İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

İnsan göbek kordonu, kolayca erişilebilen bir progenitör hücre kaynağıdır. Bu makalede, damar duvarı ve mezenkimal progenitör hücreler içindeki hücrelerin bir alt popülasyonu olan endotelyal progenitör e CFC'lerin izolasyonu ve ardından genişletilmesi için bir protokol açıklıyoruz. MSC'ler tek bir insan göbek kordonundan türetilmiştir.

Önce uzunlamasına makas kullanarak, insan göbek damarı boyunca kesin ve hücreleri iç damar yüzeyinden kazıyın. Hücreleri sıyırıcıdan bir şişeye aktarın ve koloni büyümesini bekleyin. Kazınan hücrelerin bazıları bir progenitör fenotip sergileyecek ve büyük koloniler oluşturmak için yoğun bir şekilde çoğalacaktır.

Bu hücreler çoğaldıktan sonra, e CFC'ler yeni şişelerde genişletilebilir. Daha fazla analiz için, bir mezenkimal hücre popülasyonu da insan göbek kordonundan izole edilebilir. Kablonun parçalarını küçük parçalar halinde kesin ve steril bir kültür plakasına aktarın.

Birkaç gün sonra, stromal hücre büyümesi, intervasküler kordon dokusu parçalarının etrafında görünür olacaktır. Bu hücreleri yeni şişelere aktarın ve daha fazla analiz için genişletin. Bu protokol, üç ila dört hafta içinde tek bir başlangıç materyal kordonundan iki tip progenitör hücre soyu elde etmenizi sağlar.

Merhaba, ben Avusturya'daki Mezunlar Tıp Üniversitesi'ndeki bir kök hücre araştırma biriminde Dr.T Strong'un laboratuvarından Andreas Danish. Bugün size tek bir göbek kodundan insan mezenkimal ve endotel kanal hücrelerinin izolasyonu, genişletilmesi ve analizi için bir prosedür göstereceğiz. Terminoloji hakkında sadece bir not.

Hücrelerimize multipotent, mezenkimal stromal hücreler veya MSE'ler ve endotelyal kolon oluşturan pro hücreler veya e CSC'ler denir. Bu prosedürü laboratuvarımızda hematik olmayan progenitör hücre fonksiyonu ve biyolojisini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Hücre izolasyon adımlarından önce, laminer akış doku kültürü başlığını inadine ile silin ve steril hücre kültürü plakalarını toplayın. Hücre kültürü şişeleri, PBS sterilize edilmiş cerrahi aletler, hücre sıyırıcılar, bir tüp tutucu, 25 mililitrelik şerit evcil hayvanlar ve künt uçlu bir iğne ile donatılmış beş mililitrelik bir şırınga. Alfa MEM ve EGM iki hücreli kültür ortamını 37 derecelik bir su banyosunda önceden ısıtmayı unutmayın.

Şimdi göbek kordonunu laminer akışa aktarın ve PBS'de iki kez yıkayın. Kirletici kanı çıkarmak için, bir taraftaki kordon damarını kanüle etmek için steril beş mililitrelik bir şırınga kullanın. Şimdi sıvı dışarı akana kadar göbek damarını PBS ile durulayın.

Kablonun diğer ucu kırmızı renk tonu olmadan tamamen şeffaf hale gelir. 75 santimetre karelik bir şişeyi 15 ila 20 mililitre ön ısıtma EGM iki ortam ile doldurarak progenitör hücre izolasyonu oluşturan endotelyal koloniye başlayın. Kabloyu steril PBS ile doldurulmuş yeni bir plakaya yerleştirin ve kabloyu her biri yaklaşık beş santimetre uzunluğunda iki parçaya kesmek için cerrahi makas kullanın.

Şimdi cerrahi makasın bir bıçağını yerleştirin ve damarı uzunlamasına kesin. Bu noktada, bir asistan daha fazla kesi yapılırken damarı tutmak için forseps kullanabilir. Damarı açık olan kordonu yeni bir plakaya yerleştirin.

PBS olmadan, damarın iç yüzeyini en az bir santimetrelik bir alana sürtmek için bir hücre kazıyıcı kullanın. Sürtünen damar hücrelerini şişeye bırakmak için sıyırıcıyı EGM iki besiyerinde yıkayın. Bu prosedürün 10 defaya kadar tekrarlanması gerekecektir.

Şişeyi kapatın ve 37 derece, %5 karbondioksit ve %95 nem oranına ayarlanmış bir inkübatöre koyun. Artık e CFC'ler izole edildiğine göre, MSC'lere geçelim. Artık endotel tabakası kazındığına göre, kordonu çok küçük parçalara ayırmak için steril bir neşter kullanın.

Bir ila iki milimetre. Bu parçaları önceden etiketlenmiş bir kültür plakasına aktarmak için maksimum steril forseps kullanın. Parçaların plastik yüzeye yapışmasını sağlamak için orta ile doldurmadan önce plakayı en az beş dakika açık bırakın.

Mümkün olan en düşük hızı kullanarak, yavaşça 30 ila 35 mililitre ön ısıtma alfa modifiye MEM ekleyin. Plakayı kapatın ve% 5 karbondioksit ve% 95 nem ile 37 dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Kordon parçalarından mezenkimal stromal hücrelerin büyümesi üç ila yedi gün sürer ve ardından hücreler genişletilebilir.

Bu arada, ECFC genişletilebilir, bu da size bir sonraki adımda gösterilecektir. Ertesi gün, hücreleri incelemek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Kazıma işlemi düzgün bir şekilde yapıldıysa, ilk çoğalan hücre kümeleri tamamen görünür olacaktır.

Bağlı olmayan tüm hücreleri ve parçacıkları çıkarmak için E GM iki ortamını değiştirin. Hücreleri genişletmeye ve ortamın üçte birini haftada iki kez değiştirmeye devam edin. 10 ila 12 gün sonra, çok büyük endotel kolonileri düzenli olarak gözlenecektir.

Şimdi, ortamı çıkarın ve kalan protein kullanımından kurtulmak için PBS ile yıkayın. % 0.05 tripsin 0.7 milimolar EDTA hücreleri ayırmak için. Hücreleri yeni kültür kaplarına aktarırken, düşük bir tohumlama yoğunluğu elde etmek için uygun boyutta şişeler seçtiğinizden emin olun.

Bu, daha fazla genişlemeye yardımcı olacaktır. Laboratuvarımız genellikle 20'den fazla büyük koloniden dölleri dört iki yüz yirmi beş santimetre karelik şişelere ayırır. Ortamın üçte birini haftada iki kez değiştirmeyi unutmayın.

Bir sonraki bölümde MSC genişletmesi için benzer bir protokol kullanılır. Üç ila yedi gün geçtikten sonra, bağlı dokunun yakınında iğ şeklindeki hücrelerin görünümünü kontrol etmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Yeterli hücre büyümesi olduğunda, parçalar plastikle temasını kaybettikçe yapışma eğilimindedir.

10 ila 12 gün sonra doku parçalarını çıkarın. Bir tripsin EDTA çözeltisi kullanarak MSC'leri plastikten ayırın ve hücreleri, hücre genişlemesi sırasında düşük tohumlama yoğunluğunu garanti etmek için uygun boyut ve sayıda yeni orta önceden doldurulmuş kültür şişelerine aktarın. Her iki hücre tipi de genişledikten sonra, ortamın üçte birini haftada iki kez değiştirmek gerekecektir.

Progenitör fenotiplerin göstergesi olan hücre yüzeyi marker ekspresyonunu tespit etmek ve hematopoetik hücrelerle kontaminasyon olmadığını belirlemek için boyama ve ardından akış sitometrisi yapılabilir. Tek koloni büyümesini garanti etmek için hücre kültürü plakalarında santimetre kare başına üç veya 10 hücrelik çok düşük kaplama yoğunluğunda saf hasat edilmiş e CFC'leri tohumlayın 14 gün sonra ortamın üçte birini haftada iki kez değiştirin. Kültürün sonu.

Ortamı çıkarın. PBS ile iki kez yıkayın ve kolonileri buz gibi soğuk fiksasyon solüsyonu ile sabitleyin Buzdolabında 15 dakika boyunca fiksasyon solüsyonunu atın ve plakaları 10 dakika kurumaya bırakın. Hücreleri 10 dakika boyunca damıtılmış su ile yeniden sulandırın.

Harris Hematin solüsyonu ekleyin ve sabit kolonileri 12 dakika boyayın. Hematin çözeltisini çıkarın ve plakaları musluk suyuyla durulayın. Kalan lekelenme çözeltisinden kurtulmak için.

Stereo mikroskop kullanarak her koloninin fotoğraflarını çekin ve jpeg veya TIFF formatındaki dosyaları bilgisayarınıza aktarın. Fotoğrafları image J yazılımıyla açın ve aşağıdaki animasyonda açıklandığı gibi her koloninin doğru hücre sayısını analiz edin. Image J yazılımını açın ve açılır menüdeki dosya açma işlevini kullanarak bir koloni görüntüsünü içe aktarın.

İşlemi kullanarak devam edin. Arka plan işlevini çıkarın. Koloni kenar boşluğunu işaretlemek için görüntü J menüsündeki eliptik veya fırça seçim işlevini kullanın.

Dışını temizle işlevini kullanarak çevredeki görüntüyü temizleyin ve görüntü kırpmayı seçerek resmi kırpın. Görüntü ayarlama eşiği işlevini kullanarak eşiği manuel olarak ayarlayın, böylece tüm hücreler tamamen renklendirilir. Kırmızı. Seçerek koloninin hücre sayısını sayın.

Analiz edin, parçacıkları analiz edin. Her hücre türü için en iyi duruma getirilmiş uygun ayarları seçin ve Doğru yapılırsa tamam'ı seçin. Bu protokol, aynı kordondan türetildikleri için birbirlerine otolog olan insan endotelyal ve mezenkimal progenitör hücrelerinin özelliklerini paylaşan neredeyse saf bir hücre popülasyonunun izolasyonuna izin verir.

Beşinci günden itibaren, iğ şeklindeki mezenkimal hücreler, kültür plakasına bağlı kordon parçasının altından görünecektir. Bir ila iki gün sonra, progenitör hücreleri veya e CFC'leri oluşturan endotelyal koloninin ilk kümeleri, ters çevrilmiş bir mikroskop altında görünür hale gelecektir. Hızla büyüyen bu dev e CFC kolonisi 11 gün sonra oluştu.

Hem MSC'ler hem de E CFC'ler geçilebilir, daha da genişletilebilir. Uygun fenotipi doğrulamak için akış sitometrisi kullanılarak tüm kültür ürünlerinin müteakip bir analizini öneririz. Lütfen hem endotel hem de mezenkim soylarının CD 73, CD 1 46, CD 29 ve CD 1 0 5'e özgü antikorlara tepki verdiğini unutmayın.

MSC'lerin, bir anti CD 90 antikoru kullanılarak tespit edilen uyluk birini ifade ettiğine dikkat edin. E CFC'ler, trombosit endotel hücre adezyon molekülü veya pcam olarak da adlandırılan CD 31 için pozitiftir. E CFC'ler tarafından kordondaki CD 34 immünoreaktivite ekspresyonunun tekrarlanan kültür yoluyla azaltılabileceği iyi bilinmektedir.

CD 45, H-L-A-D-R ve CD 14 gibi kan hücresi belirteçleri her iki hücre tipi için de negatif kalmıştır. E CFC'ler arasındaki progenitör hücre hiyerarşisi, her bir koloninin doğru hücre sayıları sayılarak Image J yazılımı kullanılarak değerlendirilebilir. Bu prosedürü yaparken topuzları ve ECE'leri bir insan göbek kodundan nasıl izole edeceğinizi, genişleteceğinizi ve analiz edeceğinizi gösterdik.

Steril koşullarda çalışmak ve sonraki çalışmalarda hücreleri kullanmadan önce fenotip ve saflığı kontrol etmek önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.