestezisi. Bir ısıtma yastığı (37 ° C) hayvan koyun ve bir kemirgen yüz maskesi kullanılarak anestezi korumak. Ayak tutam refleks ile anestezi derinliği izleyin. </li><li> Diseksiyon mikroskobu ile gözlem altında 1 &quot;uzun 33 göstergesi steril bir iğne kullanarak fare tek ayak ayak pedleri, 10 mcL altında hiyalüronidaz çözüm enjekte edilir. Ayağın topuk yakın bir noktada cilde nüfuz etmesini ve deri altına iğne ~ 1 / 4 &quot;için ayak tabanına doğru ilerlemek. </li><li> İstenirse diğer ayak ile aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Anestezi çıkarın ve fareyi bir kafes yerleştirin. Tam anestezi kurtarmak için izin verin. </li><li> Bir saat sonra, ikinci kez hayvan uyutmak ve ısıtma yastığı koyun. Hiyalüronidaz çözüm için açıklanan aynı prosedürü izleyerek, plazmid DNA (plazmid yapının büyüklüğüne göre) toplam 20-50 mg enjekte edilir. Toplam enjeksiyon hacmi az 20 mcL / ayak olmalıdır Not: 15-20 μ L gerekli olduğunda, cilt, doku yapıştırıcı ile iğne giriş noktasında kapatmak için tavsiye edilir . </li><li> Anestezi çıkarın ve fareyi bir kafes yerleştirin. Tam anestezi kurtarmak için izin ver ve 10-15 dakika bekleyin. </li><li> Üçüncü kez hayvan anestezisi ve ısıtma yastığı koyun. </li><li> Hayvanın bir ayağı seçin. Koyun, altın kaplama akupunktur Topuk deri altında iğne ve ayak tabanında bir diğeri. Elektrotlar yönelik ayak uzun eksenine dik ve birbirlerine paralel. </li><li> Iğneler (elektrotlar), mikro-klip konnektörleri kullanarak elektrik stimülatörü başkanı bağlayın. 1Hz 20 bakliyat, süresi / her biri 20 ms uygulayarak kasları Electroporate. Elektrotların aralık bağlı olarak, darbeleri &#39;gerilim genliği (bir osiloskop ile izleme), ~ 100 V / cm Not elektrik alan verim ayarlanır: uyaranlara yanıt yok kasılmaları dikkat edilmelidir düzeyinin ise anestezi yeterli. </li><li> İsterseniz, hayvan kontralateral ayak yukarıdaki işlemleri tekrarlayın. </li><li> Kendi kafesine hayvan dönün ve bir kez tam olarak gözlem altında sürdürmek anestezi kurtarıldı. Not: prosedürün normal giderse, hayvan, 30 dakika içinde tam hareketlilik kazanması ve daha sonra vivaryum hayvan odasına geri gönderilmek üzere hazır. Ayak pedleri hiyalüronidaz ve DNA enjeksiyonları, hayvanlar üzerinde farkedilebilir olumsuz etkileri yoktur. Bir kez anestezi kurtarıldı, fareler normalde kafes etrafında eşkin edebiliyoruz. Ek bir önlem olarak, 0,0027 mg / ml analjezik olarak 2 gün süreyle hayvan Carprofen içme suyu ekleyin. </li><li> Protein ifade transfeksiyon 2-8 gün sonra test edilmelidir. Ancak, birçok proteinlerin sürekli ifade ay boyunca görülmüştür. </li></ol> NOT: Hayvan Refahı Kanunu ve İnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım PHS Politikası tarafından zorunlu olarak tüm hayvan işlemleri UCLA Başbakanı Hayvancılık Araştırma Komitesi tarafından kabul edildi. Temsilcisi Sonuçlar: FDB ve IO kasları plazmid etkin transfeksiyon, yukarıda açıklanan in vivo elektroporasyon prosedürleri doğru bir şekilde uygulanması sonucu gerekir . Ancak, transgenik protein çeşidi ifade verimliliği plazmid bağlıdır, protein, protein, fonksiyonel özellikleri ve bizim kontrolümüzün dışındaki diğer değişkenler bir dizi boyutu ve karmaşıklığı. MCherry protein için ticari bir plazmid (PMR-mCherry) kodlama varlığı electroporated bir FDB kas için Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, bunlardan en çok kırmızı floresan ekran gerçeği ile gösterildiği gibi, kas liflerinin çoğu bizim protokol ile transfekte . Bu bireysel lifleri farklı derecelerde protein ekspresyonu sergileyen olasılığını ekarte değildir, ya da birkaç lif her 3 transfekte değildir. B olmalıdıre mCherry, EGFP, ECFP ve EYFP gibi floresan proteinleri büyük miktarda verimli bir şekilde ifade, kas lifleri eksitabilite ve eksitasyon-kasılma kaplin özellikleri zarar etmediğini kaydetti. Aslında, onlar sahte transfekte kasları (sonuçlar gösterilmemiştir) olanlardan ayırt edilemez. Iskelet kas lifleri floresan etiketli proteinlerin yerelleştirilmiş ifade doğrulamak için kullanılan pratik yaklaşımlar. Di novo ifade edilen transgenik proteinlerin hücre içi yerelleştirme rutin hücresel yapılarının iyi tanımlanmış belirteçlerin ilgili etiketleri ve görüntülerin TPLSM, floresan görüntüleri kullanarak, aynı anda satın tarafından değerlendirilir . Bu son en tipik şunlardır: a) ikinci harmonik üretimi (SHG) sarkomerik miyozin anizotropi bir bant (M hatları merkezli) 9,10 ortaya çıkan görüntü, ve b) di-8-ANEPPS floresan görüntüleri, yüzey ve enine tübüler bu laktobionat potansiyometrik dye11 kas liflerinin (T-tübül) sistemi zarı etiketleme ile elde edilebilir. Di-8-ANEPPS ile boyandı kas liflerinin floresan görüntüler, T-tübüller uzun lif eksenine floresan odaklı yaklaşık dik dar bant olarak görünür. Bu bantlar eşitsiz birbirinden aralıklı: M-hatları üzerinden yayılan uzun bir mesafe ve 11 Z-line üzerinden yayılan kısa bir bir ayrılır. İfade ve iskelet kas lifleri α-aktinin-EGFP lokalizasyonu. Α-aktinin, yapısal kas protein etiketli bir varyant ifade bir örneği Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Bu protein gibi rutin olarak bu structure12 bir işaretleyici olarak kullanılan, Z-line önemli bir bileşeni olarak bilinen ve. Biz α-aktinin EGFP ile C terminalinde etiketli insan (non-kas) plazmid pEGFPN1-α-actinin1 kodlama FDB ve IO kasları transfekte. Transfeksiyon Altı gün sonra, α-aktinin çoğunlukla lif ekseni boyunca eşit aralıklı dar bantlar ifade EGFP floresan dağıtım, değerlendirilen bulundu. Sarkomer başına tek bir grup (Şekil 2A ve 2B) görülür. Z-hatları ile bu bantları ko EGFP floresan dağıtım SHG (Şekil 2B) ve di-8-ANEPPS (Şekil 2E) görüntüleri ile karşılaştırarak gösterilmiştir. Z-hatlarının konumu ile örtüşen, birbirini takip eden iki M-bantları arasında yarı yolda bulunan olduğunu belirterek, SHG bantları ile α-aktinin EGFP bantları alternatif kaplama görüntü (Şekil 2C) ile gösterilir. Di-8-ANEPPS ile boyanmış transfekte kas lifleri, α-aktinin-EGFP bantları, T-tübüller (Şekil 2F) kanadına Z hatları (yani kısa bir mesafe ile ayrılmış) bilinen her çifti arasında merkezli görülür böylece transgenik α-aktinin, Z-line hedef olduğunu göstermektedir. DHPRα1s İfadesi EGFP N-terminalindeki etiketlenen PEGFPC1.1-DHPR α 1s kas transfeksiyon etkinliği olduğunu gösteren TPLSM görüntü (örneğin Şekil 3A) doğrulandı en lifleri ifade EGFP DHPRα1s (transmembran protein). Transfekte lifleri en belirgin özelliği, bu proteinin T-tüplerdeki hedef ise bekleneceği üzere çift bantlı desen EGFP floresans (Şekil 3A ve 3B). Aynı zamanda farklı liflerin floresan çeşitli düzeylerde görüntüler, bantlı floresan desen bireysel bir lif lif boyunca homojen korunabilir görünüyor Şekil 3&#39;te görülebilir. Yüksek büyütme (Şekil 3B), açıkça, düzensiz gruplar arasında boşluk di-8-ANEPPS (örneğin Şekil 2E) boyanmış lifleri gözlenen benzer olduğunu görülmektedir olabilir. Bindirme görüntüleri (Şekil 3B &amp; 3E) SHG bantları, bu proteinin T-tübüller olduğunu doğrulayan EGFP-DHPRα1s bantları arasında büyük bir boşluk içinde yer olduğunu göstermektedir. Ek floresan olmayan lipofilik anyon ile ölçümler FRET DPA (veriler gösterilmemiştir) EGFP benzer parçaları daha T-tübüller &#39;membranların iç broşürün birkaç nanometre içinde olduğunu göstermek. Yerelleştirme ve EYFP-ClC1 ifade fonksiyonel değerlendirme EGFP-DHPRα1s gözlenen benzer bir yapı ile iskelet kas klorür kanal (ClC1), ekran EYFP floresan bantları (Şekil 4A) EYFP etiketli inşa (N-terminal) kodlar pEYFP ClC1 ile transfekte Elyaf &#39;ifade (Şekil 3A) ve di-8-ANEPPS boyama (Şekil 2E) ile gösterildiği gibi T-tübül düzenlemeye karşılık. Beklendiği gibi, üst üste EYFP-ClC1 (Şekil 4A) ve SHG görüntüleri (Şekil 4B) kaplama (Şekil 4C) &#39;de gösterildiği gibi, SHG büyük boşluklar o bantlar merkezli olduğunu göstermekEYFP floresan bantları arasında f. EYFP ClC1 sonuçları fonksiyonel klorür kanalları aşırı ekspresyonu beklendiği gibi kas lifleri dinlenme iletkenlik önemli bir artış ifade transfekte FDB kas enzimatik ayrışmış kas lifleri ve elektrofizyolojik özellikleri okudu olmadığını değerlendirmek için deney düzeneği daha önce bir iki Mikroelektronlar kullanarak 6,11,13 tarif . Biri, standart bir floresan mikroskop küresel floresan yoğunluğu ölçümleri (gösterilmemiştir) değerlendirilen EYFP-ClC1 büyük miktarlarda ifade ve diğer olmayan bir transfekte kontrolü: Şekil 5 iki liflerinden sonuçları gösterir. Şekil 5A gerilim kayıt (EYFP ClC1 ifade kas lifi elde) aşırı dinlenme iletkenlik nedeniyle gösterir, fiber neredeyse olmayan heyecanlı. Şu uyaran bakliyat kadar 400nA (0.5ms) çok küçük bir aktif yanıt (hiçbir aşmayı, Şekil 5A) ortaya çıkarmak için kullanılan gerekiyordu. Klorür kanal blokeri 9-ACA 500 mcM içeren bir dış Tyrode çözüm değiştirilmesi sonra, 200 nA akım darbeleri (, kontrol fiber kaydedilen dışında olmasına rağmen çok daha yavaş ve daha geniş bir aksiyon potansiyeli (Şekil 5B) ortaya çıkarmak için yeterli Şekil 5C). Beklendiği gibi, bu kontrol fiber (Şekil 5D) 9-ACA Ayrıca minimal etkisi vardı. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" /> Şekil 1 in vivo elektroporasyon yöntemi Transfeksiyon verimliliği aydınlık (A) ve floresans (B) bir FDB kas görüntüleri PMR-mCherry transfekte. Elektroporasyon protokol gün sonra 12 gün. Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">buraya tıklayın</a> Şekil 1&#39;de bir büyük versiyonu için. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 İfade ve FDB lifleri α-aktinin-EGFP hedef Panelleri A ve B sırasıyla α-aktinin-EGFP ifade eden bir lif EGFP floresan ve SHG görüntüleri,. Panel C, A ve B. Paneller D ve E görüntüleri süperpozisyon, sırasıyla, di-8-ANEPPS ile α-aktinin-EGFP ve lekeli ifade başka bir lif floresan görüntüler. 6 gün: Panel F elektroporasyon protokolü sonra D ve E. günlük görüntüler süperpozisyon. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 İfade ve FDB lifleri EGFP-DHPRα1s hedef. Panel, EGFP-DHPRα1s ifade liflerinin bir grup EGFP floresan görüntü. B Paneli kare bir genişleme panelinde bir protein ifade bantlı desen daha iyi göstermek için. Panel C SHG görüntü paneli A. Panel D görüntüye karşılık gelen görüntü bindirme A ve C. Panel E elektroporasyon protokolü sonra panele D. Gün gösterilen alanında bir genişleme: 20 gün. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 İfade ve FDB lifleri EYFP-ClC1 hedef. Paneller A ve B lifleri EYFP-ClC1 ifade sırasıyla EYFP floresan ve SHG görüntüler,. 7 gün: Panel C, A ve B Paneli D elektroporasyon protokolü sonra panele C. Gün görüntü vurgulanan beyaz çizgi boyunca ölçülen bir yoğunluk profili panelleri görüntülerin süperpozisyon. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 transgenik EYFP-ClC1 Panelleri ifade Elektrofizyolojik değerlendirme lifleri A ve B sırasıyla, 9-ACA ile tedavi öncesi ve sonrası akım darbeleri yanıt EYFP-ClC1 ifade fiber gerilim kayıtları. Panelleri C ve D olmayan bir transfekte fiber akım darbeleri karşısında aksiyon potansiyelleri ortaya çıkardı gerilim kayıtları sırasıyla 9-ACA ile tedavi öncesi ve sonrası.

<ol><li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li>
<li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li>
<li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+%7Balpha%7D1s+and+%7Bbeta%7D1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li>
<li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li>
<li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins%2C+%7B%7Balpha%7D%7D-actinin-2+and+-3%2C+in+different+species%3A+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li>
</ol>

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Biz burada, in vivo elektroporasyon iskelet kas lifleri DNA plazmid etkili transfections ulaşmak için takip edilmesi gereken ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır . Yaklaşımın ana avantajı, uygulama kolaylığı ve hayvanlar için önemsiz sağlık açısından tehlike sonuçları minimal invazivlik. Gerçekte, yukarıda açıklanan elektroporasyon protokolleri anestezi altında hayvanlar tarafından iyi tolere edilen tüm elektrik stimülasyonu protokolü tarafından takip ayak başına iki subkutan enjeksiyonlar, çok daha fazla arz etme...

memeli İskelet kaslar kullanarak dna transfeksiyon in vivo elektroporasyon

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Hücre biyolojisi büyüyen bir ilgi endojen dağılımı ve fonksiyonel önemi araştırmak için gerekli proteinler (örneğin floresan etiketli yapıları ve / veya mutant türevleri) transgenically değiştirilmiş biçimlerini ifade etmek. Ilginç bir yaklaşım tamamen farklılaşmış hücrelerin bu amacı yerine getirmek için uygulamaya konmuştur.<em&gt; In vivo</em, Karaciğer gibi özel dokulara çeşitli yöntemlerle plazmid&gt; transfeksiyon<sup&gt; 1</sup&gt;, Iskelet kası<sup&gt; 2,3</sup&gt; Ve hatta beyin<sup&gt; 4</sup&gt;. Biz burada verimli lifleri genetik materyal transfect için takip edilmesi gereken adımları ayrıntılı bir açıklama mevcut<em&gt; Fleksör digitorum brevis</em&gt; (FDB) ve<em&gt; Interosseus</emBir yetişkin farelerin&gt; (IO) kaslar<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporasyon yaklaşım. Deneysel parametreleri tek fiber ifade proteinlerin nitelik ve nicelik bozabilir doku zedelenmelerinde en aza indirerek transfekte kas liflerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Biz bu yazıda anlatılan metodoloji uygulanması çözünür proteinlerin yüksek verim, yani EGFP ve ECFP sonuçları doğruladıktan<sup&gt; 3</sup&gt; Calpain, FKBP12, β2a DHPR, vb yapısal proteinleri, yani minidystrophin ve α-aktinin; ve membran proteinleri, yani α1s DHPR, RyR1, kardiyak Na / Ca<sup&gt; 2 +</supFDB, IO ve diğer kasların fare ve sıçanlarda uygulanan değiştirici, NaV1.4 Na kanal, SERCA1, vb. Bu proteinlerin bazı etkili ifade biyokimyasal ile onaylandı<sup&gt; 3</sup&gt; Ve fonksiyonel bir kanıt<sup&gt; 5</sup&gt;. Ancak, şimdiye kadar bize en sık kullanılan doğrulayıcı yaklaşım floresan etiketli protein yapıları standart floresan mikroskopi ve 2-foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM), sadece genel olarak ifade tanımlamak için izin verir, ama aynı zamanda detaylı intrasellüler localisation. (Burada görüldüğü gibi) ifade için fizyolojik ilgili proteinleri kodlayan plazmid transfect yöntemi eşit kullanılan ya da parazite RNA (siRNA) normalde ifade proteinleri (henüz test edilmedi) ifade bastırmak için amaçlayan olabilir. Bu kasların enzimatik ayrışmış liflerin altında temel uyarılabilirlik ve eksitasyon-kasılma kaplin mekanizmalarının araştırılması için şu anda en uygun modellerin biri olduğundan FDB ve IO kas liflerinin transfeksiyon memeli kas fizyolojisi soruşturma için özellikle ilgili olduğunu belirtmek gerekir akım veya gerilim kelepçe<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Biz elektroporasyon ve floresan mikroskobu kullanarak protein ekspresyonu sonraki görselleştirme kullanılarak canlı farelerin ayak kaslarının lifleri plazmid DNA verimli transfeksiyon ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.

Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

Hücre biyolojisinde artan bir ilgi alanı, temel proteinlerin transgenik olarak modifiye edilmiş formlarını (örneğin floresan işaretli yapılar ve/veya mutant...

DNA ve plazmidleri transfekte etmek ve yetişkin farelerin flexor digitorum brevis (FDB) veya interosseöz (IO) kaslarında transgenik olarak eksprese etmek için in vivo elektroporasyon yapılabilir. İşlem, farenin anestezi altına alınmasıyla başlar. Bir ayağın plantar yüzeyi, iğnenin topuktan yerleştirilip ayak boyunca deri altına yönlendirilmesiyle hyaluronidazın ilk enjeksiyonu için hazırlanır.Bir saat sonra hayvan tekrar anesteziye alınır ve plazma, hiyaluronidazın enjekte edildiği ayağın aynı deri altı bölgesine enjekte edilir. 10 dakika sonra, altın kaplama akupunktur iğneleri gösterildiği gibi deri altına yerleştirilir. Gerekliyse, iğneler stimülatöre bağlandıktan sonra elektroporasyon darbeleri uygulanır.İşlem karşıt ayakta tekrarlanabilir. İki ila sekiz gün süren bir dönemin ardından hayvan sakrifiye edilir, kaslar diseke edilir ve hedeflenen proteinin transfeksiyonu mikroskop altında floresans gözlemlenerek doğrulanır. Merhaba, ben UCLA Davy Geffen Tıp Fakültesi Fizyoloji Bölümü'ndeki Julio Vera laboratuvarından Marino DeFranco.Bugün sizlere, transgenik protein eksprese eden plazmitlerin yetişkin farelerin kas liflerine Inbivo transfeksiyonu için uygulanan prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, transgenik protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunun yanı sıra, protein aşırı ekspresyonunun kas lifi fizyolojisi üzerindeki etkisini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.In vivo elektroporasyon protokollerine başlamadan önce, memeli ekspresyon plazmidleri, mikrolitre başına iki ila beş mikrogram plazmid içeren TE tamponu konsantrasyonları elde edilecek şekilde amplifiye edilmelidir. Rutin olarak Qiagen amplifikasyon kitlerini kullanıyoruz ve üreticinin talimatlarını takip ediyoruz. CMV promotörünü taşıyan ticari ekspresyon plazmidlerini, örneğin Invitrogen'den EEG FPC one veya EEG FPN one'ı öneriyoruz.Bu promotör iskelet kasında çok etkili çalıştığı için, in vivo transversiyon prosedürünü göstereceğiz. P EEG FPN kullanarak, steril tyro içerisinde mililitre başına iki miligram hyaluronidase içeren bir çözeltiyi önceden hazırladık. Bu çözelti, hayvanlar hazırlanana kadar oda sıcaklığında muhafaza edilir.Transfeksiyon için, onaylanmış bir gaz anestezik cihazına bağlı bir anestezi kutusu kullanırız ve hayvanı oksijen içindeki %4 ISO fluran ile derin anesteziye alırız. Anestezi sağlandıktan sonra, sonraki anestezi prosedürleri sırasında farenin gözlerini kurumaya karşı korumak için pomad uygularız. Hayvanı 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma pedine yerleştiririz ve anesteziyi bir yüz maskesi kullanarak sürdürürüz.Ayak parmak sıkıştırma refleksini kontrol ederek anestezi derinliğini izleyin. Hayvan derin anestezi altına girdiğinde, diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyerek, 33 gauge steril bir iğne ile farenin bir ayağının ayak yastığı altına 10 µL yüksek UR solüsyonu enjekte edin; iğneyi ayağın topuğuna yakın bir noktadan cilde batırın ve iğneyi deri altından parmak diplerine doğru ilerletin.Cildin aşırı şişmesini önlemek için solüsyonu yaklaşık bir çeyrek inç boyunca yavaşça enjekte edin. İşlemi diğer ayakta tekrarlayın. Arzu edildiğinde, enjekte edilen enzim, hiyalüronik asidi hidrolize ederek kas liflerini çevreleyen bağ dokusunu yaklaşık bir saatlik bir süre içinde yumuşatacaktır.Bu işlem, daha sonra lifler arasındaki interstisyel boşluğa enjekte edilecek olan DNA plazmidinin difüzyonunu kolaylaştıracaktır. Hyaluronidaz enjeksiyonundan sonra, anesteziyi kesin ve fareyi kafesine yerleştirin. Hayvan, üç ila dört dakika içinde anesteziden çıkacaktır.Bir saat sonra, hayvanı ikinci kez anestezi altına alın. 10 µL plazmid çözeltisi alın ve temiz, küçük bir whey boat'ın arkasına bir damla damlatın. Damlayı enjeksiyon şırıngasıyla çekin ve ayak tabanına enjekte edin.Daha büyük proteinler için hyaluronidase solüsyonu için açıklanan prosedürün aynısı takip edilerek, daha fazla miktarda plazma enjekte edilebilir. 15 µL'den fazlası gerektiğinde, 20 µL'den fazla enjekte etmemenizi öneririz. DNA'nın delik noktasından sızma riskini önlemek için iğne giriş noktasındaki cildi kapatmak amacıyla doku yapıştırıcısı kullanmanızı öneririz.Anesteziyi kesin ve fareyi bir kafese yerleştirin. Anesteziden tamamen ayılmasını bekleyin ve elektroporasyona hazırlanmak için 10 ila 15 dakika bekleyin. Hayvanı daha önce yapıldığı gibi anestezi altına alın.Hayvanın bir ayağını seçin; topuğun altına deri altına bir adet altın kaplama akupunktur iğnesi veya elektrodu, parmak diplerine ise ikinciyi yerleştirin. İğneler birbirine paralel ve ayağın uzun eksenine dik olarak konumlandırılır. Akupunktur iğneleri 160 micrometers çapında ve 13 millimeters uzunluğundadır.Bunlar tekli paketlenmiş ve steril olarak satılmaktadır. İğne aralığına bağlı olarak, voltaj darbeleri iletmek için darbe genliğini ayarlayın. Santimetre başına yaklaşık 100 voltluk bir elektrik alanı oluşturun.Darbe süresini 20 milisaniyeye ve frekansı bir hertz'e ayarlayın. Elektrotların baş kısmını mikro klips konnektörler kullanarak elektrik stimülatörüne bağlayın. 20 elektrik darbesi uygulayarak ayak kaslarını uyarın.Voltaj dalga formunu osiloskop üzerinden izleyin. Stimülasyonlara yanıt olarak belirgin bir kontraksiyon gözlenmemektedir. Eğer anestezi seviyesi yeterliyse, arzu edilen durumda anestezi altındayken devam edin.Yukarıdaki elektroporasyon prosedürünü diğer ayakta tekrarlayın; elektroporasyon sonrası hayvanı kafesine geri koyun ve gözlem altında tutun. Anesteziden tamamen çıkana kadar, hayvanın beş dakika içinde hareket kabiliyetini tamamen geri kazanması gerekir. Herhangi bir advers reaksiyon görülmediyse ve prosedür normal şekilde ilerlediyse, ek bir önlem olarak hayvanın içme suyuna iki gün boyunca 0,027 mg/mL konsantrasyonda karfin ekleyin.Analjezik protein ekspresyonu, transfeksiyondan iki ila sekiz gün sonra analiz edilebilir. Bununla birlikte, birçok proteinin ekspresyonunun aylar boyunca sürdüğü gözlemlenmiştir. EGFP proteinini kodlayan ticari plazmid P EEG FPN bir ile elektropore edilmiş bir FDB kasının transfeksiyon verimliliği, el tipi bir UV lamba veya yüksek yoğunluklu UV diyotlarından gelen UV ışığı ile kolayca görselleştirilebilir.Fare ayağı diseksiyon mikroskobu altında incelendiğinde, çoğunun yeşil floresan göstermesiyle kanıtlandığı üzere, kas liflerinin çoğunun protokolümüzle transfekte edildiği gözlemlenebilir. Diseksiyon mikroskobu, kasın genel transkeksiyon paternini göstermektedir. Bu gözlem tekrarlanmaktadır.Epi floresan mikroskobu kullanılması, kas lifi demetlerindeki veya tekil liflerdeki EGFP ekspresyon paterninin görselleştirilmesine olanak tanır. FDB kas liflerindeki mCherry protein ekspresyonunun verimliliği, kasın parlak alan ve floresan görüntülerinin karşılaştırılmasıyla değerlendirilebilir. De novo eksprese edilen transgenik proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, bu amaçla iki foton lazer tarama mikroskopisi kullanılarak değerlendirilebilir.Floresan işaretli proteinlerin görüntüleri ve hücresel yapıların iyi tanımlanmış belirteçlerinin görüntüleri eş zamanlı olarak alınır. Hücresel yapı belirteçlerinin en tipikleri, sarkomerik A bantlarının M hatları merkezli miyozin anizotropisinden kaynaklanan ikinci harmonik üretimi veya SHG görüntüleridir.Kas liflerinin yüzey ve enine tübüler veya t tübül sistemi membranlarının empirian potentia metric boyası ile işaretlenmesiyle elde edilen annex floresan görüntüleri, boya sekiz anep ile boyanmış kas liflerinin floresan görüntülerinde görülmektedir. T tübülleri, lifin uzun eksenine yaklaşık olarak dik yönlenmiş dar floresan bantlar şeklinde görünür. Bu bantlar birbirlerinden eşit olmayan aralıklarla yerleşmişlerdir.Bunlar, M çizgileri boyunca uzanan uzun bir mesafe ve Z çizgisi boyunca uzanan kısa bir mesafe ile birbirinden ayrılırlar. Yapısal kas proteini alfa aktininin etiketli bir varyantının ekspresyonuna bir örnek burada gösterilmiştir. Bu protein, Z çizgisinin ana bileşenidir ve rutin olarak bu yapının bir belirteci olarak kullanılır.Transfeksiyondan altı gün sonra, FDB ve IO kaslarını C terminusu EGFP ile etiketlenmiş insan kas dışı alfa aktininini kodlayan P-E-G-F-P Fpn one alpha actinin plazmidi ile transfekte ettik. Alfa aktininin çoğunlukla fiber ekseni boyunca eşit aralıklı dar bantlarda eksprese olduğunu saptadık. Sarkomer başına tek bir bant görülmektedir.Bu bantların Z çizgileriyle kolokalizasyonu, üst üste bindirme görüntüsünde gösterildiği üzere EGFP floresansının dağılımının SHG veya D sekiz annex görüntüleriyle karşılaştırılmasıyla kanıtlanmıştır. Alfa Aktin ve EGFP bantlarının SHG bantlarıyla dönüşümlü olarak yer alması, bunların ardışık iki M bandının ortasında, d an up Alpha Actinin ile boyanmış transfekte kas liflerindeki Z çizgilerinin konumuyla örtüşen bölgede bulunduklarını göstermektedir. EGFP bantlarının, Z çizgilerini çevrelediği bilinen her T tübülü çiftinin merkezinde görüldüğü tespit edilmiştir. Bu durum, transgenik alfa aktininin Z çizgisine hedeflendiğini göstermektedir.N terminal EGFP etiketli DHPR alfa bir s'nin ekspresyonu ve hedeflemesi şekil üçte gösterilmiştir. EGFP floresansı, çoğunlukla T2ES ile benzer bir düzende aralıklı bant çiftleri şeklinde görülür. SHG ve EGFP-DHPR Alfa bir s görüntülerinin üst üste bindirilmesi, her iki ardışık SHG bandı arasında iki EGFP floresan bandı olduğunu göstermektedir; bu durum, DHPR alfa bir s'nin T2ES D8 ve abstaining (gösterilmemiştir) ile doğru şekilde hedeflendiğini kanıtlamaktadır. İskelet kası klorür kanalı CLC bir'in C terminusinde EYFP etiketli bir konstrükt kodlayan PEYFP CLC bir ile transfekte edilen liflerin tübül hedeflemesi, D8 ve abstaining ile örneklendiği gibi T tübül düzenine karşılık gelen EYFP floresan aralıkları sergilemektedir.Beklendiği gibidir. Üst üste bindirme görüntüsünde gösterildiği üzere, EYFP CLC one ve SG görüntülerinin süperpozisyonu, SHG bantlarının EYFP floresans bantları arasındaki geniş boşluğa merkezlendiğini göstermektedir. EYFP CLC one ekspresyonunun, fonksiyonel klorür kanallarının aşırı ekspresyonundan beklendiği gibi kas liflerinin dinlenme iletkenliğinde anlamlı bir artışa yol açıp açmadığını değerlendirmek için, TRANSFekte edilmiş FDB kasından kas liflerini enzimatik olarak ayrıştırdık ve iki mikroelektrotlu bir deneysel düzenek kullanarak bunların elektrofizyolojik özelliklerini inceledik.Bu görüntü, iki fiberden elde edilen sonuçları göstermektedir. Bunlardan biri yüksek miktarda EYFP clc eksprese etmektedir; bu fiber, standart bir floresan mikroskobunda küresel floresan yoğunluğu ölçümleriyle değerlendirilmiştir. Diğeri ise transfekte edilmemiş bir kontroldür.Voltaj kaydı, EY FP CLC one eksprese eden kas lifinden elde edilmiştir. Kontrol lifini uyarmak için gerekenden daha büyük bir akım darbesi, harici tyro solüsyonu 500 micromolar klorür kanalı bloker olan nine Racine carboxylic acid veya nine A CA içeren bir solüsyonla değiştirildiğinde, transfekte lifte yalnızca küçük bir rejeneratif yanıt oluşturur. Daha küçük bir darbe, beklendiği üzere kontrol lifinde kaydedilenlere göre çok daha yavaş ve geniş olsa da, bir aksiyon potansiyeli oluşturmuştur.Dokuz a CA eklenmesinin kontrol fiberi üzerinde minimal etkileri olmuştur. EY FP CLC one ekspres eden fiberin, aşırı dinlenme klorür iletkenliği nedeniyle neredeyse hiç uyarılabilir olmadığı sonucuna vardık. Elektroporasyon kullanarak canlı iskelet kası fiberine transgenik protein eksprese eden plazmidin nasıl transfekte edileceğini ve ayrıca transfeksiyon verimliliğinin, transfekte edilen proteinlerin lokalizasyonunun ve fonksiyonunun nasıl değerlendirileceğini göstermiş olduk.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme

Ön kompartman kasları nöromüsküler elektriksel stimülasyon bir fare modeli (NMES), güvenli ve ucuz bir klinik yöntem, anlatılmıştır. Bu modelde, farelerde ve spesifik hedef kas kontraksiyonlarının ortaya çıkarmak amacıyla, kolayca bulunabilen bir klinik cihazı değiştirerek bir avantaja sahiptir.

Nöromüsküler Elektriksel Stimülasyon tarafından Kas Eğitimi A Mürin Modeli

Miyoblast ekiminin başarısını değerlendirmek için bir non-invaziv yollarla açıklanmıştır. Yöntemi olan ifade farklı görüntüleme yöntemleri ile görüntülenebilir genlerin oluşan birleşik bir füzyon muhabiri gen yararlanır. Burada, bir...

Nakledilen Muscle Progenitör Hücreler Hedefleyecek Moleküler Görüntüleme

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Bu protokol, fare kas liflerinde floresan olarak işaretlenmiş proteinleri tanıtmak ve eksprese etmek için elektroporasyonu kullanır. Elektroporasyondan sonra geri kazanımın ardından lifler izole edilir. Tek tek lifler daha sonra kas yapısını görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Burada, kemirgen siyatik sinirindeki Schwann hücrelerine (SC'ler) gen transferi için in vivo bir teknik sunuyoruz. Bu basit teknik, miyelinizan SK'lerin geliştirilmesi ve sürdürülmesinde yer alan sinyalleme mekanizmalarını araştırmak için kullanışlıdır.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Plazmid DNA'sının iskelet kasına elektroporasyonu, farelerde kas kontraktilitesinden ödün vermeden gen ekspresyonunu modüle etmek için uygun bir yöntemdir.

Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

Bu protokol, fare yumurtalık kanalında bölgesel olarak kısıtlanmış CRISPR aracılı genom düzenlemesi için mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyonu tanımlar.

In Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Kullanan Somatik Genom Mühendisliği Fare Modelleri

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca2 + kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Burada, kraniyal levator auris longus (LAL) kasının in vivo elektroporasyonu ve denervasyonunu birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu prosedür, kas kaynaklı proteinlerin nöromüsküler sinapsın rejenerasyonundaki potansiyel rolünün incelenmesini sağlar.

Kranial Levator Auris Longus İskelet Kasının Kombine İn Vivo Elektroporasyonu ve Kısa Süreli Reinnervasyonu

Öğrenin, canlı farelerde in vivo elektroporasyon ile plazmid DNA transfeksiyonunu. Bu yöntem, iskelet kaslarında gen ifadesini görselleştirmek ve gen tedavisi çalışmalarını ilerletmek için kullanılır.

Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

Daha fazla video keşfet