Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu
9 Ekim 2009
Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.
Bu teknikte cam lameller, inert ve biotin peg moleküllerinin bir karışımı ile fonksiyonel hale getirilir. Bu işlevselleştirilmiş yüzey ile bir akış hücresi oluşturulur ve bir çim mikroskobu üzerine yerleştirilir. Biyotinillenmiş yuvarlanma çemberi şablonları, çok değerlikli streptavidin kullanılarak yüzeye tutturulur.
Substratlar, repli zonu proteinleri ve nükleotidlerin eklenmesiyle çoğaltıldığında, elde edilen çift sarmallı DNA, laminer akışla uzatılır ve bir harmanlama arası boya kullanılarak gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Merhaba, ben Harvard Tıp Fakültesi Biyolojik Kimya ve Moleküler Farmakoloji Bölümü'nde Antoine Van Ian'ın laboratuvarından Nathan Tanner. Ben de Van Noian laboratuvarından Joe Laro.
Bugün size tek molekül düzeyinde gerçek zamanlı olarak DNA replikasyonunun floresan görüntülemesi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, bireysel replikasyon komplekslerinin koordineli DNA sentezi aktivitelerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.
Bu prosedüre başlamak için, biyotinile edilmiş kuyruk oligosunu M 13 tek sarmallı DNA'ya anilleyin, TBS tamponunda 65 santigrat dereceye kadar on kat fazla oligo ekleyin, ardından yavaş soğutmanın astarı düzgün bir şekilde aneelmesine izin vermek için ısı bloğunu kapatın. Artık asal M 13 hazır olduğuna göre, onu D NDP'ler ve magnezyum klorür içeren 64 nanomolar T yedi DNA polimeraz ve T yedi replikasyon tamponu karışımına ekleyin ve reaksiyonu 37 santigrat derecede 12 dakika inkübe edin. Kuluçka sonunda 100 milimolar EDTA ile söndürün.
Daha sonra, doldurulmuş ürün DNA'sını fenol izoamil alkol kloroform ile saflaştırın, ekstraksiyon ve TE tamponuna veya başka bir uygun depolama tamponuna diyalize edin, her bir organik fazı geri ekstrakte edin, böylece astarlanmış herhangi bir kalıntıyı geri kazanın. Diyalizden sonra M 13 UV vis spektrofotometresi ile DNA konsantrasyonunu belirleyin. Şablon hazırlamanın bir yinelemesi, yüzlerce ila binlerce tek molekül deneyi için yeterli nanomolar şablon konsantrasyonu sağlayabilir.
Artık DNA hazır olduğuna göre, işlevselleştirilmiş kapak fişlerini hazırlamaya devam edin. Kopyalanacak DNA, Amil Lane ile işlevselleştirilmiş cam örtü fişlerine tutturulur, Amil'in Oxy grubu cama bağlanır ve biyotinile edilmiş peg moleküllerini bağlamak için bir amin bırakır. Bu kaplama, yüzeye spesifik olmayan bağlanmayı azaltmaya yardımcı olur.
Cam kapak fişlerini iyice temizlemek için, bunları boyama kavanozlarına koyun ve kavanozları etanol sonikat ile doldurun. 30 dakika boyunca kavanozları durulayın ve 30 dakika boyunca bir molar potasyum hidroksit Sonicate ile doldurun ve her iki yıkamayı da tekrarlayın. İlk işlevselleştirme reaksiyonu için, tüm su izlerinin giderilmesi gerekir.
Boyama kavanozlarını asetonla doldurun ve 10 dakika boyunca sonikat yapın. Kavanozları boşaltın ve tekrar asetonla doldurun. Sinüs reaktifini kavanozlara eklemeye devam edin ve iki dakika çalkalayın.
Sonra çok fazla su ile söndürün. Daha sonra kapak fişlerini 110 derecelik fırında 30 dakika fırınlayarak kurutun. Daha sonra, PEG karışımını, kapak fişlerinin ayrılmasına izin verecek bir cam kapak kayma ara parçası da dahil olmak üzere, hacim başına yaklaşık% 0.2 ağırlıkta hazırlayın, 100 mikrolitreyi kuru silolanmış bir kapak fişine pipetleyin.
Üstüne ikinci bir kapak fişi yerleştirin. Kapak fişlerini PEG çözeltisinde üç saat inkübe edin. Daha sonra her bir kapak fişi çiftini ayırın ve suyla iyice yıkayın.
Sadece bir tarafı dübel ile kaplanacağından, kapak fişlerini çalışır durumda tutmaya dikkat edin. Son olarak, kapak kızaklarını basınçlı hava ile kurutun ve vakum altında kurumuş bir yerde saklayın, yüzeyler en az bir ay boyunca sabit kalır. Böylece bir partide düzinelerce kapak fişi yapılabilir ve gerektiği gibi kullanılabilir.
Artık kapak fişleri hazır olduğuna göre, tek molekül deneyi için akış odası monte edilebilir. Daha sonraki adımlar için hava kabarcıklarını gidermek için BSA içeren 20 ila 25 mililitre bloke edici tamponu bir kurutucu içine yerleştirerek başlayın. Daha sonra, 25 mikrolitre streptavidini 100 mikrolitre PBS içinde seyreltin ve çözeltiyi, streptavidinin odanın diğer kısımlarını hazırlarken yüzey biyotinine bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca işlevselleştirilmiş bir mandalın yüzeyine yayın.
Kapak kızağı inkübe edilirken, akış odasını monte etmek için kullanılan kuvars sürgünün boyutuna uyacak şekilde her iki tarafı destekli bir çift taraflı bant parçası kesin. Bant üzerindeki boru deliklerinin konumunu bir kalemle işaretleyin, böylece bant üzerine akış odasının bir taslağı çizilebilir. Delikleri işaretledikten sonra, işaretlerin etrafına iki milimetre genişliğinde bir dikdörtgen yapın.
Bu dikdörtgen akış kanalı görevi görecektir, bu nedenle düz kenarlar yaptığınızdan ve boru girişi ve çıkışının etrafında boşluk bıraktığınızdan emin olun. Şimdi işaretli bandı çizilen anahat boyunca kesin ve kanala hiçbir yapıştırıcının çıkmadığından emin olmak için düz temiz kesimler yapın. Önceki deneylerde kullanılan akış hücresi yapısından yapıştırıcıyı çıkarmak için kuvars slaytı aseton kullanarak iyice temizleyin.
Kanal anahattının en iyi hizalamasını bulun. Yapışkan desteğin bir tarafını çıkarın ve bandı dikkatlice saha sürgüsüne yerleştirin. Giriş ve çıkış deliklerinin engellenmemiş kalması gerektiğinden bandı düzgün bir şekilde hizalamaya dikkat edin.
Daha sonra, akış hücresinin girişi ve çıkışı için 0,76 milimetre borunun boru kesim uzunluklarını hazırlayın. Tüpün ucunun yaklaşık 30 derecelik bir açıyla kesilmesine yardımcı olur, böylece tüp hazne tabanına düz bir şekilde bastırmaz. Sonraki adımlarda akış hücresine kolay bağlantı için hortumu test tüpü raflarına asın.
Şimdiye kadar kapak kayma inkübasyonu tamamlanmıştır. Strep avid ENC kaplı kapak kızağını suyla iyice durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurulayın. Yalnızca bir tarafı işlevsel olduğu için kapak kızağını ters çevirmemeye dikkat edin.
Son olarak, bant desteğinin diğer tarafını çıkararak ve kuvars sürgüyü kapak kızağına yerleştirerek akış odasının montajını tamamlayın. Yapıştırıcıda sıkışan havayı dışarı atmak için kapak sürgüsüne hafifçe bastırın. Bu, herhangi bir hava kabarcığının akış kanalına girmesini önlemeye yardımcı olacaktır.
Haznenin kenarlarını epoksi ile kapatın. Kesilen boruyu kuvarsın deliklerine yerleştirin ve epoksi ile yerine kapatın ve birkaç dakika kurumasını bekleyin. Epoksi conta kuruduğunda, yüzeyi engellemeye başlayın.
21 gauge iğne kullanarak. Gaz giderme engelleme tamponunun bir kısmını tüplerden birinden çekin. Hava kabarcıklarını gidermek için birkaç kez yıkayın ve tek molekül replikasyonuna geçmeden önce haznenin en az yarım saat inkübe etmesine izin verin. Deney.
Artık akış hücresi bloke edildiğine göre, onu mikroskop tablasına yerleştirin. Hazneyi sahne klipsleri ile yerinde tutun ve akış kanalının y ekseni boyunca hizalandığından emin olun. Daha büyük çaplı bir bağlantı borusu kullanarak akış hücresi çıkış borusunu şırınga pompasına bağlayın.
Girişi engelleme tamponuna yerleştirin ve tüpteki havayı çıkarmak için şırıngayı geri çekin. Çıkış borusunun hafif bir hareketi, akış hücresinde sıkışan hava kabarcıklarının temizlenmesine yardımcı olacaktır. Şimdi DNA'yı ekleyin, DNA'nın iyi bir yüzey kaplamasına izin vermek için stok DNA şablonunu 30 dakika boyunca dakikada 0.025 mililitre gibi ılımlı akış hızında odaya bir mililitre bloke edici tampon akışında 25 pikomolara seyreltin.
DNA hazneye girdikten sonra, en az 200 akış hücresi hacmi için bloke edici tampon yıkama kullanarak fazla DNA'yı yıkayın. Tüm serbest DNA'dan kurtulmak için lazeri ve kamerayı açın. Soğutulmuş CCD'nin kullanılmadan önce sıcaklığa ulaşması gerekir.
Fazla DNA'yı yıkadıktan ve replikasyon tamponunun gazını aldıktan sonra, replikasyon reaksiyonu karışımını, nükleotidleri, DTT'yi ve replikasyon tamponunu sitoksini hazırlayın. Sonra proteinleri ekleyin ve hafifçe karıştırın. Daha sonra reaksiyon karışımını akış hücresine akıtın.
Buradaki akış hızının, çift sarmallı DNA'yı iki milimetre genişliğinde germek için yeterli olması gerekir. 100 mikrometre boyunda akış kanalı Dakikada 0.04 mililitre iyi çalışıyor. Karışımın hazneye girmesi için yaklaşık 10 dakika zaman tanıyın.
Görüş alanını kanalın yan tarafına getirin ve odaklama için yüzeye yakın olduğundan emin olmak ve görüntülemeye başlamak için yapışkan malzemeye odaklanın. Lazer güç mikroskobu odağını ve çim açısını ayarlayın. Lekeli DNA'nın herhangi bir foto bölünmesini önlemek için gücü düşük tutun.
DNA replikasyon hızına bağlı olarak birkaç dakika boyunca saniyede bir ila beş kare elde edin. Daha uzun replikasyon yörüngeleri elde etmek için tekrarlayın veya neredeyse tüm reaksiyon karışımı hücreye pompalandığında daha fazla molekül görmek için yeni bir alana geçin, diğer görüş alanlarını görmek için daha fazla sit ile daha fazla tampon halinde akar. Farklı replike moleküllerin birden fazla görüntüsünü almak, üretkenlik belirleme için istatistikler sağlar.
Yuvarlanan dairede. Replikasyon testi, önde gelen kuvvet sentezi, daireyi ve yüzeyi birbirine bağlayan kuyruğu uzatır, kuyruk, gecikmeli iplikli polimeraz tarafından çift sarmallı DNA'ya dönüştürülür ve gösterilen laminer akışla gerilir. İşte 532 nanometre uyarımında cyt turuncu ile örnek bir görüş alanı.
Küçük floresan noktalar, bağlanmış kopyalanmamış substratlardır. Ürünlerin aşırı uzunluğuna ve alan başına çok sayıda ürüne dikkat edin. Tipik bir görüş alanı, 37 santigrat derecede lekeli DNAE Coli deneylerinin büyüyen parlak çizgileri olarak görülebilen çok sayıda replikasyon molekülünü gösterecektir, yüzey yoğunluğuna bağlı olarak alan başına beş ila 50 molekül verir.
T yedi repla bölgesi çok daha verimli bir şekilde başlar ve bir alandaki moleküllerin %50'sinden fazlasını çoğaltır. Bu kadar yüksek bir yoğunlukla, burada görüldüğü gibi tek tek molekülleri çözmek zordur. Bu nedenle, T yedi deneyini daha düşük protein konsantrasyonlarında veya yüzey yoğunluğunda gerçekleştirin E coli'den tipik replike moleküllerin çan grafikleri ve T yedi deneyleri, e coli ve T yedi'den gelen moleküllerin uç nokta yörüngelerini içerir, bu örnekte e coli için saniyede 467.1 baz çifti ve saniyede 99.4 baz çifti olan replikasyon oranlarını elde etmek için yörüngelerin doğrusal regresyon ile donatıldığı zamana karşı çizilir.
T yedi için, tek gausslara uyan tek molekül yörüngelerinin hız dağılımları, e coli için saniyede ortalama 535.5 artı veya eksi 39 baz çifti ve saniyede 75.9 artı veya eksi 4.8 baz çifti verir. T yedi için, replikasyon ürünlerinin uzunluk dağılımları, e coli için 85.3 artı veya eksi 6.1 kilobaz çifti ve G yedi için 25.3 artı veya eksi 1.7 kilobaz çifti olan üretkenlik elde etmek için tek üstel bozunma ile uyumludur. O zaman size tek moleküllerle koordineli DNA replikasyonunu nasıl ölçeceğinizi gösterdik.
Bu prosedürü yaparken, kapak fişlerini uygun şekilde işlevsel hale getirmeyi ve temiz düz akış kanalları yapmayı unutmamak önemlidir. Lazer güç yükünü koruduğunuzdan ve uzun DNA'nın foto bölünmesini en aza indirdiğinizden emin olun. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
Genel Bakış
Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replikazların DNA replikasyonunu görselleştirmek için basit bir tek hücreli floresan mikroskopi tekniğini gösterir. Yöntem, araştırmacıların tek molekül seviyesinde DNA sentezinin koordineli aktivitelerini incelemelerine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyolojik Kimya
- Moleküler Farmakoloji
Arka Plan
- Tek hücreli floresan mikroskopi, DNA replikasyonu hakkında bilgiler sağlar.
- Replikazom dinamiğini anlamak, DNA sentezini incelemek için çok önemlidir.
- Bu teknik, gelişmiş görüntüleme için işlevselleştirilmiş yüzeyler kullanır.
- DNA replikasyonunun gerçek zamanlı gözlemlenmesi karmaşık biyolojik süreçleri ortaya çıkarabilir.
Çalışmanın Amacı
- Bireysel replikazların DNA replikasyonunu görselleştirmek.
- DNA sentezinin gerçek zamanlı görüntüleme protokolünü geliştirmek.
- Replikasyon kompleks aktivitelerinin incelenmesini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Cam kapakların biotin peg molekülleri ile işlevselleştirilmesi.
- Tek molekül deneyleri için bir akış hücresi oluşturma.
- Biotinleştirilmiş yüzük şekilli şablonların yüzeye bağlanması.
- DNA replikasyonu sırasında enterkalan boyalar kullanılarak gerçek zamanlı görüntüleme.
Ana Sonuçlar
- DNA replikasyon süreçlerinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Protokolün gerçek zamanlı görüntülemede etkinliğinin gösterilmesi.
- Bireysel replikasyon komplekslerinin koordinasyonu hakkında bilgiler.
- Gelecek çalışmalar için güvenilir bir yöntemin kurulması.
Sonuçlar
- Protokol, DNA replikasyonunun ayrıntılı gözlemlenmesini sağlar.
- DNA sentezi dinamiğinde daha ileri araştırmalar için bir temel sağlar.
- Tek molekül teknikleri, moleküler biyolojiyi anlamamızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This single-molecule DNA replication assay provides direct visualization of replisome dynamics, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in DNA synthesis. By quantifying replication rate and processivity at the individual molecule level, the method supports target validation and lead identification in oncology and antiviral programs where replication fidelity is a key determinant of drug response. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular mechanism to functional output, informing go/no-go decisions before substantial investment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by directly observing replication complex activity and coordination.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of replication rate and processivity as functional readouts of target engagement.
- Scientific Value: Clarifies pathway-specific effects of perturbations on DNA synthesis machinery, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with defined replication kinetics for downstream compound screening.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs (rate in bp/s, processivity in kb) enabling assay reproducibility and cross-laboratory comparability.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness by providing a sensitive, real-time readout of replication inhibition or stimulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems where dysregulated replication contributes to pathology, such as in cancer or viral infection models.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by maintaining consistent mechanistic readouts.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking target modulation to measurable changes in replication dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, providing mechanistic insights that bridge biochemical and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing real-time activities of individual replication complexes under defined conditions.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, real-time measurements of DNA synthesis that are amenable to high-content analysis and compound library screening.
- Analytics: Generates precise measurements of replication rate (bp/s) and processivity (kb) via linear regression and exponential fitting of single-molecule trajectories, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a functional readout of replication fidelity that correlates with cellular proliferation and genome stability phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability for evaluating replication-targeting agents across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in DNA synthesis pathways through direct observation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via surface-functionalized flow cells and real-time imaging protocols that minimize variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by delivering early, mechanism-based efficacy signals that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on replication dynamics, supporting capital-efficient advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy, surface functionalization, and DNA biochemistry.
- Needs a fluorescence microscope with sensitive camera, laminar flow control, and intercalating dye compatibility for real-time visualization.
- Demands cross-team standardization of surface preparation, flow cell assembly, and imaging parameters to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for different template designs, protein concentrations, and buffer conditions to optimize molecule density and signal-to-noise.
- Practical limitations include the need to manage photo damage at high laser power and challenges in resolving high-density replication events without dilution or lower surface coverage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:42
Introduction
1:11
Preparing the DNA Replication Template
5:46
Assembling the Flow Chamber
2:44
Preparing Functionalized Coverslips
10:03
Single-Molecule Replication Experiment
13:18
Single Molecule DNA Replication Data Analysis and Representative Results
15:00
Conclusion
