Name: Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Öğrenin, tek molekül floresan mikroskopi ile DNA replikasyonunu gerçek zamanlı görselleştirme yöntemini. Bireysel replizomların koordineli aktivitelerini inceleyerek moleküler biyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Samir Hamdan, bu tekniğin geliştirilmesi destekli E. coli proteinler Prof. Nick Dixon laboratuar, Wollongong Üniversitesi ve T7 proteinler, Harvard Tıp Fakültesi&#39;nden Prof. Charles Richardson . Çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (AMvO için GM077248) ve Jane Tabut Childs Vakfı (JJL) tarafından desteklenmektedir.

Tek bir molekül çoğaltma deneyi yapmadan önce, birkaç malzemeleri önceden hazırlıklı olmak gerekir. 1. DNA replikasyonu Şablonu Çoğaltma reaksiyonu substrat standart moleküler biyoloji teknikleri 1,2 kullanılarak hazırlanmış bir biotinlenmiş, kuyruklu M13 yuvarlanma daire. Malzemeler: M13mp18 tek iplikli DNA, biotinlenmiş kuyruk oligonükleotid astar (5&#39;-Biotin-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), T7 DNA polimeraz, Isı blok, izoamil / Fenol Alkol / Kloroform <ol><li> TBS tampon (330 nM kuyruk oligo, 33 nM M13) oligo 10 kat daha fazla ekleyerek, M13 biotinlenmiş kuyruk oligo Tavlama. </li><li> 65 ° C ısı bloğu karışımı ısıtın. Isıtmalı, ısı bloğu kapatın ve yavaş soğutma astar düzgün tavlama için izin. </li><li> Astarlanmalıdır M13 64 nM T7 DNA polimeraz ve T7 çoğaltma tampon dNTP ve MgCl 2 içeren bir karışıma ekleyin. </li><li> 37 ° C de 12 dakika reaksiyon inkübe ve 100 mM EDTA ile soğutun. </li><li> Purify doldurulmuş ürün DNA, fenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu ve TE tampon ya da başka bir uygun depolama tampon dialyze ve DNA konsantrasyonu (M13 astarlanmalıdır herhangi bir kalıntı kurtarmak için her organik faz geri-extract) belirlemek. </li><li> Bir şablon hazırlık iterasyon kolayca tek-molekül deneyler binlerce yüzlerce yeterli, nanomolar konsantrasyon şablonu birkaç mililitre yapabilirsiniz. </li></ol> 2. Fonksiyonlu lameller DNA cam lamel eklemek için, cam, daha sonra biotinlenmiş PEG moleküllere birleştiğinde bir aminosilane, ilk işlevselleştirildiyse. Bu kaplama yüzeyi 1,3 ile non-spesifik etkileşimler, DNA ve çoğaltma proteinler azaltmaya yardımcı olur . Malzemeler: Cam lamelleri, Boyama kavanoz, 3-aminopropyltriethoxysilane, metoksi-PEG5k-NHS ester, Biotin-PEG5k-NHSester, Aseton, 1M KOH, Etanol, Fırın, Banyo sonikatör <ol><li> Cam kavanoz boyama ve etanol ile kavanoz dolum onları yerleştirerek lamelleri iyice temizleyin. 30 dakika boyunca sonikasyon ve kavanoz yıkayın ve 1 M KOH ile doldurun. 30 dakika hem yıkar tekrarlayın sonikasyon. </li><li> Ilk işlevsellik tepki için, tüm su izlerini kaldırılması gerekir. 10 dakika aseton ve sonikasyon kavanozları doldurun. Aseton ile kavanoz tekrar durulayın. </li><li> 2% v / v aseton silan reaktif bir çözüm hazırlayın. Boyama kavanoz ekleyin ve 2 dakika boyunca ajitasyon. Bu reaksiyon çiftler cam aminosilane alkoksi grup, bir sonraki kaplin adım için bir reaktif amin bırakarak. Büyük bir su fazlalığı ile reaksiyon Quench. </li><li> 110 ° C&#39;de 30 dakika fırında pişirme tarafından lamelleri kurulayın. </li><li> 100 mM NaHCO 3 pH 8.2 50:1 metoksi: biotin PEG karışımı hazırlayın. Amaç yaklaşık% 0.2 w / v biotinlenmiş PEG. </li><li> Pipet 100 mcL kuru Silanlanmış lamel ve yer üstünde başka bir lamel üzerine PEG karışımı. Bir cam lamel spacer dahil lamelleri ayrılması sağlayacaktır. </li><li> 3 saat PEG çözüm lamelleri inkübe edin, sonra her çift lamelleri ayrı ve suyla iyice yıkayın. Sadece bir kez yan PEG ile kaplı olacak gibi lamelleri yan Fonksiyonlu tutmak için dikkatli olun. </li><li> Vakum altında lamelleri ve mağaza kurulayın. Yüzeyler en az ayda bir sabit kalır, bu yüzden onlarca lamelleri bir toplu yapılan ve gerektiği gibi kullanılabilir. </li></ol> Bu malzemeler, vaktinden önce ve sonra her bir deney için kullanılan olmalıdır. Her tek-molekül denemeyi başlatmak için, akış odasına montaj başlar. 3. Akış Odası Hazırlık Deney Fonksiyonlu lamel, çift taraflı bant, kuvars slayt ve boru ile yapılan basit bir akış odası kullanılarak yapılır. Bir akış odası, tek tek her molekülün deney 1,4 için hazırlanmıştır. Malzemeler: Çift taraflı bant, Razor bıçak, boru, Hızlı kuru epoksi delikli Kuvars slayt işlevselleştirildiyse lamel (bkz. yukarıda), Streptavidin çözümü (1 mg / mL PBS içinde 25 mcL), Boru, tampon Engelleme (20 mM Tris pH: 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.2 mg / ml BSA,% 0.005 Tween-20) <ol><li> Sonraki adımlar için herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için bir desikatörde 20-25 mL engelleme tampon koyarak başlayın. </li><li> PEG-Fonksiyonlu lamel alın ve PBS-seyreltilmiş streptavidin çözüm yüzey üzerinde 125 yayıldı. Streptavidin yüzey biotins bağlamak için izin odasının diğer bölümlerine hazırlarken, 20 dakika boyunca inkübe bırakın. </li><li> Çift taraflı bir parçasınıd bant kuvars slayt boyutuna uyacak. Akış odasının bir taslak bant (1 mg / ml) çizilebilir, böylece bir kalem ile kaset üzerine boru delik konumunu işaretleyin. </li><li> Delikleri etrafında 2 mm genişliğinde dikdörtgen olun. Bu akış kanalı olarak hizmet verecek, bu yüzden etrafında düz saplı boru giriş ve çıkış yapmak ve odayı terk emin olun. İsterseniz, birden fazla kanal ya da farklı boyutlarda kullanılabilir. </li><li> Kanal içine herhangi bir yapışkan çıkıntı emin olmak için düz ve temiz kesim, çizilen taslak boyunca kesin. </li><li> Kuvars iyice kullanarak aseton veya etanol önceki akış hücresi inşaat yapıştırıcı çıkarmak için temizleyin. </li><li> Kanal anahat iyi hizalama, bir tarafı yapışkanlı arka kaldırmak ve kuvars slayt üzerine bandı dikkatlice yerleştirin. Giriş ve çıkış delikleri unblocked kalmaya ihtiyacı gibi, bant düzgün hizalamak için dikkatli olun. </li><li> Akış hücresi giriş ve çıkış boru uzunlukları kesin. Bu tüp odası dibine düz basın böylece ilgili bir 30 ° açı tüp sonuna kesmek için yardımcı olur. Sonraki adımlar akış hücresi kolay eki için askıya destek çeşit tüpler yerleştirin. </li><li> Streptavidin kaplı lamel su ile iyice durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurutun. Yalnızca tek taraflı Fonksiyonlu olduğunu unutmayın; lamel üzerinde açmak için dikkatli olun. Teyp yedekleme diğer tarafına çıkartın ve kuvars slayt lamel üzerine yerleştirin. </li><li> Yapıştırıcı sıkışıp herhangi bir hava hafifçe dışarı itmek için lamel basın. Bu akış kanalı içine almak herhangi bir hava kabarcıkları önlemeye yardımcı olacaktır. </li><li> Epoksi ile odasının yanında Seal. Kesilmiş boru epoksi ile kuvars ve mühür deliklere yerleştirin. Bu, birkaç dakika kurumasını gerekiyor. </li><li> Kuruduktan sonra, bazı gazlar engelleme tampon tüplerinden biri aracılığıyla çekerek yüzey engelleme başlar. 21-gauge iğne, 0,76 mm boru içinde mükemmel uyum sağlar. Hava kabarcıklarını çıkarmak için birkaç kez yıkayın ve odasının en az yarım saat süreyle inkübe izin. </li></ol> 4. Tek Molekül Çoğaltma Deney Malzemeler: Hazır akış odası, SYTOX Portakal, TIRF mikroskop, 532 nm lazer, CCD kamera, görüntü elde etme yazılımı ile bilgisayar, Rolling daire DNA substrat Çoğaltma proteinleri <ol><li> Akış hücresi bloke edildikten sonra, her şeyi tek-molekül denemenize başlamaya hazır. </li><li> Akış hücresi ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin. Sahne klipler ile yerine oda tutun ve akış kanalı düz y ekseni boyunca yerleştirilmiş olduğundan emin olun. </li><li> Daha büyük çaplı bir konektörü tüp veya bir iğne kullanarak şırınga pompası akış hücresi çıkış borusunun bağlayın. Tampon engelleme giriş yerleştirin ve şırınga, tüp içindeki herhangi bir havayı çıkarmak için geri çekin. Çıkış borusunun nazik bir fiske akış hücresi sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcığı temizlenmesine yardımcı olacaktır. </li><li> 1 ml engelleme tampon stok DNA şablonu pM 25 sulandırınız. DNA iyi bir yüzey kaplama izin orta akış hızında odasına Akış. 0.025 ml / dk 30 dakika iyi çalışır. Bu lamelleri her parti için yüzeyde ya da deney için kaç istenilen kaç DNA molekülleri dayalı çeşitli olabilir. </li><li> DNA sonra, aşırı DNA engelleme tampon kullanarak yıkayın. Tüm serbest DNA kurtulmak için en az 200 akış hücre hacimleri için yıkayın. </li><li> Çoğaltma tampon gaz alma başlayın. E. için coli çoğaltma deneyler, bunu 37 ° ° C ısıtılmış akış odasında kabarcıkları riskini azaltmak için. </li><li> Lazer ve kamera açın. Soğutmalı CCD kullanılmadan önce sıcaklığa ulaşması gerekiyor. </li><li> Eğer 37 ° C deney yapan, ısıtıcı açmak. Amacı, akış hücresi ile temas ya da daha sonra bir ısı banyosu olacaktır emin olun. </li><li> Yıkama ve gaz alma sonra, reaksiyon hazırlanabilir. Mix nükleotidler, DTT ve çoğaltma tampon SYTOX. Sonra proteinler ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> Akış hücresi içine reaksiyon karışımının akış. Bu akış hızı dsDNA germek için yeterli olması gerekir. 2 mm genişliğinde, 100 mikron uzun boylu akış kanalı için 0.04 ml / dak iyi çalışır. </li><li> Karışımı için odasına girin ve görüntüleme başlamak için zaman tanıyın. Iyi bir ipucu, kanalın yan görüş alanını taşımak ve yapıştırıcı malzeme odaklanmak. Bu odaklama için yüzeye yakın sağlayacaktır. </li><li> Lazer gücü, mikroskop odak ve TIRF açısını ayarlayın. Lekeli DNA herhangi bir photocleavage önlemek için düşük güç tutun. DNA replikasyon oranına bağlı olarak birkaç dakika için 1-5 kare / saniye edinin. Arzu edilirse, daha uzun çoğaltma yörüngeleri ya da daha fazla molekülleri görmek için yeni bir alana taşımak için tekrarlayın. </li><li> Reaksiyon karışımı neredeyse boş sonra, S ile daha fazla tampon akışı iyi bir fikirdirYTOX bakış diğer alanlarını görmek için. Farklı çoğaltılır moleküllerin birden fazla görüntü almak processivity belirlenmesi için istatistikleri sağlar. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Aktif kopyalayan moleküller kolayca boyanan DNA büyüyen çizgiler olarak görülür. Deneylerde, M13 substrat 25 pM akan bir görüş 60x, 125 mm x 125 mm alan (Şekil 1) 100-1000 molekülleri verir. E. kullanarak çoğaltma deneyler az 37 coli replisome proteinler ° C (Ayrıntılar için malzemeler), görüş alanı başına 5-50 kopyalayan moleküller verir . T7 replisome, çok daha verimli yüzey başlatan eşdeğer konsantrasyonlarda, biz bir alan çoğaltmak moleküllerin&gt;% 70 gözlemlemek. Bu koşullar, tek tek moleküllerin çözmek ve analiz etmek için zor olduğu kadar yüksek bir ürün yoğunluğu verim, böylece daha az protein konsantrasyonları T7 deneyler yapılmaktadır. Veri Analizi: oran veri elde etmek için, sadece DNA vs zaman son nokta arsa ve eğimi hesaplamak (Şekil 2) . Processivity için DNA toplam uzunluğu belirler. Bu iki numaraları baz çifti dönüştürülmesi gerekir. Deneme yapmadan önce, uygun büyütme kameranın piksel büyüklüğünü bilmeli. Basepair dönüşüm için iyi bir tahmin sadece DNA kristalografik uzunluğu, 2.9 bp / nm göre dönüştürme. Ancak, laminer akış tamamen DNA streç olmaz, bir DNA uzunluğu kalibrasyon, uzunluğu bilinen DNA, örneğin 48.502 bp λ DNA biotinlenmiş oligo akış hücresi takılarak ve onun SYTOX lekeli uzunluk ölçüm yapılmalıdır çoğaltma deney için kullanılan akış hızı. Baz çifti / piksel sayısını belirleyen çoğaltma oranları ve processivities doğru hesaplama sağlayacaktır. Oranı ve processivity dağılımları (Şekil 2) 1 komplo sağlayan, çok sayıda fotoğraf ve film çekmek çok sayıda ürün molekülünün sağlayacaktır . <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: (Ref itibaren 1) a) haddeleme daire çoğaltma tahlil Cartoon. (SA, streptavidin). Önde gelen iplikli sentezi daire ve yüzey birbirine bağlayan kuyruk uzanır. Kuyruk gecikmeli iplikçik polimeraz dsDNA dönüştürülür ve laminer akış gergin. b) Örnek SYTOX Orange ve 532 nm eksitasyon ile görüş alanı. Küçük floresan noktalar gergin olmayan çoğaltılmış substratlar. Ürünlerin aşırı uzunluğu ve alan başına ürünleri (&gt; 5000 gibi alanlarda her bir akış hücresi içerir) çok sayıda unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: (Ref adapte 1) a, b) T7 (a) ve E. tipik kopyalayan moleküllerin Kymographs coli (b) deneyler. c) a) ve b) moleküllerin Endpoint yörüngeleri zaman karşı çizilen. Yörüngeler çoğaltma oranlarını elde etmek için lineer regresyon ile donatılmıştır. Gösterilen örnekler 99.4 baz puan (bp) -1 ve 467,1 bp s -1. ) 25.3 ± 1.7 kbç (T7), 85.3 ± 6.1 kbç (E. coli: d) çoğaltma ürünleri uzunluğu dağılımları, processivity elde etmek için tek bir üstel bozulma ile uygun . e) tek bir molekül yörüngeleri kuru dağılımları, tek bir Gauss uygun. Şu anlama gelir: 75.9 ± 4.8 bp s -1 (T7), 535,5 ± 39 baz puan (bp) -1 (E. coli).

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

Bir kritik kontrol ilgi çoğaltma proteinler, leke, SYTOX Orange etkisini inceliyor. Bunu yapmanın kolay bir yolu olarak tanımlanan akış hücresi değil SYTOX ihmal çoğaltma deney yapmaktır. Reaksiyon karışımı odasına akardı sonra, DNA boyama ve çoğaltılmış moleküllerin uzunluğu dağılımı incelemek için SYTOX ile tampon ekleyin. Alternatif olarak, standart dökme reaksiyonlar SYTOX çoğaltma hızı ve verimliliği üzerinde herhangi bir etkisi kontrol etmek için kullanılabilir. Burada tarif edilen deney, sadece tek bir akış kanalı kullanır. Bu multi-kanal akışı odaları oluştururken veya PDMS veya benzer mikroakışkan cihazlar kullanarak kolayca değiştirilebilir. Kanal sayısının artırılması, protein konsantrasyonları, mutantlar, ya da inhibitör molekülleri tarama büyük ölçüde kolaylaştırır ve çoğaltma veri toplama hızı artmaktadır. Bahsettiğimiz gibi, E. gerçekleştirmek coli çoğaltma deneyler 37 ° ° C ev yapımı alüminyum akış hücresi ısıtıcı, rezistif bir ısıtma elemanı (kartuş ısıtıcı) ve değişken güç kaynağı. Bu iyi bir sıcaklık kararlılığı sağlar ve objektif bir ısıtıcı satın önler. Isıtıcı kalibre etmek için, biz sadece bir kuvars akışını hücrenin üst merkezinde bir delik delinmiş bir termokupl akış kanalı içine eklenen ve normal olarak tampon akıyordu. Artan gerilimler akış hücresi tampon sıcaklık ölçüm doğru ısıtma sağlar.

T7 Çoğaltma: 5 mM dithiothreitol ile 40 mM Tris, pH 7.5, 50 mM potasyum glutamat, 10 mM magnezyum klorür, 100 mg / ml BSA, 600 mcM dNTP, 300 mcM ATP, 300 mcM CTP, ve 15 nM SYTOX Turuncu hemen önce eklendi kullanın. 5 nM GP4 (hexamer), 40 nM polimeraz (1:1 GP5:: tiyoredoksin), 360 nm gp2.5 1,5 Proteinler olarak eklenir. E. coli Çoğaltma: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnezyum asetat, 80 mM potasyum klorür, 100 mg / ml BSA ile 10 mM dithiothreitol, 40 mcM dNTP, 200 mcM rNTPs, ve 15 nM SYTOX Turuncu hemen önce eklendi. Proteinler eklendi: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ 2 γ 1 δδ&#39;χψ veya τ 3 δδ&#39;χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 Nm PriB, 320 Nm PRIC, 480 nM DNAT 1,6

floresan mikroskop ile görselleştirme tek molekül dna replikasyonu

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Biz tek-molekül düzeyinde DNA replikasyonu gözlemlemek için basit bir floresan mikroskopi tabanlı gerçek zamanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Dairesel, çatallı DNA örneğinin Fonksiyonlu bir cam lamel bağlı ve yaygın çoğaltma proteinleri ve nükleotidler (Şekil 1) girişten sonra çoğaltılır. Büyüyen ürün, çift iplikli DNA (dsDNA) laminer akış ile genişletilmiş ve intercalating boya kullanılarak görüntülenmiştir. Gerçek zamanlı olarak artan DNA sonu pozisyon ölçme çoğaltma oranının kesin tespiti (Şekil 2) sağlar. Ayrıca, tamamlanan DNA ürünlerin uzunluğu çoğaltma processivity raporlar. Bu deney, çok kolay ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilen ve sadece makul ölçüde duyarlı bir kamera ile bir floresan mikroskop gerektirir.

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Tek molekül düzeyinde DNA replikasyonunu gözlemlemek için floresan mikroskopi tabanlı basit bir gerçek zamanlı yöntemi tanımlıyoruz. Dairesel, çatallı bir DNA...

Bu teknikte, cam lameller inert ve biotinli peg moleküllerinin bir karışımı ile fonksiyonelleştirilir. Bu fonksiyonelleştirilmiş yüzeyle bir akış hücresi oluşturulur ve bir TIRF mikroskobu üzerine yerleştirilir. Biyotinillenmiş yuvarlanan çember şablonları, multivalent streptavidin kullanılarak yüzeye tutturulur.Substratlar, replikasyon zon proteinleri ve nükleotidlerin eklenmesiyle kopyalandığında, ortaya çıkan çift sarmallı DNA lamine akışla uzatılır ve bir interkale boya kullanılarak gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Merhaba, ben Harvard Tıp Fakültesi Biyolojik Kimya ve Moleküler Farmakoloji Bölümü'ndeki Antoine Van Elsinkel laboratuvarından Nathan Tanner. Ben de Van Elsinkel laboratuvarından Joe Laro.Bugün size, tek molekül seviyesinde gerçek zamanlı DNA replikasyonunun floresan görüntülemesi için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, bireysel replikasyon komplekslerinin koordineli DNA sentez aktivitelerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Bu prosedüre başlamak için, TBS tamponunda on kat fazla oligo ekleyip 65 °C'ye kadar ısıtarak ve ardından primerin düzgün şekilde tavlanmasını sağlamak için ısıtıcı bloğu kapatıp yavaşça soğumaya bırakarak biotinlenmiş kuyruk oligoyu M 13 tek zincirli DNA'ya tavlayın. Primer M 13 hazır olduğunda, bunu dNDP'ler ve magnezyum klorür içeren 64 nM T7 DNA polimeraz ve T7 replikasyon tamponu karışımına ekleyin ve reaksiyonu 37 °C'de 12 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonunda, 100 mM EDTA ile reaksiyonu durdurun.Ardından, doldurulmuş ürün DNA'sını fenol izoamil alkol kloroform ekstraksiyonu ile saflaştırın ve TE tamponu veya diğer uygun bir saklama tamponu ile diyalize edin; herhangi bir kalıntı primerleştirilmiş M 13'ü geri kazanmak için her bir organik fazı geri ekstrakte edin. Diyaliz sonrası DNA konsantrasyonunu UV-Vis spektrofotometre ile belirleyin. Şablon hazırlamanın tek bir iterasyonu, yüzlerce ila binlerce tek molekül deneyi için yeterli nanomolar konsantrasyonda şablon sağlayabilir.DNA hazır olduğuna göre, fonksiyonelleştirilmiş lamelden kapak camlarının hazırlanmasına geçiniz. Replike edilecek DNA, Amil Lane ile fonksiyonelleştirilmiş cam lamel kapaklara tutturulur; Amil'in Oksi grubu cama bağlanarak biotinillenmiş peg moleküllerinin bağlanması için bir amin grubu bırakır. Bu kaplama, yüzeye olan spesifik olmayan bağlanmanın azaltılmasına yardımcı olur.Cam lamellerini iyice temizlemek için lamelleri boyama kavanozlarına yerleştirin ve kavanozları etanol ile doldurup sonikasyona tabi tutun. 30 dakika sonra kavanozları durulayın ve bir molar potasyum hidroksit ile doldurup 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun; her iki yıkama işlemini de tekrarlayın. İlk fonksiyonelleştirme reaksiyonu için tüm su kalıntıları giderilmelidir.Boyama kavanozlarını asetonla doldurun ve 10 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Kavanozları boşaltın ve tekrar asetonla doldurun. Ardından kavanozlara sine reaktifini ekleyin ve iki dakika boyunca çalkalayın.Ardından, fazla miktarda su ile söndürün. Sonra, lamel camları fırında 110 °C'de 30 dakika pişirerek kurutun. Daha sonra, yaklaşık %0,2 ağırlık/hacim oranında PEG karışımını hazırlayın; lamel camların ayrılmasını sağlayacak bir cam lamel cam ara parçası dahil olmak üzere, kuru silanize lamel cam üzerine 100 µL pipetleyin.Üzerine ikinci bir lamini yerleştirin. Lamineleleri üç saat boyunca PEG çözeltisinde inkübe edin. Ardından her bir lamin çiftini ayırın ve su ile kapsamlı bir şekilde yıkayın.Sadece bir tarafı peg ile kaplanacağı için lamine camların fonksiyonelleştirilmiş tarafının yukarıda kalmasına dikkat edin. Son olarak, lamine camları basınçlı hava ile kurutun ve bir desikatörde vakum altında saklayın; yüzeyler en az bir ay boyunca stabil kalır. Böylece, onlarca lamine cam bir parti halinde hazırlanabilir ve ihtiyaç duyulduğunda kullanılabilir.Lamel camlar hazır olduğunda, tek molekül deneyi için akış hücresi monte edilebilir. Sonraki adımlarda hava kabarcıklarını gidermek amacıyla, öncelikle BSA içeren 20 ila 25 mililitre bloklama tamponunu bir desikatöre yerleştirin. Ardından, 25 mikrolitre streptavidini 100 mikrolitre PBS içinde seyreltin ve çözeltiyi peg ile fonksiyonelleştirilmiş bir lamel camın yüzeyine yayın; hücrenin diğer parçalarını hazırlarken, streptavidinin yüzey biyotinine bağlanması için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.Kapak lam inkübe olurken, çift taraflı bandın arkasından, akış odasını oluşturmak için kullanılan kuvars lamın boyutuna uygun bir parça kesin. Akış odasının taslağı bant üzerine çizilebilecek şekilde, tüp deliklerinin konumlarını bant üzerine kurşun kalemle işaretleyin. Delikleri işaretledikten sonra, işaretlemelerin etrafına iki milimetre genişliğinde bir dikdörtgen çizin.Bu dikdörtgen akış kanalı olarak hizmet edeceğinden, kenarları düz yaptığınızdan ve tüp giriş ile çıkışının etrafında boşluk bıraktığınızdan emin olun. Şimdi, yapıştırıcının kanala taşmadığından emin olmak için düz ve temiz kesikler yaparak, işaretli bandı çizilen taslağa göre kesin. Önceki deneylerde kullanılan akış hücresi düzeneğinden kalan yapıştırıcıları temizlemek için kuvars lamı aseton kullanarak iyice temizleyin.Kanal taslağının en uygun hizalamasını bulun. Yapışkanlı arka yüzün bir tarafını çıkarın ve bandı dikkatlice kort lamı üzerine yerleştirin. Giriş ve çıkış deliklerinin açık kalması gerektiğinden, bandı doğru şekilde hizalamaya özen gösterin.Ardından, akış hücresinin girişi ve çıkışı için 0,76 mm çapındaki borunun uygun uzunluktaki parçalarını hazırlayın. Borunun ucunu yaklaşık 30 derecelik bir açıyla kesmek, borunun hazne tabanına düz bir şekilde baskı yapmasını önlemeye yardımcı olur. Sonraki adımlarda akış hücresine kolayca takabilmek için boruları deney tüpü raflarına asın.Bu aşamada lamelle inkübasyon tamamlanmıştır. Strep-avid ENC kaplı lamelli suyuyla iyice durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurutun. Lamelin sadece bir tarafı fonksiyonelleştirildiği için ters çevirmemeye dikkat edin.Son olarak, bandın diğer tarafındaki koruyucuyu çıkarıp kuvars lamı lamelin üzerine yerleştirerek akış hücresinin montajını tamamlayın. Yapışkan kısmında hapsolmuş havayı dışarı itmek için lamelin üzerine hafifçe bastırın. Bu işlem, akış kanalına hava kabarcığı girmesini önlemeye yardımcı olacaktır.Hazerin yan kısımlarını epoksi ile mühürleyin. Kesilmiş tüpleri kuartz deliklerine yerleştirin, epoksi ile sabitleyip mühürleyin ve birkaç dakika kurumaya bırakın. Epoksi mühür kuruduğunda, yüzey bloklama işlemine başlayın.21 gauge bir iğne kullanarak, Degas bloklama tamponunun bir kısmını tüplerden birinin içinden geçirin. Hava kabarcıklarını gidermek için birkaç kez yıkayın ve tek molekül replikasyon deneyine geçmeden önce haznenin en az yarım saat inkübe edilmesini sağlayın.Akış hücresi bloke edildikten sonra, hücreyi mikroskop tablasına yerleştirin. Tabla klipsleriyle hücreyi sabit tutun ve akış kanalının y ekseni boyunca hizalandığından emin olun. Akış hücresi çıkış tüpünü, daha geniş çaplı bir bağlantı tüpü kullanarak şırınga pompasına bağlayın.Giriş ucunu bloklama tamponuna yerleştirin ve tüpteki havayı boşaltmak için şırıngayı geri çekin. Çıkış tüpüne hafifçe vurmak, akış hücresinde hapsolmuş hava kabarcıklarını temizlemeye yardımcı olacaktır. Şimdi DNA'yı ekleyin; stok DNA kalıbını bir mililitre bloklama tamponu içinde 25 picomolar düzeyine seyrelterek, DNA'nın yüzeyi iyi bir şekilde kaplamasını sağlamak amacıyla 30 dakika boyunca 0,025 mililitre/dakika gibi orta bir akış hızında hücreye aktarın.DNA hazneye girdikten sonra, en az 200 akış hücresi hacmi kadar bloklama tamponu yıkamasıyla fazla DNA'yı yıkayın. Tüm serbest DNA'dan kurtulmak için lazeri ve kamerayı açın. Soğutmalı CCD, kullanılmadan önce hedef sıcaklığa ulaşmalıdır.Fazla DNA yıkandıktan ve replikasyon tamponu gazdan arındırıldıktan sonra, replikasyon reaksiyon karışımı nükleotidleri, DTT ve cytoxin içeren replikasyon tamponunu hazırlayın. Ardından proteinleri ekleyin ve nazikçe karıştırın. Daha sonra reaksiyon karışımını akış hücresine aktarın.Akış hızı, iki milimetre genişliğinde ve 100 mikrometre yüksekliğinde bir akış kanalı için çift sarmallı DNA'yı germeye yetecek düzeyde olmalıdır; 0,04 milliliters per minute bu işlem için uygundur. Karışımın hazneye girmesi için yaklaşık 10 dakika süre tanıyın.Görüş alanını kanalın kenarına getirin ve odaklama için yüzeye yakın olduğunuzdan emin olmak ve görüntülemeye başlamak için yapışkan malzemeye odaklanın. Lazer gücünü, mikroskop odağını ve turf açısını ayarlayın. Boyanmış DNA'nın fotolize uğramasını önlemek için gücü düşük tutun.DNA replikasyon hızına bağlı olarak, saniyede bir ila beş kare hızında birkaç dakika boyunca görüntüleme yapın. Daha uzun replikasyon yörüngeleri elde etmek için işlemi tekrarlayın veya reaksiyon karışımının neredeyse tamamı hücreye pompalandığında, diğer görüş alanlarını görmek için hücreye cyt içeren daha fazla tampon akıtarak yeni bir alana geçin. Farklı replike moleküllerin birden fazla görüntüsünü almak, üretkenlik tayini için istatistik sağlar.Yuvarlanan halka replikasyon analizinde, öncü zincir sentezi, halkayı ve yüzeyi birbirine bağlayan kuyruğu uzatır; kuyruk, geciken zincir polimerazı tarafından çift zincirli DNA'ya dönüştürülür ve gösterilen laminer akışla gerilir. Burada, 532 nanometre uyarımında cyt orange ile bir görüş alanı örneği yer almaktadır.Küçük floresan lekeler, bağlanmış replike olmamış substratlardır. Ürünlerin aşırı uzunluğuna ve alan başına düşen ürün sayısının fazlalığına dikkat edin. Tipik bir görüş alanı, boyanmış DNA'nın büyüyen parlak çizgileri olarak görünen çok sayıda replike olan molekülü gösterecektir. 37 °C'deki E Coli deneyleri, yüzey yoğunluğuna bağlı olarak alan başına beş ila 50 molekül verir.T7 replikasyon bölgesi çok daha verimli bir şekilde başlar ve bir alandaki moleküllerin %50'sinden fazlasını replike eder. Bu kadar yüksek bir yoğunlukta, burada görüldüğü gibi tekil molekülleri ayırt etmek zordur. Bu nedenle T7 deneyini daha düşük protein konsantrasyonlarında veya yüzey yoğunluğunda gerçekleştirin. E. coli ve T7 deneylerinden elde edilen tipik replike moleküllere ait Chime grafikleri, e coli ve T7 moleküllerinin zamana karşı çizilmiş son nokta yörüngelerini içerir; replikasyon hızlarını elde etmek için yörüngeler doğrusal regresyon ile uydurulmuştur ve bu örnekte hızlar e coli için saniyede 467,1 baz çifti ve T7 için saniyede 99,4 baz çiftidir.T7 için, tek molekül yörüngelerinin tekil Gauss eğrileriyle uydurulan hız dağılımları, e coli için saniyede 535,5 ± 39 baz çifti ve 75,9 ± 4,8 baz çifti şeklinde bir ortalama vermektedir. T7 için, replikasyon ürünlerinin uzunluk dağılımları, üretkenliği elde etmek amacıyla tekil üstel azalma ile uydurulmuştur; bu değer e coli için 85,3 ± 6,1 kilobaz çifti ve G7 için 25,3 ± 1,7 kilobaz çiftidir. Böylece, koordineli DNA replikasyonunun tek moleküllerle nasıl ölçüleceğini göstermiş olduk.Bu prosedürü uygularken, lamel kapakların uygun şekilde fonksiyonelleştirilmesinin ve temiz, düz akış kanallarının oluşturulmasının önemli olduğunu unutmayın. Lazer gücünü düşük tuttuğunuzdan emin olun ve uzun DNA'ların fotoklevajını en aza indirin. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

visualizing-single-molecule-dna-replication-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Bu protokol, DNA içsel floresan spektrumlarının örnek hazırlanması, veri toplama ve analizi üzerine ayrıntılı işlemler sağlar.

İçsel Kontrast kullanarak DNA moleküllerinin spektroskopik süper çözünürlüklü görüntülemesi

Öğrenin, tek molekül floresan mikroskopi ile DNA replikasyonunu gerçek zamanlı görselleştirme yöntemini. Bireysel replizomların koordineli aktivitelerini inceleyerek moleküler biyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Daha fazla video keşfet