Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

Biz elektroporasyon ve floresan mikroskobu kullanarak protein ekspresyonu sonraki görselleştirme kullanılarak canlı farelerin ayak kaslarının lifleri plazmid DNA verimli transfeksiyon ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.

Elektroporasyon, yetişkin fare fleksör digitorum brevis veya FDB ve interosseöz veya IO kaslarında transfekt, DNA, plazmitleri transfekte etmek ve transgenik olarak eksprese etmek için in vivo olarak yapılabilir. Prosedür farenin uyuşturulmasıyla başlar. Bir ayağın plantar yüzeyi, iğnenin topuktan sokulması ve ayak boyunca deri altından yönlendirilmesiyle ilk hyaluronidaz enjeksiyonu için hazırlanır.

Bir saat sonra, hayvan yeniden uyuşturulur ve plazma, hyaluronidazın enjekte edildiği ayağın aynı deri altı bölgesine enjekte edilir. 10 dakika sonra altın kaplama akupunktur iğneleri gösterildiği gibi cilt altına yerleştirilir. Elektroporasyon darbeleri, gerekirse iğneler stimülatöre bağlandıktan sonra verilir.

İşlem karşı ayakta tekrarlanabilir. İki ila sekiz gün arasında değişen bir süre sonra, hayvan sakrifiye edilir, kaslar diseke edilir ve istenen proteinin transfeksiyonu, floresan mikroskop altında gözlemlenerek doğrulanır. Merhaba, ben UCLA Davy Geffen Tıp Fakültesi Fizyoloji Bölümü'nde Julio Vera'nın laboratuvarından Marino DeFranco.

Bugün size plazmidi eksprese eden transgenik proteinin yetişkin farelerin kas liflerine Inbivo transfeksiyonu için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü transgenik protein ekspresyonu ve lokalizasyonunun yanı sıra proteinin kas lifi fizyolojisindeki ekspresyon üzerindeki etkisini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

İn vivo elektroporasyon protokollerine başlamadan önce, memeli ekspresyon plazmitleri, mikrolitre TE tamponu başına iki ila beş mikrogram plazmit aralığında konsantrasyonlar verecek şekilde amplifiye edilmelidir. Rutin olarak Qiagen amplifikasyon kitlerini kullanıyoruz ve üreticilerin ve üreticinin talimatlarını takip ediyoruz. CMV promotörünü taşıyan ticari ekspresyon plazmitlerini, örneğin in Vitrogen'den EEG FPC one veya EEG FPN one öneriyoruz.

Bu promotör iskelet kasında çok iyi çalıştığından, in vivo transeksiyonlar, prosedürü göstereceğiz. P EEG FPN one kullanarak, steril tiro içinde mililitre hyaluronidaz başına iki miligram içeren bir çözelti hazırladık. Bu çözelti, hayvanları hazırlamak için kullanılana kadar oda sıcaklığında tutulur.

Transfeksiyon için, onaylı bir gaz anestezik makinesine bağlı bir anestezi kutusu kullanıyoruz ve hayvanı oksijende% 4 ISO flor ile derinlemesine uyuşturuyoruz. Anestezi uygulandıktan sonra, aşağıdaki anestezi prosedürleri sırasında farenin gözlerini kuruluktan korumak için merhem sürüyoruz. Hayvanı 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığına yerleştirin ve odent yüz maskesi kullanarak anesteziyi koruyun.

Ayak parmağını sıkıştırma refleksini kontrol ederek anestezik derinliği izleyin. Hayvan derin anestezi uygulandığında. Bir inç uzunluğunda 33 gauge steril iğne kullanarak farenin bir ayağının ayak pedinin derisinin altına 10 mikrolitre yüksek UR solüsyonu enjekte edin, diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin, ayağın topuğuna yakın bir noktada cilde nüfuz edin ve iğneyi deri altından ayak parmaklarının tabanına doğru ilerletin.

Yaklaşık çeyrek inç boyunca, cildin çok fazla şişmesini önlemek için solüsyonu nazikçe enjekte edin. İşlemi diğer ayağınızla tekrarlayın. İstenirse, enjekte edilen enzim yaklaşık bir saatlik bir süre içinde yumuşar, kas liflerini çevreleyen bağ dokusu hyaluronik asidi hidrolize eder.

Bu, daha sonra lifler arasındaki interstisyel boşluğa enjekte edilecek olan DNA plazmidinin difüzyonunu kolaylaştıracaktır. Hyaluronidaz enjeksiyonundan sonra, anesteziyi kesin ve fareyi bir kafese yerleştirin. Hayvan anesteziden üç ila dört dakika içinde iyileşir.

Bir saat sonra, hayvanı ikinci kez uyuşturun. 10 mikrolitre plazmid çözeltisi toplayın ve temiz, küçük bir peynir altı suyu teknesinin arkasına bir damla koyun. Damlayı enjeksiyon şırıngası ile alın ve ayak pedine enjekte edin.

Daha büyük proteinler için hyaluronidaz çözeltisi için tarif edilen aynı prosedürü takiben, daha büyük miktarlarda plazma enjekte edilebilir. 15 mikrolitreden fazla gerekli olduğunda 20 mikrolitreden fazla enjekte etmemenizi öneririz. Delinme noktasından herhangi bir DNA sızıntısı riskini önlemek için cildi iğne giriş noktasında kapatmak için doku yapıştırıcısı kullanmanızı öneririz.

Anesteziyi ayırın ve fareyi bir kafese yerleştirin. Anesteziden tamamen iyileşmesine izin verin ve elektroporasyona hazırlanmak için 10 ila 15 dakika bekleyin. Hayvanı daha önce yapıldığı gibi uyuşturun.

Hayvanın bir ayağını seçin, bir altın kaplama akupunktur iğnesi veya elektrodu topuktaki derinin altına, ikincisini ise ayak parmaklarının tabanına yerleştirin. İğneler birbirine paralel ve ayağın uzun eksenine dik olarak yönlendirilir. Akupunktur iğneleri 160 mikrometre çapında ve 13 milimetre uzunluğundadır.

Tek tek sarılmış ve steril olarak satılırlar. İğne aralığına bağlı olarak, voltaj darbeleri vermek için darbe genliğini ayarlayın. Santimetre başına yaklaşık 100 voltluk bir elektrik alanı üretmek.

Darbe süresini 20 milisaniyeye ve frekansı bir hertz'e ayarlayın. Mikro klips konektörleri kullanarak elektrotların kafasını elektrik stimülatörüne bağlayın. 20 elektrik darbesi uygulayarak ayak kaslarını yedim.

Osiloskop içindeki voltaj dalga biçimini izleyin. Uyaranlara yanıt olarak büyük kasılmalar gözlenmez. Anestezi seviyesi yeterliyse, istenirse hala anestezi altındayken.

Elektroporasyondan sonra yukarıdaki elektroporasyon işlemini diğer ayağınızda tekrarlayın, hayvanı kafesine geri koyun ve gözlem altında tutun. Anesteziden tamamen iyileşene kadar, hayvan beş dakika içinde tam hareketlilik kazanmalıdır. Herhangi bir advers reaksiyon olmadıysa ve prosedür normal bir önlem olarak normal şekilde gittiyse, iki gün boyunca hayvan carfininin içme suyuna mililitre başına 0.027 miligram ekleyin.

Analjezik bir protein ekspresyonu olarak, transfeksiyondan iki ila sekiz gün sonra test edilebilir. Bununla birlikte, birçok proteinin sürekli ekspresyonu aylarca gözlemlenmiştir. EGFP proteinini kodlayan bir ticari plazmid P EEG FPN ile elektroporasyonlu bir FDB kasının transfeksiyonunun verimliliği, elde taşınan bir UV lambasından veya yüksek yoğunluklu UV diyotlarından gelen UV ışığı ile kolayca görselleştirilebilir.

Farenin ayağını diseksiyon mikroskobu altında incelediğimizde, kas liflerinin çoğunun, çoğunun yeşil floresan göstermesi gerçeğiyle gösterildiği gibi, protokolümüzle transfekte edildiği gözlemlenebilir. Diseksiyon mikroskobu, kasın genel transfeksiyon paternini gösterir. Bu gözlemi tekrarlıyorum.

Bir epi floresan mikroskobu kullanmak, EGFP ekspresyon modelinin kas lifi demetlerinde veya hatta tek tek liflerde görselleştirilmesine izin verir. FDB kas liflerindeki mCherry proteininin ekspresyonunun etkinliği, kasın parlak alan ve floresan görüntüleri karşılaştırılarak değerlendirilebilir. De novo eksprese edilen transgenik proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, bu amaçla iki foton lazer tarama mikroskobu kullanılarak değerlendirilebilir.

Floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin görüntüleri ve hücresel yapıların iyi tanımlanmış belirteçlerinin görüntüleri aynı anda elde edilir. Hücresel yapısal belirteçlerin en tipik olanı, sarkomeriğin miyozin anes atropisinden kaynaklanan ikinci harmonik nesil veya SHG görüntüleridir. M çizgileri ve boyada ortalanmış bir bant.

Kas liflerinin yüzey ve enine tübüler veya t tübül sistem zarlarının imperian potentia metrik boyası ile işaretlenmesiyle elde edilebilen ek floresan görüntüleri, sekiz anep boyası ile boyanmış kas liflerinin floresan görüntülerinde yer almaktadır. T tübülleri, elyafın uzun eksenine yaklaşık olarak ortogonal olarak yönlendirilmiş dar floresan bantları olarak görünür. Bu bantlar birbirinden eşit olmayan bir şekilde yerleştirilmiştir.

M çizgileri boyunca uzanan uzun bir mesafe ve Z çizgisi boyunca uzanan kısa bir mesafe ile ayrılırlar. Yapısal kas proteini alfa aktinin'in etiketli bir varyantının ekspresyonunun bir örneği burada gösterilmiştir. Bu protein, Z çizgisinin önemli bir bileşenidir ve rutin olarak bu yapının bir belirteci olarak kullanılır.

Transfeksiyondan altı gün sonra EGFP ile C terminalinde etiketlenmiş insan kas dışı alfa aktinin için bir kodlayan plazmid P-E-G-F-P Fpn ile FDB ve IO kaslarını transfekte ettik. Alfa aktinin'in çoğunlukla lif ekseni boyunca eşit aralıklarla yerleştirilmiş dar bantlarda ifade edildiğini bulduk. Sarkomer başına tek bir bant görülür.

Bu bantların Z çizgileri ile kolokalizasyonu, EGFP floresan dağılımının, bindirme görüntüsünde gösterildiği gibi SHG veya D sekiz ek görüntüleri ile karşılaştırılmasıyla kanıtlanır. Alfa Akton ve EGFP bantları, SHG bantları ile dönüşümlü olarak, d ve yukarı ile boyanmış transfekte kas liflerindeki Z çizgilerinin konumu ile çakışan iki ardışık M bandı arasında yer aldıklarını gösterir Alfa Aktinin EGFP bantları, Z çizgilerini çevrelediği bilinen her T tübülü çifti arasında ortalanmış olarak görülür. Bu, transgenik alfa aktinin'in Z çizgisini hedef aldığını gösterir.

DHPR alpha one s etiketli N terminali EGFP'nin ifadesi ve hedeflemesi şekil üç'te gösterilmiştir. EGFP'yi seçin. Floresan çoğunlukla T iki Es'inkine benzer bir desenle aralıklı bant çiftleri olarak görülür.Süper heybetli SHG ve E-G-F-P-D-H-P-R Alpha one s görüntüleri, her iki ardışık SHG bandı arasında iki EGFP floresan bandı olduğunu gösterir, bu da DHPR alfa bir s'nin T iki ES D sekizine doğru bir şekilde hedeflendiğini ve çekimser kaldığını düşündürür, gösterilmemiş, sonunda EYFP etiketli bir yapıyı kodlayan P-E-Y-F-P CLC one ile transfekte edilmiş DHPR Alpha one St.Tubule hedefleme fiberlerinin kesin bir kanıtını sağlar. İskelet kası klorür kanalının terminali CLC one, EYFP floresan açıklıklarını gösterir ve D sekiz ile gösterildiği gibi T tübül düzenlemesine karşılık gelir ve çekimser kalır.

Beklendiği gibi. Kaplamada gösterildiği gibi EYFP CLC one ve SG görüntülerinin süper montajı, SHG bantlarının EYFP floresan bantları arasındaki geniş aralıkta ortalandığını gösterir. EY FP CLC one ekspresyonunun, fonksiyonel klorür kanallarının aşırı ekspresyonundan beklendiği gibi kas liflerinin dinlenme iletkenliğinde önemli bir artışa yol açıp açmadığını değerlendirmek için, kas liflerini TRANSFECTED FDB kasından enzimatik olarak ayırdık ve iki mikro elektrot deney düzeneği kullanarak elektrofizyolojik özelliklerini inceledik.

Bu görüntü iki fiberden elde edilen sonuçları göstermektedir. Biri büyük miktarlarda EYFP clc'yi ifade eder. Biri standart bir floresan mikroskobunda küresel floresan yoğunluğu ölçümlerinden değerlendirilmiştir ve diğeri transfekte edilmemiş bir kontroldür.

Voltaj kaydı, EY FP CLC one'ı eksprese eden kas lifinden elde edildi. Bir kontrolü uyarmak için gerekenden daha büyük bir akım darbesi. Fiber, dış tyro çözeltisi, 500 mikromolar klorür kanal blokeri, dokuz Racine karboksilik asit veya dokuz A CA içeren bir çözelti ile değiştirildiğinde, transfekte edilmiş fiberde yalnızca küçük bir rejeneratif tepki ortaya çıkarır. Daha küçük bir darbe, beklendiği gibi kontrol lifinde kaydedilenlerden çok daha yavaş ve daha geniş olmasına rağmen, eylemsizlik potansiyelini ortaya çıkardı.

Dokuz a CA'nın eklenmesi, kontrol lifi üzerinde minimum etkiye sahipti. EY FP CLC birini ifade eden elyafın, aşırı dinlenme klorür iletkenliği nedeniyle neredeyse uyarılmaz olduğu sonucuna vardık. Plazmidi eksprese eden transgenik proteinin elektroporasyon kullanılarak canlı iskelet kası lifine nasıl transfekte edileceğini ve ayrıca transfekte edilen proteinlerin transfeksiyon verimliliğini ve lokalizasyonunu ve işlevini nasıl değerlendireceğinizi gösterdik.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.