Hayvan Serum Ücretsiz İnsan Kök Hücre Kültürleri Verimli Ek olarak Pooled İnsan Trombosit Lizat (pHPL) hazırlanması
30 Ekim 2009
İnsan trombosit lizat, büyüme faktörleri ve hücre kültüründe güçlü bir ek zengin bir kaynak. Bu protokol, zengin plazma, trombosit başlayarak, çeşitli donma-çözülme döngüsünden performans ve trombosit parçaları tüketen insan trombosit lizat büyük bir havuz hazırlama süreci sunar.
Bu protokol, trombosit bakımından zengin plazmadan başlayarak geniş bir insan trombosit lizatı havuzunun hazırlanma sürecini sunmaktadır. Bir dondurma-çözme döngüsü uygulanarak trombositler liz edilir. Ardından, en az 10 ünite insan trombosit lizatı, tek bir havuzlanmış insan trombosit lizatı veya PHPL grubunda toplanır.
Yaklaşık üç litrelik bu hacim, trombosit fragmanlarını tüketmek amacıyla daha küçük porsiyonlara (alikotlara) ayrılarak tekrar dondurulur. Bu alikotlar çözülür, viallere aktarılır ve santrifüj edilir. Süpernatan, hücre kültürlerini desteklemek için kullanılan trombosit kaynaklı büyüme faktörlerini içeren, trombosit fragmanlarından arındırılmış PHPL'dir.
Geriye kalan trombosit fragmanı peleti atılır. Merhaba, ben Grads Tıp Üniversitesi kök hücre araştırma birimindeki Dr. TRO laboratuvarından Kadina Sharmo. Bugün size insan trombosit izolat havuzunun hazırlanmasına yönelik bir prosedür göstereceğiz.
Platelet rich plasma ile başlayacağız, birkaç dondurma-çözme döngüsü uygulayacağız ve ardından trombosit fragmanlarını uzaklaştıracağız. Laboratuvarımızda bu prosedürü, fetal sığır serumuna alternatif olarak hücre kültürleri için yeterli bir takviye elde etmek amacıyla kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.
Bu protokol, PRP olarak adlandırılan trombosit zengin plazma ile başlar. Bu plazma, sitaferez ile hazırlanmış olabilir veya buffy coat tabakasından türetilmiş olabilir. Transfüzyon tıbbı alanı dışındaki kişilerin, PRP'yi yerel bir kan bankasından veya yetkili başka bir sağlayıcıdan temin etmeleri önerilir.
Her bir üniteden 20 mililitreyi bağlı küçük bir torbaya aktarıp torbayı kaynak cihazı ile ayırarak PRP ünitesinin sterilitesini kontrol edin. Bu alikot, hazırlama işleminin hemen ardından sterilit testi için bir mikrobiyoloji laboratuvarına gönderilebilir. PRP ünitelerinin orijinal saklama torbası içerisinde en az -20 °C'de dondurulması önemlidir.
Bakteriyel testler negatif sonuçlandıktan sonra bir sonraki adıma geçilebilir. Artık HPL olarak adlandırılan insan trombosit lizatının aşırı ısınmamasına dikkat ederek, buz pıhtıları kaybolana kadar HPL ünitelerini 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Her trombosit lizatı havuzu için standartlaştırılmış bir ürün hazırlamak amacıyla, bu dondurma-çözme adımından sonra trombositler liz edilmelidir.
Çözülmüş 10 ila 15 PRP ünitesi toplayın. Sırayla her bir HPL torbasını havuzlama çift torbasına bağlayın ve ardından HPL'yi bu iki torbaya aktarın. Boş HPL torbalarını kaynak cihazı kullanarak ayırın.
İki torbanın içeriğini karıştırarak toplam üç ila dört litre hacminde havuzlanmış insan trombosit lizatı elde edin. Bu karışıma bundan sonra PHPL denilecektir. Küçük bir torba bağlayın ve havuzlanmış ürünün sterilitesini kontrol etmek için 20 milliliter PHPL örneği alın.
Havuzlama çift torbasına küçük torbalar bağlayarak, daha sonraki işlemler için PHPL örneklerini alikotlayın. Küçük saklama torbalarına yaklaşık 250 mililitre hacminde transfer yapın ve ardından doldurulan torbaları kaynak cihazı kullanarak ayırın. Şimdi, trombosit fragmantasyon hızını ve salınan büyüme faktörlerinin miktarını artırmak için ek bir dondurma-çözme döngüsü gerçekleştirin.
Bunu, porsiyonlanmış PHBL içeren küçük torbaları -20 °C'de dondurarak yapın. Ardından torbaları, laminar akışlı kabin içerisinde, 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün.
Steril makas kullanarak her bir torbanın tüpünü kesin ve açın, ardından PHPL'yi 50 mililitrelik flakonlara boşaltın. Trombosit fragmanları genellikle trombositleri agregasyona uğratma eğilimindedir ve alloimmünizasyonu da tetikleyebilir. Bu durumları önlemek için, soğutmalı bir santrifüjde 4.000 GS hızında 15 dakika boyunca santrifüj ederek fragmanları PHPL'den ayırın.
Ardından, hücre kültürü dondurucularında fragmanların oluşmasını önlemek için plazma süpernatantını nihai saklama tüplerine pipetleyin ve trombosit pelletlerini atın. PHPL'yi tekrar 50 mL'lik alikotlar halinde, daha sonra kullanılana kadar -20 °C'de saklayın. Trombosit fragmanı azaltılmış PHPL oluşturulduğuna göre, lizat özellikleri analiz edilebilir.
Havuzlanmış trombosit lizatının işlevi ve kalitesi hücre kültürlerinde test edilmiş ve trombosit fragmanlarından arındırılmış PHPL kullanılarak hücre proliferasyonunun etkin stimülasyonu, mezenkimal stromal hücrelerin veya MSC'lerin ve endotelyal koloni oluşturucu hücrelerin, E CFC'lerin çoğaltılmasının başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Besiyeri tarifleri için lütfen buradaki yazılı protokolümüze bakınız. Havuzlanmış insan trombosit lizatı için iki uygulama.
Mezenkimal stromal hücre kültüründe, donör birden alınan ve ya PHPL ile ya da trombosit fragmanlarından arındırılmış PHPL ile kültüre edilmiş MSC'ler gösterilmektedir. Belirtildiği üzere, fragmanlardan arındırılmış PHPL ile karşılaştırıldığında burada daha fazla fragman kontaminasyonu görülmektedir. Trombosit fragmanları MSC büyümesini yeterince desteklemez.
Her üç görüntü de 13 günlük kültürden sonra alınmıştır. İkinci donörden alınan MSC'ler, trombosit açısından zengin plazma yerine, dokuz gün boyunca trombosit fragmanlarından arındırılmış PHPL içerisinde kültüre edilmiştir. Trombosit lizisi yapılmamış PRP'nin, MSC büyümesini yeterince desteklemediğine dikkat ediniz.
Ayrıca, insan göbek kordonu kanı türevli MSC'lerin izolasyonu ve kültürü için fragmanlardan arındırılmış PHPL kullanımını açıklayan Andreas Reish tarafından hazırlanan JoVE protokolüne bakınız. Kök hücre kültürlerinizde hayvan serumunun yerini tamamen alacak PHPL'nin nasıl hazırlanacağını size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, kültür ortamınıza heparin ve PHPL eklemeden önce trombosit fragmanlarını uzaklaştırmayı hatırlamanız önemlidir.
İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, trombosit açısından zengin plazmadan (PRP) insan trombosit lizatı (HPL) hazırlanmasını detaylandırmaktadır. İşlem, trombositleri liz etmek ve hücre kültürü takviyesi için büyüme faktörleri açısından zengin, trombosit fragmanlarından arındırılmış bir lizat üretmek amacıyla dondurma-çözme döngülerini içerir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre kültürü
- Trombosit biyolojisi
- Büyüme faktörü araştırmaları
Arka Plan
- İnsan trombosit lizatı, hücre kültüründe güçlü bir takviyedir.
- Hücre proliferasyonu ve farklılaşması için temel olan çeşitli büyüme faktörleri içerir.
- Hazırlama süreci, lizatın kalitesini ve etkinliğini sağlamak açısından kritiktir.
- Trombosit açısından zengin plazma, HPL hazırlığı için başlangıç materyali olarak kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- İnsan trombosit lizatı hazırlamak için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
- Daha temiz bir lizat için trombosit fragmanlarının uzaklaştırılmasını sağlamak.
- HPL'nin çeşitli hücre kültürü uygulamalarında kullanımını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Trombosit zengin plazma (PRP) ile başlanması.
- Trombositleri liz etmek için dondurma-çözme döngülerinin uygulanması.
- Havuzlanmış insan trombosit lizatı (PHPL) hazırlığı.
- Süpernatanttaki trombosit fragmanlarını uzaklaştırmak için santrifüjleme.
Ana Sonuçlar
- Büyük bir insan trombosit lizatı havuzunun başarıyla hazırlanması.
- Santrifüjasyon yoluyla trombosit fragmanlarının uzaklaştırılması.
- Yaklaşık üç litre trombosit kaynaklı büyüme faktörü verimi.
- Hücre kültürlerinde takviye olarak kullanıma uygun hazırlık.
Sonuçlar
- Protokol, insan trombosit lizatı hazırlamak için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- HPL, hücre kültürü sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirebilir.
- İleriki çalışmalar, HPL'nin çeşitli araştırma alanlarındaki uygulamalarını inceleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Hayvan serumu içermeyen kültür sistemleri, kök hücre tedavilerinin klinik uygulamalara aktarılması ve düzenleyici standartlara uygun hale getirilmesi açısından kritik öneme sahiptir. Bu protokol, mezenkimal stromal hücre proliferasyonunu ve endotel koloni oluşturucu hücre yayılımını destekleyen tanımlı, xeno-free bir takviye olarak insan trombosit lizatı (pHPL) üretiminin ölçeklenebilir hale getirilmesini sağlar. Trombosit lizini ve fragman tüketimini standartlaştırarak, lotlar arası değişkenliği azaltır ve erken keşif ile preklinik iş akışlarında tekrarlanabilirliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kök hücre proliferasyonu ve diferansiyasyon yolaklarının mekanistik çalışmalarını destekleyen, tanımlanmış, insan kaynaklı bir supplement sağlar.
- Operasyonel Değer: Deneyler arasında tutarlı kültür koşulları sağlayarak hedef doğrulama analizlerindeki değişkenliği azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel kök hücre deneylerinde güvenilir sonuçlar alınmasını destekleyen, büyüme faktörleri açısından zengin, standartlaştırılmış bir ortam sağlar.
- Operasyonel Değer: Fragmanlardan arındırılmış lizat aracılığıyla deney standardizasyonunu kolaylaştırır ve tarama platformlarında trombosit agregatlarının neden olduğu girişimi minimize eder.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Translasyonel biyobelirteç ve preklinik model gereksinimleriyle uyumlu olarak, kseno-serbest koşullar altında hastalıkla ilgili kök hücre genişlemesini destekler.
- Operasyonel Değer: Havuzlanmış donör kaynaklarından ölçeklenebilir üretime olanak tanıyarak teknoloji transferini ve GMP benzeri süreç geliştirmeyi destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef doğrulamadan preklinik genişletmeye kadar kök hücre kültürü için serumsuz bir takviye sağlayarak, öncü bileşik tanımlamasını ve mekanistik risk azaltmayı desteklemek suretiyle keşif sürekliliğine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Tutarlı ve tanımlanmış bir mikroçevre sağlayarak, kök hücre proliferasyonu ve diferansiyasyonu ile ilgili hipotezlerin test edilmesini destekler.
- Tarama: Standardize edilmiş, fragmanlardan arındırılmış lizat aracılığıyla kök hücre tabanlı analizlerde yeniden üretilebilir bileşik veya durum testlerine olanak tanır.
- Analitikler: Hücre proliferasyon hızları ve koloni oluşturma birimi verimliliği gibi nicelleştirilebilir çıktılar sağlayarak, kültür koşulları arasında karşılaştırmalı analize imkan verir.
- Translasyonel Araştırma: Mezankimal stromal ve endotelyal progenitor hücrelerin klinik olarak ilgili, hayvan ürünü içermeyen koşullar altında genişletilmesini destekleyerek, keşif aşamasını preklinik çalışmalarla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Rutin olarak temin edilen trombosit zengini plazmadan klinik derece takviye üretimi için yeniden kullanılabilir ve ölçeklenebilir bir süreç kurarak, değişken hayvan serumlarına olan bağımlılığı azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tanımlanmamış hayvan serum bileşenlerini ortadan kaldırarak ve büyüme faktörü iletimini standartlaştırarak, kök hücre kültürü sonuçlarındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Havuzlanmış donör işleme ile standartlaştırılmış dondurma-çözme ve santrifüj adımları aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği iyileştirir.
- Stratejik Değer: Fetal sığır serumuna insan kaynaklı, xeno-free bir alternatif sunarak hücre tedavisi geliştirmedeki biyolojik riski azaltır.
- Portföy Etkisi: Tanımlı kültür sistemlerinde tutarlı preklinik veri üretimini mümkün kılarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Steril hücre kültürü teknikleri, trombosit işleme ve santrifüj protokolleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Yetkili kan bankalarından veya transfüzyon servislerinden trombosit zengin plazmaya erişime ve torba manipülasyonu için steril kaynaklama veya sızdırmazlık ekipmanına bağlıdır.
- Kültür güvenliğini sağlamak amacıyla, işlem öncesinde ve sonrasında giriş PRP'sinin ve havuzlanmış lizatın standart sterilite testlerinin yapılmasını gerektirir.
- Havuzlama stratejisine rağmen, lota özgü büyüme faktörü konsantrasyonlarını dikkate almak için kültür protokollerinin uyarlanmasını gerektirir.
- İşlem süresini artıran ve özel ekipman gerektiren çok sayıda dondurma-çözme döngüsü ve santrifüj adımına duyulan ihtiyaçla sınırlıdır.
