Name: İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-08T16:03:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: Öğrenin, insan göbek kordonundan hayvansal serum kullanmadan endotel koloni oluşturan progenitör hücreler ve mezenkimal stromal hücreler izolasyonu ve genişletme protokolü. Bu yöntem, otolog hücre çiftleri elde ederek rejeneratif tıp ve transplantasyon çalışmalarını ilerletir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar yazının yararlı yorumlar, Daniela Thaler ve Margaretha Fr hwirth teknik yardım için, dil düzenleme için Monica Farrell, Uwe Lang, Margit Holzapfel ve Kadın Hastalıkları Bölümü Sandra Eppich pHPL, Eva Rohde ve Nicole Hofmann sağlamak için Katharina Schallmoser teşekkür Kabloları sağlamak için. Bu çalışma, Avusturya Araştırma Vakfı (FWF, DS hibe N211-NAN), Avusturya Araştırma Promosyon Ajansı (FFG, hibe N200 DS) ve Yetişkin Kök Hücre Araştırma Vakfı (AR) tarafından desteklenmiştir. AR doktora programı Graz Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıp üyesidir.

Bölüm 1: ayarlama 1. Hücre kültür ortamı hazırlanması Orta hazırlığı başlamadan önce tüm malzemeleri ve gereken araçlar topluyoruz. Çözülme 2 toplanmış insan trombosit lizat x 56 ml alikotları (pHPL, kendi kendine: Referans 1 ve Jüpiter # 1523), 100x Penisilin / Streptomisin çözümü, 2 adet 10 ml x 5 ml L-Glutamin (Sigma hem). EGM-2 orta boy (Lonza) 1 şişe (500 ml) ek için ayarlanan sitokin ve büyüme faktörü alikotları (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hidrokortizon, Amfoterisin &#39;tek quots&#39; olarak askorbik asit, heparin,) Çözülme. Buzdolabından bir adet 500 ml şişe (i) her minimal temel orta alfa-modifiye (MEM) ve (ii) endotel bazal, orta (KDT). Aşağıdaki adımları, steril koşullar altında bir laminer akış doku kültürü kaputu yapılmaktadır. 1000 IU / mL steril su ile son bir konsantrasyon toz eriterek, koruyucu içermeyen heparin (örneğin, Biochrom) hazırlayın. MSC-Orta: 500 mL-MEM kullanın çözülmüş pHPL 56 ml (da daha fazla ayrıntı için 1 referans) ve 2 IU / mL (= 224 ul stok solüsyonu), koruyucu içermeyen Heparin (orta, topaklanma yoluyla koagülasyon önler eklemek plazma fibrinojen)% 10 pHPL bir final konsantrasyonuna ulaşmak için. Ayrıca Penisilin (100U/mL) / Streptomisin (100μg/mL) çözüm ve L-glutamin 2mm (Sigma hem) ekleyin. 20 mikron gözenek boyutu vakum filtresi (Millipore) ile orta Filtresi. (Içerik, tarih) uygun şişe etiketi. ECFC-Orta: EBM bir şişe (500 ml) kullanın ekleyin, sitokin alikotları, koruyucu içermeyen Heparin pHPL, 10 IU / ml (= 1120μl stok solüsyonu) 56 mL, Penisilin (100U/mL) / Streptomisin (100 g / ml) solüsyonu ve 20 ul-gözenek boyutu vakum filtresi (Millipore) ile bazal, orta ve filtre L-glutamin 2mm. (Içerik, tarih) uygun şişe etiketi. 2. Cerrahi aletlerin sterilizasyon Forseps, cerrahi makas ve neşter sahibinin keskin çifti ısı sterilize cevheri steril tek kullanımlık olmalıdır. 3. Kordon koleksiyonu için tüplerin hazırlanması 50 ml polipropilen tüpler (Falcon) ücretsiz heparin ve son hacim 20 ml PBS ile uyum - 500 IU koruyucu ekleyin. Tüpleri teslim odasına aktarın. 4. Aydınlatılmış onam (yerel etik kurul veya IRB tarafından onaylandıktan sonra). Kablonun bir parça bağış ve yeterli hizmet amaçları onları bilgilendirmek istiyorsanız teslimat için önce anne ve babalar sorabilir. 5. Kordon bağış Plasenta ve kord teslimat ve teftişin 10 cm bir parça kesti ve hemen kordon damarları içindeki kalan kanın pıhtılaşma önlemek için heparin ile önceden doldurulmuş tüp transferinden sonra. En kısa sürede hücre izolasyonu ile devam edin. Bölüm 2: Hücre izolasyonu <ol><li> Incidin veya% 70 EtOH yüzeylerin temizlenmesi, laminer akış doku kültürü kaputu hazırlayın. Yeri steril 150 cm 2 hücre kültürü tabak, 75 cm hücre kültürü şişeleri (Corning), PBS, steril cerrahi aletler, cep kazıyıcılar, tüp tutucu, 25 ml stripettes ve 5 ml şırınga temizlenir kaputu uygun künt sonunda iğne ile donatılmış. </li><li> Pre-sıcak hazırlanan α-MEM ve EGM-2 hücre kültürü orta 37 ° C su banyosu. </li><li> Doğumhane hücre kültürü kaputu ile donatılmış laboratuvar kablosu getirin. Laminer akım kablosunun aktardıktan sonra, kan hücrelerinin kontamine kurtulmak için (yeni bir plaka transfer) PBS içinde iki kez yıkayın. Umbilikal ven kablosunun diğer ucunu çıkan sıvı kadar PBS ile künt sonunda iğne ile donatılmış steril bir 5 ml&#39;lik şırınga ile bir tarafta canulating sonra durulayın (kırmızımsı kan kontaminasyonu gösterir) tamamen şeffaf hale gelir. </li></ol> ECFCs: <ol start="4"><li> 75 cm 2 balonuna (Corning) hazırlayın, etiket ve önceden ısıtılmış EGM-2 orta 15-20 ml doldurun. </li><li> Kablosu steril PBS ile dolu yeni bir tabak içine yerleştirin. Cerrahi makas alın ve yaklaşık 5 cm uzunluğunda iki adet (göbek damarları kendi ekseni boyunca bükülmüş, çünkü kısa parçalar, süreci daha kolay) içine göbek kordonu kesmek. </li><li> Umbilikal ven (büyük damar) bulmaya çalışın cerrahi makas, bir bıçak yerleştirin ve uzunlamasına damar kesmek. Bu noktada daha engellerken, bir asistan, iki forseps ile zaten kesilmiş damar tutabilir yararlı olabilir. </li><li> Kord pasta yerleştirin.ce PBS olmadan yeni plaka kesme damar, hücre kazıyıcı ve bir ucundan diğer rubbings umbilikal ven iç (endotel) yüzey kazıma alır. Orta sıyırıcı ucu temizleme hazırlanmış balona hücrelere aktarın. Bu işlem en az 10 kez tekrarlayın. </li><li> Şişeyi kapatın ve içine koymak, bir kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO 2,% 95 nem) . </li></ol> MKH: <ol start="4"><li> 150 cm 2 kültür plakasına (Corning) hazırlayın ve etiket. </li><li> (Endotel tabakası kazıyarak sonra) kablosunun parça alın ve steril makas ve steril bistüri ile çok küçük parçalar halinde tüm kablosunu kesip. Kord adet maksimum boyutu 1-2 mm olmalıdır. </li><li> Önceden etiketli kültür plakasına steril forseps ile kordon adet aktarın. Plaka orta ile doldurmadan önce 5 dakika boyunca açık bırakarak, plastik yüzey adet ek güçlendirilmiştir. </li><li> Kord adet plastik uygun bağlandıktan sonra, yavaşça 30-35 ml MEM değiştirilmiş önceden ısıtılmış alfa ekleyin. Tüm parçaları takılı kalması emin olmak için en düşük hızda kullanmayı deneyin. </li><li> Tabak kapatın ve içine koymak, bir kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO 2,% 95 nem) . </li></ol> Bölüm 3: Hücre genişlemesi ve flow sitometri ile bağışıklık-fenotip onay Hücre Genişleme EFCFs: <ol><li> Ters bir mikroskop ve döviz endotelyal hücrelerin ek bir sonraki gün kontrol edin bütün EGM-2 bağlı olmayan tüm hücreleri ve parçacıkların kurtulmak için orta. </li><li> Orta izdiham ve döviz üçte biri haftada iki kez kadar hücreleri genişletin. Izdiham ulaşıldığında,% 0.05 &#39;Trypsin/0.7 mM EDTA hücreleri ayırmak ve yeni bir kültür gemilere aktarmak. Sizin T75 şişesinin içinde hücrelerinin sayısına bağlı olarak, daha da genişlemesi için düşük ekim yoğunluğu garanti altına almak için yeni şişeler sayı ve büyüklüğü seçmelisiniz. </li><li> Exchange üçte biri haftada iki kez hücrelerinin genişlemesi sırasında orta. </li></ol> MKH: <ol><li> Kabloyu MKH akıbet daha fazla zaman alacaktır, bu yüzden bağlı doku parçaları çevrede iğ şekilli hücreler görünüm için ters bir mikroskop kadar en az 3-4 gün bekleyebilir. Yeterli hücre dışı büyüme olduğunda, adet plastik ile temas kaybı nedeniyle ayırmak için eğilimindedir. </li><li> 10-12 gün doku parçaları kaldırdıktan sonra,% 0.05 &#39;Trypsin/0.7 mM EDTA ile plastik MKH ayırmak ve yeni bir kültür damarlarının aktarabilirsiniz. Plağındaki hücrelerinin miktarına bağlı olarak daha da genişlemesi için düşük ekim yoğunluğu garanti altına almak için yeni şişe büyüklüğü ve sayısına karar. </li><li> Exchange üçte biri haftada iki kez hücrelerinin genişlemesi sırasında orta. </li></ol> Flow sitometri Gerekli ekipman: Akış sitometresi (BD FACSCalibur), mikronik tüpleri (Corning), tüp tutucu, koyun serum (reaktif engelleme), Eppifuge (Eppendorf), monoklonal antikorlar MKH: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, izotip kontrol ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, izotip kontrol <ol><li> Izdiham ulaştıktan sonra, 4 dk 7 300g 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ve santrifüj hücre ayırmak ° C </li><li> Modifiye PBS ve% 10, 4 dakika 20 v / v koyun serum ° C blok belirsiz antikor bağlanma 1x10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon hücreleri yeniden süspanse </li><li> Etiket mikronik tüpleri ve floresan etiketli antikorlar uygun konsantrasyonda ekleyin. </li><li> Her bir tüp hücre süspansiyonu (bloke) 50 ul ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe 4 ° C </li><li> Bağlayıcı olmayan antikorlar kaldırmak için modifiye PBS ekleyerek hücrelerin yıkayın. </li><li> Akış sitometresinin etiketli hücre ile gidin ve analiz yapmak. </li></ol> Bölüm 4: ECFC koloni büyüme, fiksasyon, boyama ve hiyerarşi analizi <ol><li> Tohum santimetre kare başına 3 veya 10 hücre hücre kültürü plakaları çok düşük kaplama yoğunluğu neredeyse saf hasat ECFCs tek koloni büyümesi için izin vermek. </li><li> Exchange üçte biri haftada iki kez orta. </li><li> 14 gün (kültür sonu) orta kaldırdıktan sonra, PBS ile iki kez yıkayın ve buz gibi fiksasyon çözüm (Aseton 2: Metanol = 3) koloniler düzeltmek buzdolabında 15 dakika boyunca. </li><li> Fiksasyon çözüm atın ve plakalar 10 dakika kuruması için açık bırakın. </li><li> Distile su ile 10 dakika hücreleri rehidrate. </li><li> Harris hematoksilen çözeltisi ekleyin ve 12 dakika boyunca sabit koloniler leke. </li><li> H matoxylin çözüm çıkarın ve kalan boyama çözüm kurtulmak için musluk suyu ile plakalar durulayın. </li><li> Her koloninin fotoğraflar çekinstereomikroskopta ve ithalat kullanarak *. jpg veya bilgisayarınıza *. tif formatındaki dosyalar. </li><li> ImageJ yazılımı ile fotoğrafları açın ve animasyon açıklandığı gibi her koloninin doğru hücre sayısı analiz. </li><li> ImageJ yazılımını açın ve menü aşağı çekme &#39;Dosya \ Open&#39; fonksiyonunu kullanarak bir koloni resmi ithalat. </li><li> Fonksiyonu &#39;\ çıkart Arkaplan Süreci&#39; ile devam edin </li><li> Koloni marjı işaretlemek için ImageJ menüsünde &#39;* eliptik veya fırça seçimi&#39; işlevini kullanın. </li><li> &#39;Düzenle \ Clear dışında&#39; fonksiyonu ve kırpma &#39;\ kırpma&#39; seçilerek resmi kullanarak, çevredeki görüntü temizleyin. </li><li> Kullanarak elle ayarlayabilirsiniz.Özellik &#39;Resim \ \ Eşik ayarlayın&#39; tüm hücreleri tamamen kırmızı renkli, böylece fonksiyonu. </li><li> &quot;Analyze \ analiz Parçacıklar &#39;seçerek koloni hücre sayısını saymak. Uygun ayarları (her bir hücre tipi için optimize) seçin ve &#39;OK&#39; i seçin. Hücre sayımı ve sayılan hücrelerin karşılık gelen ana hatlarını içeren bir yeni görüntü de dahil olmak üzere sonuçları kutusunda görünecektir. <img src="/files/ftp_upload/1525/1525op2.jpg" alt="Şekil 1" /></li></ol>

<ol><li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li>
<li>Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+preclinical+production+of+human+lineage-negative+cells+for+regenerative+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy.</a> Transfusion. 45, 315-326 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, herhangi bir mali çatışmalar faiz beyan etmek zorunda değilsiniz.

Kemik iliği, yağ dokusu, kordon kanı, vb de dahil olmak üzere MKH veya ECFCs almak için çeşitli kaynaklardan vardır Bu doku ve damar yenilenme veya tümör progresyonu katkı gibi süreçlerde farklı hücre tiplerinin doğrudan katılımını karşılaştırmak için aynı kaynaktan atalarıdır iki türlü elde etmek için gereklidir. Izole etmek ve daha sonra aynı donörden ECFCs ve MKH otolog çiftleri çalışma kolaylığı olan bu yöntem bireysel deneyler içinde donör varyasyonlar hariç...

<table><tbody><tr><td>alpha modifiyeli MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tekli sitokin alıkotları</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; flasklar</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; plaklar</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre kazıyıcı</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikorlar</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tüpler</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL filtre 20 &amp;mu;m gözenek boyutu </td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koruyucu içermeyen heparin</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan göbek kordonu İzolasyon ve hayvan serum genişleme mezenkimal stromal hücreler (mkh) ve endotel koloni oluşturan progenitör hücreler (ecfcs) türetilmiş

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Göbek kordonu, mezenkimal stromal hücreler (mezenkimal kök hücreler olarak da adlandırılır, MKH) ve endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) de dahil olmak üzere yüksek proliferatif potansiyele sahip progenitör hücreler için zengin bir kaynaktır. Her iki hücre tipleri, doku bütünlüğünün korunmasında anahtar oyuncular ve muhtemelen de rejeneratif süreçleri ve tümör oluşumu ilgilidirler. Biyoloji ve karşılaştırmalı bir şekilde çalışma için aynı vericiden alınan hücreler türleri olması önemlidir. Ayrıca aynı doku MKH ve ECFCs türetmek için rejeneratif amaçlar için faydalı olabilir. Hücresel terapötikler sonunda Masadan yatağın başucuna kendi yolunu bulmak gerekir çünkü biz, izole etmek için yeni bir yöntem kurulmuş ve daha fazla hayvansal protein kullanmadan progenitör hücrelerin genişletmek. Pooled insan trombosit lizatı (pHPL) fetal sığır serumu tamamen xenogeneic proteinler hücreleri temas önlemek için tüm adımları protokol yerini aldı. Bu video bir göbek kordonu progenitör hücrelerin izolasyonu ve genişleme için bir metodoloji ortaya koymaktadır. Tüm malzeme ve usulleri açıklanan olacaktır.

Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

Göbek kordonu, mezenkimal stromal hücreler (mezenkimal ... olarak da adlandırılan) dahil olmak üzere yüksek proliferatif potansiyele sahip progenitör hücreler için zengin bir kaynaktır.

İnsan göbek kordonu, progenitor hücreler için kolayca erişilebilir bir kaynaktır. Bu makalede, tek bir insan göbek kordonundan türetilen damar duvarı içindeki bir hücre alt popülasyonu olan endotel progenitor hücrelerin (eCFC'ler) ve mezenkimal progenitor hücrelerin (MSC'ler) izolasyonu ve ardından genişletilmesi için bir protokol tanımlıyoruz.İlk olarak makasla boyuna doğru insan göbek veni boyunca kesin ve hücreleri damarın iç yüzeyinden sıyırın. Sıyırılan hücreleri bir flaska aktarın ve kolonilerin büyümesini bekleyin. Sıyırılan hücrelerin bir kısmı progenitör fenotip sergileyecek ve büyük koloniler oluşturacak şekilde yoğun bir şekilde çoğalacaktır.Bu hücreler çoğaldıktan sonra, e CFC'ler yeni flasklarda genişletilebilir. Daha ileri analizler için, insan göbek kordonundan bir mezenkimal hücre popülasyonu da izole edilebilir. Kordon parçalarını küçük parçalar halinde kesin ve bunları steril bir kültür plakasına aktarın.Birkaç gün sonra, intervasküler kord doku parçalarının çevresinde stromal hücre çıkımı görünür hale gelecektir. Bu hücreleri yeni flasklara aktarın ve ileri analizler için çoğaltın. Bu protokol, üç ila dört hafta içinde tek bir başlangıç materyali olan korddan iki tip progenitor hücre soyu elde etmenize olanak tanır.Merhaba, ben Avusturya'daki Grads Tıp Üniversitesi'nde yer alan bir kök hücre araştırma biriminde, Dr. T Strong'un laboratuvarından Andreas Danish. Bugün size, tek bir göbek kordonundan insan mezenkimal ve endotelyal kanal hücrelerinin izolasyonu, ekspansiyonu ve analizine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Terminoloji hakkında küçük bir not eklemek istiyorum.Hücrelerimize multipotent mezenkimal stromal hücreler veya MSE'ler ile endotelyal kolon oluşturan progenitör hücreler veya eCSC'ler denir. Laboratuvarımızda, hematopoetik olmayan progenitör hücre fonksiyonlarını ve biyolojisini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Hücre izolasyon basamaklarından önce, laminar akışlı doku kültürü kabinini inadin ile silin ve steril hücre kültürü plakalarını hazırlayın. Hücre kültürü balonları, PBS ile sterilize edilmiş cerrahi aletler, hücre kazıyıcılar, bir tüp tutucu, 25 mililitrelik strip pipetler ve küt uçlu iğne takılmış beş mililitrelik bir şırınga hazırlayın. alfa MEM ve EGM-2 hücre kültürü ortamlarını 37 °C su banyosunda önceden ısıtmayı unutmayın.Şimdi göbek kordonunu laminar akış kabinine aktarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Kontamine kanı uzaklaştırmak için, kordon venini bir taraftan kanüle etmek amacıyla steril beş mililitrelik bir şırınga kullanın. Ardından, çıkan sıvı berraklaşana kadar göbek venini PBS ile durulayın.Kordonun diğer ucu, kırmızı renk olmadan tamamen şeffaf hale gelir. 75 santimetrekarelik bir flaskı 15 ila 20 mililitre ön ısıtılmış EGM-2 medyumu ile doldurarak endotelyal koloni oluşturan progenitör hücre izolasyonuna başlayın. Kordonu steril PBS ile doldurulmuş yeni bir plakaya yerleştirin ve cerrahi makas kullanarak kordonu her biri yaklaşık beş santimetre uzunluğunda iki parçaya bölün.Şimdi cerrahi makasın bir ucuyla veni boyuna kesin. Bu aşamada, kesim işlemleri devam ederken bir asistan pens yardımıyla veni tutabilir. Açık venli kordu yeni bir plakaya yerleştirin.PBS kullanmadan, bir hücre kazıyıcı yardımıyla venin iç yüzeyini en az bir santimetrelik bir alan boyunca ovun. Ovulan damar hücrelerini flaska salmak için kazıyıcıyı EGM two besiyerinde yıkayın. Bu prosedürün 10 kez tekrarlanması gerekecektir.Balonu kapatın ve 37 °C, %5 karbondioksit ve %95 nem değerlerine ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. e CFC'ler izole edildiğine göre, şimdi MSC'lere geçelim. Endotelyal tabaka sıyrıldıktan sonra, kordonu çok küçük parçalara ayırmak için steril bir skalpel kullanın.Bir ila iki milimetre. Bu parçaları önceden etiketlenmiş bir kültür plağına aktarmak için steril pens kullanın. Parçaların plastik yüzeye yapışmasını sağlamak için plağı besiyeri ile doldurmadan önce en az beş dakika açık bırakın.Mümkün olan en düşük hızı kullanarak, önceden ısıtılmış alfa modifiyeli MEM'den 30 ila 35 mililitre nazikçe ekleyin. Plağı kapatın ve 37 °C sıcaklığa, %5 karbondioksite ve %95 neme ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Kordon parçalarından mezenkimal stromal hücrelerin dışa büyümesi üç ila yedi gün sürecektir, ardından hücreler genişletilebilir.Bu sırada, bir sonraki adımda gösterileceği üzere, ECFC'ler genişletilebilir. Ertesi gün, hücreleri incelemek için ters mikroskop kullanın. Kazıma işlemi doğru şekilde gerçekleştirildiyse, ilk çoğalan hücre kümeleri tamamen görünür olacaktır.Tüm yapışmamış hücreleri ve partikülleri uzaklaştırmak için EGM-2 ortamını değiştirin. Hücreleri genişletmeye devam edin ve haftada iki kez ortamın üçte birini yenileyin. 10 ila 12 gün sonra, düzenli olarak çok büyük endotelyal koloniler gözlemlenecektir.Şimdi, kalan protein kalıntılarını gidermek için besiyerini uzaklaştırın ve PBS ile yıkayın. Hücreleri ayırmak için %0,05 trypsin 0,7 millimolar EDTA kullanın. Hücreleri yeni kültür kaplarına aktarırken, düşük bir ekim yoğunluğu elde etmek için uygun boyutlarda flasklar seçtiğinizden emin olun.Bu işlem daha ileri genişletmeye yardımcı olacaktır. Laboratuvarımızda genellikle 20'den fazla büyük koloniden elde edilen döl, dört adet 225 cm²'lik erlene aktarılır. Haftada iki kez ortamın üçte birini değiştirmeyi unutmayın.Bir sonraki bölümde MSC ekspansiyonu için benzer bir protokol kullanılır. Üç ila yedi gün geçtikten sonra, yapışmış dokunun yakınında iğ şeklinde hücrelerin oluşup oluşmadığını kontrol etmek için ters mikroskop kullanın. Yeterli hücre büyümesi gerçekleştiğinde, parçalar plastik ile temaslarını kaybettikleri için yapışma eğilimi gösterirler.10 ila 12 gün sonra doku parçalarını çıkarın. MSC'leri tripsin EDTA çözeltisi kullanarak plastikten ayırın ve hücreleri, hücre genişlemesi sırasında düşük ekim yoğunluğunu garanti edecek uygun boyut ve sayıdaki, önceden doldurulmuş yeni besi ortamlı kültür flasklarına aktarın. Her iki hücre tipi de genişletildikten sonra, haftada iki kez besi ortamının üçte birinin değiştirilmesi gerekecektir.Progenitör fenotiplerine işaret eden hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonunu tespit etmek ve hematopoetik hücre kontaminasyonu olmadığını belirlemek için boyama ve ardından akış sitometrisi uygulanabilir. Tek koloni büyümesini garanti altına almak için, hasat edilen saf e CFC'leri hücre kültürü plaklarına santimetrekare başına üç veya 10 hücre gibi çok düşük bir ekim yoğunluğunda ekin. Kültürün sonu olan 14 gün boyunca, haftada iki kez ortamın üçte birini değiştirin.Besiyerini uzaklaştırın. PBS ile iki kez yıkayın ve kolonileri buzdolabında 15 dakika boyunca buz gibi soğuk fiksasyon çözeltisi ile sabitleyin, fiksasyon çözeltisini dökün ve plakaları kuruması için 10 dakika boyunca açık bırakın. Hücreleri distile su ile 10 dakika boyunca rehidre edin.Harris Hematin solüsyonu ekleyin ve fikse edilmiş kolonileri 12 dakika boyunca boyayın. Kalan boyama solüsyonundan kurtulmak için hematin solüsyonunu uzaklaştırın ve plakaları musluk suyuyla durulayın.Bir stereo mikroskop kullanarak her bir koloninin fotoğraflarını çekin ve jpeg veya TIFF formatındaki dosyaları bilgisayarınıza aktarın. Fotoğrafları ImageJ yazılımı ile açın ve aşağıdaki animasyonda açıklandığı şekilde her bir koloninin kesin hücre sayısını analiz edin. ImageJ yazılımını açın ve açılır menüdeki dosya aç (file open) işlevini kullanarak bir koloni görüntüsünü içeri aktarın.İşlemi uygulayarak devam edin. Arka planı çıkarma (Subtract background) fonksiyonunu kullanın. Koloni sınırını işaretlemek için Image J menüsündeki eliptik veya fırça seçim fonksiyonunu kullanın.Düzenle dışını temizle (edit clear outside) işlevini kullanarak çevredeki görüntüyü temizleyin ve görüntü kırpma (image crop) seçeneğini seçerek resmi kırpın. Tüm hücrelerin tamamen kırmızıya boyanması için görüntü eşik değerini ayarla (image adjust threshold) işlevini kullanarak eşik değerini manuel olarak düzenleyin. Seçim yaparak kolonideki hücre sayısını sayın.Analiz et, partikülleri analiz et. Her hücre tipi için optimize edilmiş uygun ayarları seçin ve tamam'a tıklayın. Doğru şekilde uygulandığında, bu protokol, aynı korddan türetildikleri için birbirlerine otolog olan ve insan endotel ile mezenkimal progenitör hücrelerin özelliklerini paylaşan, neredeyse saf bir hücre popülasyonunun izolasyonuna olanak tanır.Beşinci günden itibaren, kültür plakasına tutturulmuş kordon parçasının altından iğ şeklinde mezenkimal hücreler belirecektir. Bir ila iki gün sonra, endotelyal koloni oluşturucu progenitör hücrelerin veya e CFC'lerin ilk kümeleri ters mikroskop altında görünür hale gelecektir. e CFC'lerin bu hızla büyüyen dev kolonisi 11 gün sonra oluşmuştur.Hem MSC'ler hem de E CFC'ler pasajlanabilir ve daha fazla genişletilebilir. Uygun fenotipi doğrulamak için tüm kültür ürünlerinin akış sitometrisi kullanılarak analiz edilmesini öneririz. Lütfen hem endotel hem de mezenkim soyalarının CD 73, CD 1 46, CD 29 ve CD 1 0 5'e özgü antikorlara yanıt verdiğini unutmayın.MSC'lerin, anti CD 90 antikoru kullanılarak tespit edilen thigh one ifade ettiğine dikkat edin. E CFC'ler, trombosit endotelyal hücre yapışma molekülü veya pcam olarak da adlandırılan CD 31 için pozitiftir. Kordon kaynaklı E CFC'lerdeki CD 34 immünoreaktivite ekspresyonunun tekrarlanan kültürler yoluyla azalabileceği iyi bilinmektedir.CD 45, H-L-A-D-R ve CD 14 gibi kan hücresi belirteçleri her iki hücre tipi için de negatif kaldı. E CFC'ler arasındaki progenitör hücre hiyerarşisi, her bir tek koloninin hücre sayıları doğru şekilde sayılarak Image J yazılımı kullanılarak değerlendirilebilir. Bu prosedürü uygularken, insan göbek kordonundan maces ve ECE'lerin nasıl izole edileceğini, genişletileceğini ve analiz edileceğini size göstermiş olduk.Steril koşullarda çalışmak ve hücreleri sonraki çalışmalarda kullanmadan önce fenotip ve saflık kontrollerini yapmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

isolation-animal-serum-free-expansion-human-umbilical-cord-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) vasküler homeostazı ve onarım çalışması için bir gelecek vaat eden bir araçtır.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) intrensek göstermeyen sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli olan endotel hücreleri...

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Bu yazıda izolasyon ve bu dokulardan mezenkimal kök / stromal hücreler (MSC) genişlemesi, ardından insan terim plasenta, fetal ve maternal dokuların diseksiyonu için yöntemler açıklanmaktadır.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Burada, insan göbek kordonu (UC) ve kord fetal plasenta örnek izolasyonu için (CL) Wharton jöle (WJ), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP) astar diseksiyon için bir protokol mevcut ve eksplant kültürü tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreler (MSC) karakterizasyonu.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

İnsan göbek kordonu (UC) sonucu olarak preterm, terim perinatal dönemde elde edilebilir ve teslimat postterm. Bu protokol için biz yalıtım ve UC kaynaklı mezenkimal kök hücre (UC-MSCs) karakterizasyonu fetusa/bebeklerde 19-40 hafta gebelik açıklar.

Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu

Bu protokol, ekstrektif bir yöntem kullanılarak abdominoplasti ve lipoaspirate örneklerinden mezenkimal kök hücrelerin izole imal etmek için enzimsiz bir yöntem sağlar. Sert enzimlerin veya santrifüj adımlarının olmaması, in vitro çalışmalarda kullanılabilecek veya kliniğe geri transfer edilebilen klinik olarak ilgili kök hücreleri sağlar.

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Bu çalışma, Wharton jölesinin (WJ) bütünlüğünü korumak için benzersiz bir künt diseksiyon prosedürü sunar, bu da daha az hasarlı WJ ve hasat edilen mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) daha fazla miktarda ve canlılığı ile sonuçlanır. Yöntem, konvansiyonel keskin diseksiyon yöntemlerine kıyasla üstün verim ve proliferatif yetenek göstermektedir.

Umbilikal Kordon Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerin Yüksek Verim ve Düşük Hasarla İzolasyonu

Heterojen insan UC-MSC'lerini oluşturan üç ana alt gruptan biri olan BAMBIyüksekMFGE8yüksek MSC'lerin izolasyonu, belirli hastalıklarda klinik etkinliği artırmak için gelecekteki uygulaması için bu alt tipin özelliklerinin ve işlevlerinin tam olarak anlaşılmasına yardımcı olur. Burada, BAMBIyüksekMFGE8yüksek UC-MSC'leri sıralamak için bir yöntem sunuyoruz.

İnsan BAMBIyüksekMFGE8yüksek Göbek Kordonu Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücrelerin İzolasyonu

Bu video protokolü insan göbek kordonu, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) izolasyonu ve kültürü göstermektedir. Bir kere bu hücreler, in vitro Hughes laboratuvar gösterdiği Optimize Fibrin Jel Boncuk Testi gibi anjiyogenez tayinlerde için kullanılabilir izole edilmiştir.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Öğrenin, insan göbek kordonundan hayvansal serum kullanmadan endotel koloni oluşturan progenitör hücreler ve mezenkimal stromal hücreler izolasyonu ve genişletme protokolü. Bu yöntem, otolog hücre çiftleri elde ederek rejeneratif tıp ve transplantasyon çalışmalarını ilerletir.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş (Video) | JoVE Journal

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

Daha fazla video keşfet