Name: Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Öğrenin, yüzey immobilize DNA molekülleri üzerinde otomatik tarama konfokal mikroskobu kullanarak tek molekül FRET izleri elde etme yöntemini. Bu teknik nükleik asit dinamikleri ve enzim etkileşimlerini gerçek zamanlı incelemek için sağlam bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chandran Sabanayagam sistemi, Joshua mikroakışkan cihaz tasarımı ile ilgili öneri ve kurulum işleme parçaları için Harvard Üniversitesi Rowland Enstitüsü personel Edel gelişmekte olan yardımlarından dolayı teşekkür ederiz. UIUC faydalı bilgiler için yararlı Rowland Enstitüsü ve Boston Üniversitesi&#39;nde Meller grup, üyeleri ile tartışmalar, T. Ha &#39;grubu üyeleri ve kabul etmiş sayılırsınız. Son olarak, Ulusal Bilim Vakfı (FİZ-0.701.207) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (GM075893) mali destek için teşekkür ederiz.

1 - mikroakışkan hücre Montaj Mikroakışkan hücre eritme tarafından yapılan bir desenli, taze temizlenmiş kuvars kapak kayma için 2 mm kalınlığında, polidimetilsiloksan (PDMS) disk. PDMS disk tampon kontrollü akışı için, sırasıyla, bir tampon rezervuar ve bir enjektör pompası bağlı giriş ve çıkış esnek kılcal damarlar tarafından erişilen dört 30 ul dikdörtgen odaları içerir. Akış hücresi arka tarafında bir cam pencere tarafından desteklenen ve ısısını düzenlemek için su soğutmalı bir termoelektrik unsuru içeren bir ölçüye göre hücre sahibi üzerine yerleştirilir. <ol><li> Desenli PDMS diski yapmak için, 1 kısım sertleştirici ile 10 parça silikon elastomer baz karışımı, iyice karıştırın ve 1 saat vakum gaz alma terk. </li><li> Mikroakışkan hücre kalıp üzerine elastomer karışımı yavaşça dökün. Bizim durumumuzda, bu negatif fotorezist yapılan dört şeritler (1x10 4 x 1x10 3 x 300 mm) 1 &quot;silikon gofret 70 sıcak bir plaka üzerinde tedavisi için bırakın ° C iki saat boyunca. </li><li> Bir jilet kullanarak kalıp tedavi PDMS disk dikkatlice soyulur. 30 saniye boyunca iki yüzeyine oksitleyici plazma 1&#39;&#39;cam pencere (kanalların her iki uçta da 8 x 2 mm çaplı ön delikler içeren) üzerine disk Sigorta. Sigorta PDMS disk düz yüzüne cam pencereler (kanalları içermeyen tarafı). </li><li> 2-inç uzunluğunda esnek erimiş silika kapiler boru kanal ulaşıncaya kadar her bir cam pencere delikten takın. Ilk önce bir iğne takma ve sonra aşağıdaki ile kılcal bu süreci kolaylaştırabilir. Kwik-Cast gibi hızlı bir kür silikon döküm bileşik kullanarak cam pencere delikleri Seal. </li><li> Etanol ve su ile durulayın kanallar, ve 30 saniye süreyle taze temizlenmiş, 1-inç dairesel kuvars kapak kayma ile birlikte hücre plazma etkinleştirin. Biz piranha kullanarak bu kapağın kayma temizlik öneririz *. Odaları, sızdırmazlık kanalları içeren hücre yan kapak kayma Sigorta. </li><li> Oda sıcaklığında gece boyunca tedavi etmek için birleştirilmiş hücre bırakın. </li></ol> * Piranha H 2 O 2 ve H 2 SO 4 1:2.5 oranlarda bir çözümdür. Kapak fişleri temizlemek için, 90 piranha onları batırmayın ° C, 20 dk. 2 molekül immobilizasyon için yüzey aktif hale getirme Nükleik asit çalışmalar için, en basit yüzey immobilizasyon şeması ilk kaplama cam veya biotinlenmiş sığır serum albumin ve (BSA) sonra streptavidin kuvars kapak kayma oluşur. Bu biotinlenmiş örnek, gün boyunca oda sıcaklığında yüksek özgüllük ile immobilize olanak sağlar. <ol><li> Esnek borular kolay tampon enjeksiyon için bir şırınga ve iğne kullanılarak kılcal bağlayın. </li><li> 0.1 mg / ml tampon biotinlenmiş BSA bir çözüm enjekte A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.02 mikron filtre kullanarak filtre) kanal ve en az 30 dakika süreyle inkübe. </li><li> Akış 300-500 ul tampon bir odanın içinde herhangi bir hava kabarcığı yakalamak için dikkatli olmak, kanalın herhangi bir ücretsiz biotinlenmiş BSA kaldırmak için. </li><li> 0.1 bir çözüm enjekte streptavidin buffer mg / ml ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra Adım 3 tekrarlayın. </li><li> 3-5 pM biotinlenmiş örnek bir çözüm akmaya. Floresan moleküllerin kapsama kontrol etmek için bir yüzey taraması yapın. Gerekirse, daha iyi kapsama alanı elde etmek için numune konsantrasyonu artırır. 10 dakika boyunca inkübe ve Adım 3 tekrarlayın. </li></ol> Mikroakışkan hücre optik olarak kodlanmış DC motorları kullanılarak kaba (25 mm) hareket sağlayan bir motorlu xy sahne üzerine monte edilmiş ve iki kapalı döngü piezo aktüatörler kullanılarak ince (1 nm) hareket (Physik Instrumente modeli M-014 veya benzeri). Bu, önce ya da örnek immobilizasyon için yüzey aktive sonra yapılabilir. 3 - Görüntüleme Buffer (IB) hazırlanması IB gibi Trolox gibi bir enzimatik oksijen süpürücü sistemi ve bir üçlü söndürücü oluşur. IB sürekli bir gecede kızarmış olduğundan, en az 10 ml önceden hazırlanmış olmalıdır. <ol><li> 10 ml% 0.8 w / v D-glukoz, en az 35 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 50 mM NaCl deiyonize su hazırlayın. Tampon yüksek konsantrasyonda iki nedenden ötürü önemlidir: Trolox çözme çözüm asitlenir ve enzimatik reaksiyon da zaman içinde çözüm pH değerini düşürecektir. Bu çözüm, uzun bir raf ömrüne sahiptir bu yana bir stok solüsyonu olarak saklanabilir. </li><li> Adım 1 birkaç dakika karıştırın ve daha sonra&gt; 10 dakika için sallayarak tarafından hazırlanan tampon Trolox 5 mg eritin. Trolox pH&gt; 7 suda çok çözünür değildir, bu nedenle bu adımı acele etmiyoruz. Filtre 0.2 mikron filtre ve 10 dakika boyunca vakum gaz alma terk kullanarak çözüm. </li><li> 60 ul Wate karıştırma &quot;gloxy&quot; enzimatik çözüm hazırlayınr, 5X tampon, katalaz 20 ul, 1 mg glukoz oksidaz ve 10 ul 100 mg / ml BSA 20 ul. 0.22 mikron santrifüj filtre kullanarak çözüm Filtre. </li><li> Adım 2 Adım 3 hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek &quot;gloxy&quot; çözümü ile tampon yavaşça karıştırınız. </li><li> 5 ul / dak akış hızı kontrol etmek için mekanik bir şırınga pompası kullanarak sabit bir oranda kanalı ile IB Akış. Tampona yeniden çözünmesi atmosferik oksijenin önlemek için IB rezervuar içine Bubble argon gazı. </li></ol> Yüzey tarama, tek bir molekül yoğunluğu izleri molekül yerelleştirme ve satın alma, otomatik veri toplama 1 izin veren bir LabView programı tarafından kontrol edilir . Program, 0.1 mm / ms oranı ile 0.2 mikron çözünürlüğü 20x20 mikron 2 alanları tarar. Veri yoğunluğu ağırlıklı yerlerde arka plan sayıları her şeyden piksel verim hemen işlenir. Immobilize molekülleri bulundu sonra, konfokal hacmi ve donör ve alıcı fluorofor şiddetleri içine tek tek, hem de fluorophores photobleach kadar zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir taşınır. Sahne daha sonra 100 mikron uzaklıkta yeni bir kökeni geçmek için programlanmış ve tarama işlemi tekrarlanır. 4 - Temsilci Sonuçlar Aşağıda yüzey aktivasyonu öncesi ve molekül immobilizasyon için hazır mikroskop üzerine monte sonra monte mikroakışkan hücre gösteren bazı görüntülerin. Kanal başarıyla aktifse, yüzey taramaları doğrudan bağış uyarma sonra donör boya (yeşil) ve alıcı (kırmızı) gösteren emisyon aşağıda tasvir taramaları benzer olmalıdır. Bu moleküller tek tek problama hacmi içine taşınır ve floresan hem boyalar photobleach kadar zaman içinde kaydedilir, tek bir molekülün izleri görüldüğü gibi. Bu gibi izlerini, biyolojik ilgi moleküllerin yapısı ve dinamiği keşfetmek için kullanılan anlık donör-alıcı ayırma hakkında bilgi FRET verimliliği elde edebilirsiniz. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" /> Şekil 1: Dört kanal ile mikroakışkan hücre, her giriş / çıkış kılcal damarlar ile. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" /> Şekil 2: Hücre ölçümler için hazır mikroskop üzerine monte. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Şekil 3" border="0" /> Şekil 3: sm-FRET ölçümler için Kurulum. Lütfen Şekil 3 büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Şekil 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Şekil 5" border="0" /> Şekil 4 ve 5: Kırmızı ve yeşil kanal hareketsiz bir yüzey taraması yeşil lazer ile heyecan molekülleri FRET. Daha büyük bir sürümünü görmek için tıklayınız <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">Şekil 4</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">Şekil 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Şekil 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Şekil 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Şekil 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Şekil 9" border="0" /> Şekil 6, 7, 8 ve 9: Yoğunluk yörüngeleri donör (yeşil) ve bir DNA molekülünün 8, 10, 16 ve 18 basepairs ayrı etiketli alıcı (kırmızı) fluorophores. Daha büyük halini görmek için tıklayınız <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">Şekil 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">Şekil 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">Şekil 8</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">Şekil 9</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

Yukarıdaki protokol ve boyalar (TMR ve ATTO647N) belirli bir seçim sistemi için optimize edilmiş olmasına rağmen, sadece ispat yöntemi anlamına gelir. Son zamanlarda, protocatechuic asit (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PSD) oluşan alternatif bir oksijen temizleyici sistem belirli boyalar 4 fotostabilite artırdığı gösterilmiştir. Aynı şekilde, bu, özellikle Cy5 5, bazı boyaların uzun süreli yanıp sönen bastırmak olmasa da, β-mercaptoethanol (BME) gibi diğer üçlü-devlet quenchers yerine Trolox olabilir. (BSA), biotin streptavidin biotinlenmiş sığır serum albümini ile immobilizasyon nükleik asitlerin çalışmalar için tercih ediliyor olsa da, non-spesifik yapışma 1 önler, polietilen glikol (PEG) kaplı yüzey proteinlerin çalışmalar için daha uygundur. Ayrıca, alt-kırınım sınırlı boyutu veziküller yüzey etkileşimleri 6 etkilenebilir durumda faiz biyomolekülün kapsülleyen kullanılabilir. Bu yazıda, floresan izlerini elde etmek için silikon çığ fotodiyotlar ile donatılmış bir konfokal kurulum kullandık. Bu protokol, CCD kamera ile donatılmıştır Toplam İç Yansıma Floresan mikroskoplar (TIRF) ile eşit derecede iyi çalışır. Mikroskopi ne olursa olsun, donör ve alıcı sinyali düzgün 7 düzeltilir angström yaklaşan mekansal çözünürlüklerde bilgilendirmek sm- FRET.

<table><tbody><tr><td>Erimiş silika kapiler tüp</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>Erimiş silika lamel</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>Tüp</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>Silikon Elastomer Kiti</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>Glukoz Oksidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Cast Sızdırmazlık Maddesi</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>Silikon Döküm Bileşiği</td></tr></tbody></table>

yüzey immobilize biyomoleküller tek molekül floresans Ölçümler için otomatik sistem

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) mikroskobu yaygın nükleik asitler ve proteinler gibi biyolojik ilgi moleküllerin yapısı ve dinamiği incelemek için kullanılır olmuştur. (Sm-FRET) immobilize molekülleri ölçümleri tek bir molekül FRET uzun gözlemler izin sisteminin etkin bir şekilde hem boyalar zaman izleri photobleach sonuçlanan kadar milisaniyeden zaman ölçekleri dakikaya kadar geniş bir yelpazede ile biyomoleküler dinamikleri üzerinde rapor. Istatistiksel analizler için izleri çok sayıda satın alma kolaylaştırmak için, süreci otomatik olmalıdır ve örnek ortamında tüm ölçüm süresi (~ 12 saat) üzerinden sıkıca kontrol edilmelidir. Bu sorgulama gecede binlerce tek moleküllerin sağlayan bir otomatik tarama konfokal mikroskop ve sınırlı oksijen içeriği ile tampon kontrollü döviz izin verir ve tüm ölçüm süresi boyunca sabit bir sıcaklıkta korur mikroakışkan hücre kullanılarak yapılır. Burada mikroakışkan cihaz monte etmek için nasıl ve DNA immobilizasyon için yüzey aktif hale getirmek için nasıl göstermektedir. Sonra biz bir tampon fluorophores fotostabilite ve ömrünü en üst düzeye çıkarmak için nasıl hazırlanacağını açıklar. Son olarak, zamana bağımlı tek bir molekülün otomatik edinimi için kurulum hazırlanmasında yer alan adımları DNA moleküllerinin izlerini FRET göstermektedir.

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) mikroskopisi, biyolojik ilgi odağı olan moleküllerin yapısını ve dinamiklerini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır, ...

Bireysel moleküllerin uzun bir zaman dilimi boyunca dinamiklerini incelemek için, moleküllerin öncelikle uzayda konumlandırılması gerekir. Bunu, molekülleri bir mikroakışkan hücrenin yüzeyine sabitleyerek gerçekleştiriyoruz. İşlem, biyomoleküllerin fikse edileceği dört hazne içeren hücrenin montajı ile başlar.Odacıklar, giriş ve çıkış kılcalları aracılığıyla dış ortama bağlanmıştır. Hücre, desenli bir PDMS diskin kuvars lamel üzerine kaynaştırılmasıyla oluşturulur. Montajı tamamlanan hücre daha sonra floresan mikroskobuna yerleştirilir ve odacıklar arasında çözeltilerin kolayca değiştirilmesine olanak sağlamak için kılcallara esnek tüpler bağlanır; yüzeyi molekül immobilizasyonu için aktive etmek amacıyla ilk olarak kanallardan birinden biyotinillenmiş BSA çözeltisi akıtılır.BSA bölmeye absorbe olacaktır. Ardından yüzeylerden, biyotine bağlanacak olan streptavidin çözeltisi akıtılır. Son olarak, streptavidine bağlanacak ve böylece ilgilenilen molekülü kuvars ön cam yüzeyine sabitleyecek olan biyotinlenmiş oligonükleotid akıtılır.Floroforların ömür kararlılığını ve yoğunluğunu maksimize etmek için tasarlanmış bir görüntüleme tamponu, tüm veri toplama süreci boyunca sabit bir hızda hücreden geçirilir. Otomatik düzenek, yüzeyin farklı bölümlerini hem donör hem de akseptör floroforları içeren moleküller için tarar ve ardından bunları tek tek inceleme hacmine taşıyarak, her iki florofor da fotobeyazlama gerçekleşene kadar her biri için bir floresans yoğunluğu zaman izi elde eder. Merhaba, ben Boston Üniversitesi biyomedikal mühendisliği bölümündeki Profesör Miller'ın laboratuvarından Nicholas Dfi.Bugün sizlere konfokal bir düzenek kullanarak immobilize edilmiş nükleik asitlerden tek molekül F izleri elde etme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda nükleik asit dinamiğini, nükleik asit ve enzim etkileşimlerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Microfluid Excel, desenlenmiş iki milimetre kalınlığındaki bir polidimetilsiloksan veya PDMS diskin, yeni temizlenmiş bir kuvars lamel üzerine füzyonuyla hazırlanır. Desenlenmiş PDMS diski oluşturmak için 10 birim silikon elastomer tabanı ile bir birim kürleme ajanını karıştırın, iyice harmanlayın ve bir vakumda bir saat boyunca gazını alın. Elastomer tabanın gazı alındıktan sonra, karışımı mikroakışkan hücre kalıbına yavaşça dökün.Elastomer karışımını 70 °C'deki bir ısıtıcı tabla üzerinde iki saat boyunca kürlenmeye bırakın. Kürlenme tamamlandığında, PDMS diski bir jilet yardımıyla kalıptan dikkatlice ayırın. PDMS diski dört adet 30 µL hacmindeki dikdörtgen hazne içermektedir.Kanal içermeyen tarafı düz olan PDMS diski, her iki yüzey 30 saniye boyunca plazma ile oksitlenerek bir inçlik cam pencereye yapıştırın. Cam pencere, kanalların her iki ucunda daha önceden delinmiş sekiz adet iki milimetrelik deliğe sahiptir. Ardından, iki inç uzunluğundaki esnek bir ergitilmiş silika kılcal tüp, her bir cam pencere deliğinden içeri yerleştirilir.Bunu yapmak için önce bir iğne yerleştirin ve ardından kılcal tüpü kanala ulaşana kadar ilerletin. Cam pencere deliklerini, quick cast gibi hızlı kürlenen bir silikon döküm bileşiği kullanarak sızdırmaz hale getirin. Hücreyi ve taze piranha temizliği yapılmış bir inçlik dairesel kuvars örtü camını 30 saniye boyunca plazma ile aktive ettikten sonra kanalları etanol ve su ile durulayın.Lamelle'yi kanalların bulunduğu hücrenin yan tarafına yapıştırın. Bölmeler artık mühürlenmiştir. Montajı tamamlanan hücreyi oda sıcaklığında bir gece boyunca kürlenmeye bırakın.Bir gece boyunca kürlenen monte edilmiş mikroakışkan hücre, hücre yüzeyini aktive etmeye başlamak için özel yapım bir tutucuya yerleştirilir ve konfokal mikroskobun tablasına monte edilir. Molekül immobilizasyonu için, bir şırınga ve iğne kullanarak tampon enjeksiyonunu kolaylaştırmak amacıyla esnek tüpler hücre kapilerlerine bağlanır. Şimdi, kanal içerisine tampon A içerisinde 0.1 mg/mL biyotinize BSA çözeltisi enjekte edin ve en az 30 dakika boyunca inkübe edin.30 dakikalık inkübasyon akışından sonra, kanaldaki emilmemiş biotinli BSA'yı uzaklaştırmak için 300 ila 500 µL tampon A akıtın; bu sırada bölmede hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Ardından, tampon A içerisinde 0,1 mg/mL STR din çözeltisi enjekte edin ve 15 dakika inkübe edin.15 dakikalık inkübasyon akışından sonra, kanaldaki emilmemiş strep din kalıntılarını uzaklaştırmak için 300 ila 500 microliters tampon A akıtın. Daha önce olduğu gibi, odacıkta hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Son olarak, üç ila beş picomolar konsantrasyonundaki biotinillenmiş örnek çözeltisini akıtın.Floresan moleküllerin kapsamını kontrol etmek için bir yüzey taraması gerçekleştirilir. Biotinillenmiş numuneyi 10 dakika boyunca inkübe edin ve tampon akışını tekrarlayın. Daha önce gösterildiği gibi, görüntüleme tamponu veya IB, IB'nin öncelikle çözünmesini sağlamak için enzimatik bir oksijen temizleme sistemi ve trol locks gibi bir triplet söndürücüden oluşur.Beş miligram trol locks, birkaç dakika vortexlenerek ve en az 10 dakika çalkalanarak 10 mililitre glukoz tamponuna eklenir. Çözelti filtrelenir ve 10 dakika boyunca vakum altında gaz gidermeye bırakılır. Hava kabarcığı oluşumundan kaçınarak, TRO lock çözeltisi Glocky enzimatik çözeltisi ile nazikçe karıştırılır.Rezervuarı IB çözeltisi ile doldurun. Ardından, akış hızını kontrol etmek için mekanik bir şırınga pompası kullanarak IB'yi kanal boyunca dakikada 5 µL sabit hızla akıtın; atmosferik oksijenin tampon çözeltiye çözünmesini önlemek için IB rezervuarına argon gazı kabarcıkları verin. Yüzey tarama, molekül lokalizasyonu ve tek molekül yoğunluk izlerinin elde edilmesi, 20 x 20 µm²'lik alanları 0,2 µm çözünürlükte ve 0,1 µm/ms hızla tarayan LabVIEW programı tarafından kontrol edilir.Yüzey taramasından elde edilen veriler, arka plan sayımlarının üzerindeki tüm piksellerin yoğunluk ağırlıklı konumlarını belirlemek için hemen işlenir. İmmobilize edilmiş moleküller bulunduktan sonra, tek tek konfokal hacme taşınır ve her iki florofor da fotobeyazlama gerçekleşene kadar donör ve akseptör floroforların yoğunlukları zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilir. Daha sonra sahne, 100 milimetre uzağa, yeni bir başlangıç noktasına taşınacak şekilde programlanır ve tarama işlemi tekrarlanır.Montajı tamamlanmış MICROFLUID Excel burada gösterilmiştir. Bunlar, yeşil donör ve kırmızı akseptör kanallarındaki tekil molekülleri gösteren yüzey taramalarıdır. Akseptör yoğunluğunu kırmızı, donör yoğunluğunu ise yeşil ile gösteren bazı tipik tekil molekül izleri sunulmuştur.Konfokal bir düzenek kullanarak immobilize edilmiş biyomoleküllerden tek molekül izlerinin nasıl elde edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, deneyin zorluğu nedeniyle her adımı dikkatle gerçekleştirmenin ve acele etmemenin önemli olduğunu unutmayın. Şimdilik bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

TIRF mikroskobu ile büyük verici-alıcı ağlardan smFRET verilerini elde etmek için kurulum ve deneysel prosedürü sunuyoruz. Bu ölçümlerin Bayes çıkarım yazılımı Fast-NPS ile adım adım analizi, uyarlanmış boya modellerinin uygulanması yoluyla yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler verir.

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Burada, üç renkli smFRET veri ve onun analizi ile 3D ensemble gizli Markov modeli elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yaklaşım ile bilim adamları Kinetik bilgi cooperativity veya ilişkili etkileşimler de dahil olmak üzere karmaşık protein sistemlerden ayıklayabilirsiniz.

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Bu makalede, açık kaynaklı, ucuz smfBox'ı kullanarak biyomolekülleri serbestçe dağıtarak, açmadan hizalamaya ve odaklanmaya, veri toplama ve analize kadar, bireysel olarak tam olarak düzeltilmiş doğru FRET ölçümleri yapmak için adım adım yönergeler sağlanır.

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Burada, konfokal mikroskopi modunda tek molekül seviyesinde zamanla çözülen floresan anizotropi kullanarak biyomoleküllerin yerel esnekliğini ve dinamiklerini incelemek için protokolü sunuyoruz.

Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi

Bu protokol, plazma zarı proteinlerinin nano ölçekli mekânsal organizasyonunu çözmek için tek antikor etiketlemesini (SAL) tanımlar. Tek molekül düzeyinde kümülatif antikor-epitop etkileşimlerini kullanarak, membran SAL (mSAL), yerel epitop dağılımlarını haritalandırırken aynı zamanda doğal hücresel ortamda antikor bağlanma davranışını yakalar.

Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

Öğrenin, yüzey immobilize DNA molekülleri üzerinde otomatik tarama konfokal mikroskobu kullanarak tek molekül FRET izleri elde etme yöntemini. Bu teknik nükleik asit dinamikleri ve enzim etkileşimlerini gerçek zamanlı incelemek için sağlam bir yaklaşım sunar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Daha fazla video keşfet