Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Tek tek moleküllerin dinamiklerini uzun bir süre boyunca incelemek için, moleküllerin önce uzayda lokalize olmaları gerekir. Bunu, onları bir mikroakışkan hücrenin yüzeyinde hareketsiz hale getirerek başarıyoruz. Prosedür, biyomoleküllerin sabitleneceği dört oda içeren hücrenin montajı ile başlar.

Odacıklar, giriş ve çıkış kılcal damarları ile dışarıya bağlanır. Hücre, desenli bir PDMS diskinin bir kuvars kapak kızağına kaynaştırılmasıyla yapılır. Birleştirilen hücre daha sonra floresan mikroskobu üzerine monte edilir ve esnek borular, kanallardan birinden biyotinile edilmiş bir BSA çözeltisi olan molekül immobilizasyonu ilk akışı için yüzeyi aktive etmek üzere odacıklar boyunca çözeltilerin kolay değişimine izin vermek için kılcal damarlara bağlanır.

BSA odaya emecektir. Yüzeyler daha sonra bir streptavidin çözeltisi akar ve bu da biotin'e bağlanır. Son olarak, streptavidine bağlanacak olan biyotinile oligonükleotidinizi akıtın, böylece ilgilenilen molekülü kuvars örtü kaymasının yüzeyine sabitleyin.

Floro dörtlüsünün kullanım ömrünü, stabilitesini ve yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmış bir görüntüleme tamponu, tüm edinim süresi boyunca odadan sabit bir hızda akıtılır. Otomatik kurulum, hem verici hem de alıcı flora dörtlüsüne sahip moleküller için yüzeyin farklı bölümlerini tarar ve daha sonra bunları birer birer sondalama hacmine taşır ve her ikisi için de her iki Fluor dörtlü foto ağartıcıya kadar bir floresan yoğunluğu zaman izi elde eder. Merhaba, ben Boston Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde Profesör Miller'ın laboratuvarından Nicholas Dfi.

Bugün size konfokal bir kurulum kullanarak hareketsizleştirilmiş nükleik asitlerden tek molekül F izleri elde etmek için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda nükleik asit dinamiklerini ve nükleik asit ve enzim etkileşimlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Microfluid Excel, desenli iki milimetre kalınlığında poli dimetil silikon veya PDMS diskin yeni temizlenmiş bir kuvars kapak kızağına kaynaştırılmasıyla yapılır. Desenli PDMS diskini yapmak için, 10 parça silikon elastomer tabanı bir parça kürleme maddesi ile birleştirin, iyice karıştırın ve bir vakumda bir saat boyunca gazını alın. Elastomer taban gazdan arındırıldıktan sonra, nazikçe mikroakışkan hücre kalıbına dökün.

Elastomer karışımını iki saat boyunca 70 santigrat derecede sıcak bir plakada kürlenmeye bırakın. Sertleştiğinde, bir tıraş bıçağı kullanarak PDMS diskini kalıptan dikkatlice soyun. PDMS diski dört adet 30 mikrolitrelik dikdörtgen bölme içerir.

PDMS diskinin düz tarafını, kanalları içermeyen tarafını, her iki yüzeyi 30 saniye boyunca plazma oksitleyerek bir inçlik bir cam pencereye kaynaştırın. Cam pencere, daha önce delinmiş olan kanalların her iki ucunda sekiz ila iki milimetre delik içerir. Daha sonra, her bir cam pencere deliğinden iki inç uzunluğunda esnek bir erimiş silika kılcal boru yerleştirilir.

Bunu yapmak için önce bir iğne sokun ve ardından kılcal boruyu kanala ulaşana kadar sokun. Hızlı döküm gibi hızlı kürlenen bir silikon döküm bileşiği kullanarak cam pencere deliklerini kapatın. Hücreyi aktive eden plazma ve taze piranha ile temizlenmiş bir inç dairesel kuvars örtü kaymasını 30 saniye boyunca etanol ve su ile durulayın.

Kapak fişini, kanalların bulunduğu hücrenin yan tarafına sigortalayın. Odalar şimdi mühürlendi. Birleştirilmiş hücreyi gece boyunca oda sıcaklığında kürlenmeye bırakın.

Monte edilmiş mikroakışkan Excel gece boyunca sertleştikten sonra, özel yapım bir tutucuya yerleştirilir ve hücrenin yüzeyini aktive etmeye başlamak için konfokal mikroskobun tablasına monte edilir. Molekül immobilizasyonu için, bir şırınga ve bir iğne kullanarak tampon enjeksiyonunu kolaylaştırmak için hücrenin kılcal damarlarına esnek borular bağlayın. Şimdi tampon A'da mililitre biyotinile BSA başına 0.1 miligramlık bir çözeltiyi kanala enjekte edin ve en az 30 dakika inkübe edin.

30 dakikalık inkübasyon akışından sonra. 300 ila 500 mikrolitre tampon A Kanaldan emilmemiş biyotinillenmiş BSA'yı çıkarmak için, haznede herhangi bir hava kabarcığı sıkışmamasına dikkat edin. Daha sonra, tampon A'ya mililitre STR din başına 0.1 miligramlık bir çözelti enjekte edin ve 15 dakika inkübe edin.

15 dakikalık inkübasyon akışından sonra, kanaldan emilmemiş strep din'i çıkarmak için 300 ila 500 mikrolitre tampon A. Daha önce olduğu gibi, haznede herhangi bir hava kabarcığı sıkışmasını önleyin. Son olarak, biyotinile edilmiş numunenin üç ila beş pikomolarından oluşan bir çözelti akıtın.

Floresan moleküllerinin kapsamını kontrol etmek için bir yüzey taraması yapılır. Biyotinile edilmiş numuneyi 10 dakika inkübe edin ve tampon akışını tekrarlayın. A Daha önce gösterildiği gibi, görüntüleme tamponu veya IB, bir enzimatik oksijen süpürme sisteminden ve IB'nin ilk çözünmesini sağlamak için trol kilitleri gibi üçlü bir söndürücüden oluşur.

Beş miligram trol, birkaç dakika girdap yaparak ve en az 10 dakika çalkalayarak 10 mililitre glikoz tamponuna kilitlenir. Çözeltiyi süzün ve 10 dakika boyunca vakumda gazlanmaya bırakın. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken TRO kilit solüsyonunu Glocky enzimatik solüsyonu ile nazikçe karıştırın.

Rezervuarı IB çözeltisi ile doldurun. Daha sonra mekanik bir şırınga pompası kullanarak akış hızını kontrol edin, IB'yi dakikada beş mikrolitrelik sabit bir hızda kanaldan geçirin, atmosferik oksijenin tampona çözünmesini önlemek için argon gazını IB rezervuarına kabarcıklayın. Yüzey taraması, molekül lokalizasyonu ve tek molekül yoğunluğu izlerinin elde edilmesi, milisaniyede 0,1 mikrometre hızla 0,2 mikrometre çözünürlükte 20 x 20 mikrometre karelik alanları tarayan laboratuvar görüntüleme programı tarafından kontrol edilir.

Yüzey taramasından elde edilen veriler, arka plan sayılarının üzerindeki tüm piksellerin yoğunluk ağırlıklı konumlarını elde etmek için hemen işlenir. İmmobilize moleküller bulunduktan sonra, birer birer konfokal hacme taşınırlar ve verici ve alıcı floroforun yoğunlukları, her iki flora dörtlü foto ağartıcıya kadar zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilir. Aşama daha sonra 100 milimetre uzaklıktaki yeni bir orijine hareket edecek şekilde programlanır ve tarama işlemi tekrarlanır.

Monte edilmiş MICROFLUID Excel burada gösterilmektedir. Bunlar, yeşil donör ve kırmızı alıcı kanallardaki tek molekülleri gösteren yüzey taramalarıdır. Alıcı yoğunluğunu kırmızı ve donör yoğunluğunu yeşil olarak gösteren bazı tipik tek molekül izleri gösterilmiştir.

Konfokal bir kurulum kullanarak hareketsiz hale getirilmiş biyomoleküllerden tek molekül izlerini nasıl elde edeceğinizi az önce gösterdik. Bu prosedürü yaparken, zorlu bir deney olduğu için her adımı dikkatli bir şekilde yapmayı ve zaman ayırmayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.