Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Bireysel moleküllerin uzun bir zaman dilimi boyunca dinamiklerini incelemek için, moleküllerin öncelikle uzayda konumlandırılması gerekir. Bunu, molekülleri bir mikroakışkan hücrenin yüzeyine sabitleyerek gerçekleştiriyoruz. İşlem, biyomoleküllerin fikse edileceği dört hazne içeren hücrenin montajı ile başlar.

Odacıklar, giriş ve çıkış kılcalları aracılığıyla dış ortama bağlanmıştır. Hücre, desenli bir PDMS diskin kuvars lamel üzerine kaynaştırılmasıyla oluşturulur. Montajı tamamlanan hücre daha sonra floresan mikroskobuna yerleştirilir ve odacıklar arasında çözeltilerin kolayca değiştirilmesine olanak sağlamak için kılcallara esnek tüpler bağlanır; yüzeyi molekül immobilizasyonu için aktive etmek amacıyla ilk olarak kanallardan birinden biyotinillenmiş BSA çözeltisi akıtılır.

BSA bölmeye absorbe olacaktır. Ardından yüzeylerden, biyotine bağlanacak olan streptavidin çözeltisi akıtılır. Son olarak, streptavidine bağlanacak ve böylece ilgilenilen molekülü kuvars ön cam yüzeyine sabitleyecek olan biyotinlenmiş oligonükleotid akıtılır.

Floroforların ömür kararlılığını ve yoğunluğunu maksimize etmek için tasarlanmış bir görüntüleme tamponu, tüm veri toplama süreci boyunca sabit bir hızda hücreden geçirilir. Otomatik düzenek, yüzeyin farklı bölümlerini hem donör hem de akseptör floroforları içeren moleküller için tarar ve ardından bunları tek tek inceleme hacmine taşıyarak, her iki florofor da fotobeyazlama gerçekleşene kadar her biri için bir floresans yoğunluğu zaman izi elde eder. Merhaba, ben Boston Üniversitesi biyomedikal mühendisliği bölümündeki Profesör Miller'ın laboratuvarından Nicholas Dfi.

Bugün sizlere konfokal bir düzenek kullanarak immobilize edilmiş nükleik asitlerden tek molekül F izleri elde etme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda nükleik asit dinamiğini, nükleik asit ve enzim etkileşimlerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Hadi başlayalım.

Microfluid Excel, desenlenmiş iki milimetre kalınlığındaki bir polidimetilsiloksan veya PDMS diskin, yeni temizlenmiş bir kuvars lamel üzerine füzyonuyla hazırlanır. Desenlenmiş PDMS diski oluşturmak için 10 birim silikon elastomer tabanı ile bir birim kürleme ajanını karıştırın, iyice harmanlayın ve bir vakumda bir saat boyunca gazını alın. Elastomer tabanın gazı alındıktan sonra, karışımı mikroakışkan hücre kalıbına yavaşça dökün.

Elastomer karışımını 70 °C'deki bir ısıtıcı tabla üzerinde iki saat boyunca kürlenmeye bırakın. Kürlenme tamamlandığında, PDMS diski bir jilet yardımıyla kalıptan dikkatlice ayırın. PDMS diski dört adet 30 µL hacmindeki dikdörtgen hazne içermektedir.

Kanal içermeyen tarafı düz olan PDMS diski, her iki yüzey 30 saniye boyunca plazma ile oksitlenerek bir inçlik cam pencereye yapıştırın. Cam pencere, kanalların her iki ucunda daha önceden delinmiş sekiz adet iki milimetrelik deliğe sahiptir. Ardından, iki inç uzunluğundaki esnek bir ergitilmiş silika kılcal tüp, her bir cam pencere deliğinden içeri yerleştirilir.

Bunu yapmak için önce bir iğne yerleştirin ve ardından kılcal tüpü kanala ulaşana kadar ilerletin. Cam pencere deliklerini, quick cast gibi hızlı kürlenen bir silikon döküm bileşiği kullanarak sızdırmaz hale getirin. Hücreyi ve taze piranha temizliği yapılmış bir inçlik dairesel kuvars örtü camını 30 saniye boyunca plazma ile aktive ettikten sonra kanalları etanol ve su ile durulayın.

Lamelle'yi kanalların bulunduğu hücrenin yan tarafına yapıştırın. Bölmeler artık mühürlenmiştir. Montajı tamamlanan hücreyi oda sıcaklığında bir gece boyunca kürlenmeye bırakın.

Bir gece boyunca kürlenen monte edilmiş mikroakışkan hücre, hücre yüzeyini aktive etmeye başlamak için özel yapım bir tutucuya yerleştirilir ve konfokal mikroskobun tablasına monte edilir. Molekül immobilizasyonu için, bir şırınga ve iğne kullanarak tampon enjeksiyonunu kolaylaştırmak amacıyla esnek tüpler hücre kapilerlerine bağlanır. Şimdi, kanal içerisine tampon A içerisinde 0.1 mg/mL biyotinize BSA çözeltisi enjekte edin ve en az 30 dakika boyunca inkübe edin.

30 dakikalık inkübasyon akışından sonra, kanaldaki emilmemiş biotinli BSA'yı uzaklaştırmak için 300 ila 500 µL tampon A akıtın; bu sırada bölmede hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Ardından, tampon A içerisinde 0,1 mg/mL STR din çözeltisi enjekte edin ve 15 dakika inkübe edin.

15 dakikalık inkübasyon akışından sonra, kanaldaki emilmemiş strep din kalıntılarını uzaklaştırmak için 300 ila 500 microliters tampon A akıtın. Daha önce olduğu gibi, odacıkta hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Son olarak, üç ila beş picomolar konsantrasyonundaki biotinillenmiş örnek çözeltisini akıtın.

Floresan moleküllerin kapsamını kontrol etmek için bir yüzey taraması gerçekleştirilir. Biotinillenmiş numuneyi 10 dakika boyunca inkübe edin ve tampon akışını tekrarlayın. Daha önce gösterildiği gibi, görüntüleme tamponu veya IB, IB'nin öncelikle çözünmesini sağlamak için enzimatik bir oksijen temizleme sistemi ve trol locks gibi bir triplet söndürücüden oluşur.

Beş miligram trol locks, birkaç dakika vortexlenerek ve en az 10 dakika çalkalanarak 10 mililitre glukoz tamponuna eklenir. Çözelti filtrelenir ve 10 dakika boyunca vakum altında gaz gidermeye bırakılır. Hava kabarcığı oluşumundan kaçınarak, TRO lock çözeltisi Glocky enzimatik çözeltisi ile nazikçe karıştırılır.

Rezervuarı IB çözeltisi ile doldurun. Ardından, akış hızını kontrol etmek için mekanik bir şırınga pompası kullanarak IB'yi kanal boyunca dakikada 5 µL sabit hızla akıtın; atmosferik oksijenin tampon çözeltiye çözünmesini önlemek için IB rezervuarına argon gazı kabarcıkları verin. Yüzey tarama, molekül lokalizasyonu ve tek molekül yoğunluk izlerinin elde edilmesi, 20 x 20 µm²'lik alanları 0,2 µm çözünürlükte ve 0,1 µm/ms hızla tarayan LabVIEW programı tarafından kontrol edilir.

Yüzey taramasından elde edilen veriler, arka plan sayımlarının üzerindeki tüm piksellerin yoğunluk ağırlıklı konumlarını belirlemek için hemen işlenir. İmmobilize edilmiş moleküller bulunduktan sonra, tek tek konfokal hacme taşınır ve her iki florofor da fotobeyazlama gerçekleşene kadar donör ve akseptör floroforların yoğunlukları zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilir. Daha sonra sahne, 100 milimetre uzağa, yeni bir başlangıç noktasına taşınacak şekilde programlanır ve tarama işlemi tekrarlanır.

Montajı tamamlanmış MICROFLUID Excel burada gösterilmiştir. Bunlar, yeşil donör ve kırmızı akseptör kanallarındaki tekil molekülleri gösteren yüzey taramalarıdır. Akseptör yoğunluğunu kırmızı, donör yoğunluğunu ise yeşil ile gösteren bazı tipik tekil molekül izleri sunulmuştur.

Konfokal bir düzenek kullanarak immobilize edilmiş biyomoleküllerden tek molekül izlerinin nasıl elde edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, deneyin zorluğu nedeniyle her adımı dikkatle gerçekleştirmenin ve acele etmemenin önemli olduğunu unutmayın. Şimdilik bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.