Name: Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Öğrenin, fare embriyonik kök hücrelerinde LIF olmadan SC1 kullanarak kendi kendini yenilemeyi nasıl sürdüreceğinizi. Bu maliyet etkin yöntem, pluripotentlik belirteçlerinin korunmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Scripps Araştırma Enstitüsü&#39;nden Dr. Sheng Ding ve Pekin Üniversitesi Dr. HongKui Deng yazarlar, onların yardım ve yön için teşekkür etmek istiyorum.

1. MEF besleyici tabak hazırlanması <ol><li> Kültür ES hücrelerinin bir gün önce, bir çözülme bir flakon ışınlanmış E14.5 CF-1 MEF besleyici hücreler (ES hücrelerinin nasıl Çözülme yordama bakın). </li><li> 10.000 hücrelerinin yoğunluğu Plaka MEF besleyici hücreler / 12 plaka. 37 ° C ve% 5 CO 2 geceleme hücreleri inkübe edin. MEF hücre medya: DMEM% 10 ES-PBS, 1X glutamin ve 1X non-esansiyel amino asitleri ile desteklenmiştir. </li></ol> 2. Kendinden Fare ES Hücre Yenileyici Bakım <ol><li> Tripsin kullanarak ES hücreleri ayırın. / Iyi büyüme ortamı önceden hazırlanmış MEF besleyici plakaları (Nakavt MEM,% 15 KSR, 4 mM L-glutamin, 0.1 mM non-esansiyel amino asitler ve 1X BME ile desteklenmiş) 50.000 hücrelerinin yoğunluğu Tohum hücreleri SC1 ile desteklenmiş istenilen konsantrasyonda (100 nM 300 nM ve 1 mcM). Ayrıca 1000 μ / ml LIF ile desteklenmiş iyi bir pozitif kontrol ekledi. 37 ° C ve% 5 CO 2 geceleme hücreleri inkübe edin. </li><li> Kültür 37 hücreleri ° C ve% 5 CO 2 3-4 gün için her pasajda. Yenile medya her 48 saatte. </li><li> Passage hücreleri ilk tohumlama yoğunluğu gibi benzer bir yoğunluğunu korumak için tripsin ile 1:10 - 1:15. 5 pasajlar sonra, hücreler tipik pluripotency belirteçlerin immünsitokimya kullanarak ifade için incelenebilir. </li></ol> 3. Pluripotency Belirteçleri İmmünositokimyasal Sınav <ol><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> 500 oda sıcaklığında 20 dakika fiksatif ul hücreleri sabitleyin. </li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında bir saat için 500 ul engelleme tampon ile non-spesifik bağlama engelleyin. </li><li> 250 ul spesifik primer antikor (1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 aşağıdaki dilüsyonları Nanog, Sox2, SSEA1 ve Oct4) hücreleri inkübe </li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> (1 1:2000 ve eşek Alexa Fluor ® 488 anti-tavşan konjuge anti-fare Alexa Fluor konjuge ® 555 eşek kullanılan ışıktan uzak tutarak, ikincil antikor 250 ul hücreleri iki saat oda sıcaklığında inkübe edin. : 2000). </li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> Son yıkama DAPI (son konsantrasyonu 1 mcg / ml) ve çekirdekleri görselleştirmek için 5 dakika inkübe edin. </li><li> Floresan mikroskop altında hücrelerin analiz edin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: 1. Morfoloji sonuçları: Fare ES hücrelerinin (ESC R1), farklılaşmamış bir halde kendini yenileme sürdürmek için ya LIF veya SC1 varlığı MEF besleyici hücreler yetişen. Ikinci geçit sonra LIF veya SC1 (negatif kontrol) olmadan, farklılaşma hücrelerinde gözlenen olabilir ve 5 pasajlar sonra aslında hiç farklılaşmamış koloniler gözlenmiştir. LIF (pozitif kontrol) tedavi koloniler 5 hücre pasajlar boyunca farklılaşmamış bir devlet kaldı. 300 nm veya 100 nM konsantrasyonlarda SC1 ile tedavi Hücreler aynı zamanda 5 pasajlar sonra farklılaşmamış kaldı, ancak, hücrelerin dördüncü geçtikten sonra 1 mcM SC1 deneyimli hücre ölümü ile tedavi. (App not şekil 2) Tablo 1 gözlemler özetlenmiştir. 2. Pluripotency Markers İfadesi 5 pasajlar sürdürülen Fare ES hücrelerinin SSEA1, Oct4, Nanog ve Sox2 için sabit ve immünsitokimya tarafından incelendi. Marker ifade LIF muhafaza hücreleri için benzer. (App not şekil 3 ve 4) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: LIF veya SC1 muhafaza hücreleri Morfoloji karşılaştırılması. Morfoloji açısından fark yok gözlendi. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Şekil 2 ve 3" /> Şekil 2 ve Şekil 3: Nanog, SSEA1, Sox2 ve bakımı, SC1 veya LIF (app not şekil 4) ile ES hücrelerinin Oct4 boyama . SC1 olarak tutulan hücreler LIF muhafaza hücreleri için benzer pluripotency işaretleyici ifade göstermektedir. Tablo 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Negatif Kontrol </td><td> LIF Pozitif Kontrolü </td><td> SC1 1uM </td><td> SC1 300 Nm </td><td> SC1 100 Nm </td></tr><tr><td> 1. Passage </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr><tr><td> 2. Passage </td><td> Bazı farklılaştırılmış morfolojisi </td><td> Normal DS hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr><tr><td> 3. Passage </td><td> Farklılaşmış hücrelerin büyük bir çoğunluğu </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr><tr><td> 4. Passage </td><td> Yok ESC koloniler </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Hücre ölümü gözlenen </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr><tr><td> 5. Passage </td><td> farklılaştırılmış </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Hücre ölümü gözlenen </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

Bu makalenin yazarları, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Stemgent tarafından istihdam edilmektedir.

Küçük molekül SC1 fare ES hücreleri farklılaşmamış bir devlet ile kendini yenileme korumak için kullanılabilir. Ancak, denenmemiş bir hücre hattı kullanmadan önce, optimal konsantrasyonunu belirlemek için titre edilmelidir. Örneğin, fare ES hücre hattı ESC R1 üç konsantrasyonları test etti. 100 nM ve 300 nM konsantrasyonlarda fare ES hücrelerinin sürdürmek başardık, ancak 1 mcM konsantrasyonu toksik oldu. SC1 aynı zamanda besleyici-koşullar altında kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1 antikoru</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>Nanog antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 antikoru</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>Oct4 antikoru</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

kendini yenileme lif yokluğunda mesc destek sc1 (pluripotin) kullanımı

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Fare embriyonik kök (ES) hücreleri, geleneksel olarak kendini yenileme korumak için lösemi inhibitör faktörü (LIF) ile kültüre.<sup&gt; 1</sup&gt; Ancak, LIF pahalı ve LIF/JAK/STAT3 yolun aktivasyonu kesinlikle kendini yenileme durumunu korumak için gerekli değildir.<sup&gt; 2</sup&gt; SC1 küçük molekül LIF için ekonomik bir alternatif olabilir. Ras-GAP ve ERK1 çift inhibisyonu yoluyla SC1 fonksiyonları.<sup&gt; 3</sup&gt; İllüstrasyon eylem mekanizması kendini yenileme temel moleküler mekanizmayı incelemek için yararlı bir araçtır. Burada SC1 varlığını göstermek ve kültür fare ES hücrelerinin için prosedür LIF yokluğunda kendini yenileme korumak mümkün olduğunu göstermektedir. SC1 ile kültüre hücreler LIF ile devam hücrelerine benzer morfoloji gösterdi. Her ikisi de beş pasajlar sonra normal fare ES morfolojisi sergiledi. Tipik pluripotency belirteçlerin İfade (Oct4, Sox2, Nanog, ve SSEA1) SC1 varlığı beş pasajlar sonra gözlendi. Ayrıca, SC1 fare ES hücreleri üzerinde hiçbir belirgin toksisite neden oldu.

Ras-GAP ve ERK1 çift inhibisyonu yoluyla SC1 fonksiyonları. Biz LIF yokluğunda fare ES hücre kendini yenileme destekleyen SC1 fonksiyonu test edilmiş ve SC1 fare ES hücre kültürleri kendini yenileme korumak mümkün olduğunu göstermiştir.

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Fare embriyonik kök (ES) hücreleri, kendilerini yenileme kapasitelerini korumak için geleneksel olarak Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF) ile kültüre edilir.1 Ancak, LIF pahalıdır ve ...

Merhaba, ben Boston'daki STEM Gen Laboratuvarı'ndan Sarah NAU. Bugün size, C one isimli küçük molekül varlığında fare embriyonik kök hücrelerinin kendi kendini yenileme özelliğinin sürdürülmesi prosedürünü göstereceğiz. Fare embriyonik kök hücreleri, normalde kendi kendini yenilemelerini sürdürmek için lösemi inhibitör faktörü varlığında kültüre edilirler.Ancak L pahalıdır. Bu nedenle burada ekonomik bir alternatif olan küçük molekül SC one'ı sunacağız. Videonun son bölümünde, L ortamında kültüre edilen hücreler ile SC one ortamında kültüre edilen hücreler arasındaki pluripotens marker ekspresyonunun bir karşılaştırmasını göstereceğiz.Haydi başlayalım. Embriyonik kök hücreleri kültüre etmeden bir gün önce, ışınlanmış feeder hücreleri içeren bir viyali çözün. Feeder hücrelerini kuyu başına 10,000 hücre yoğunluğunda ekleyin.Hücreleri 12 kuyucuklu bir plaka içerisinde, 37 °C'de ve %5 karbondioksit içeren ortamda gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, ES hücrelerini hazırlanmış feeder plakalarına, kuyucuk başına 50.000 hücre yoğunluğunda, istenen konsantrasyonlarda SC one ile desteklenmiş büyüme besiyerinde ekin; biz 100 nM, 300 nM ve 1 µM kullandık.Kontrol olarak, 1000 µg/mL LIF ile desteklenmiş bir kuyu ekliyoruz. Hücreleri 37 °C ve %5 CO₂ ortamında gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, sürekli kültürleme için medyayı yenileyin. Medyayı her 48 saatte bir yenileyin ve başlangıç ekim yoğunluğuna benzer bir yoğunluğu korumak için hücreleri üç ila dört günde bir 1:10 oranında pasajlayın. Beş pasajdan sonra, kök hücrelerin immünokimyasına başlamak için immünokimya kullanarak tipik pluripotens belirteçlerinin ekspresyonunu kontrol edebiliriz.Hücreleri PBS ile nazikçe üç kez yıkayarak başlayın. Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 500 microliters %4 paraformaldehit ile fikse edin. Hücreleri PBS ile üç kez daha yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca 500 microliters bloklama tamponu ile spesifik olmayan bağlanmaları engelleyin.Ardından, hücrelere 250 µL primer antikor ekleyin ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Bu deneyde, nano SOX2, SSEA1 ve OCT4 antikorları ile inkübasyon yapıyoruz. Bir dizi yıkama işleminin ardından, hücreleri 250 µL floresan boya konjuge ikincil antikor ile oda sıcaklığında, ışıktan uzak tutarak iki saat boyunca inkübe edin; hücreleri son kez yıkayın ve son yıkama aşamasında 1 µg/mL nihai konsantrasyonda DAPI ekleyin.Ardından, çekirdekleri boyamak için hücreleri beş dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, hücreleri floresan mikroskop altında analiz edin. Burada, farklılaşmamış durumda kendi kendini yenilemeyi sürdürmek için LIF veya SC one varlığında besleyici hücreler üzerinde büyütülmüş fare ES hücrelerinin parlak alan görüntüleri gösterilmektedir.Burada, beş pasaj boyunca sürdürülen fare ES hücreleri gösterilmektedir. Hücreler fikse edilmiş ve SSEA one OCT four ve nano ve SOX two için immünosito kimyasal yöntemle incelenmiştir. C one içerisinde sürdürülen hücrelerin marker ekspresyonu, LIF içerisinde sürdürülen hücrelerle benzerdi.Fare embriyonik kök hücrelerinde kendi kendini yenilemeyi sürdürmek için küçük molekül SC one'ın nasıl kullanılacağını size gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, test edilmemiş bir hücre hattında kullanılmadan önce optimal konsantrasyonu belirlemek için SC one'ın titre edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

the-use-sc1-pluripotin-to-support-mesc-self-renewal-absence

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz hızla belirlemek ve fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme düzenleyen genlerin karakterize bir floresan reporter assay açıklar.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Fare embriyonik fibroblastı, transkripsiyon faktörleri Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc'nin zorla ekspresyonu ile düşük verimlilikte indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanabilir. Yeniden programlama reaksiyonunun nadir ara ürünleri, hücre yüzeyi yapıcıları Thy-1.2, Ssea-1 ve Epcam'a karşı antikorlarla etiketleme yoluyla izole edilen FACS'dir.

Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Biz, toplu, verimli ve hızlı kimyasal reversion lineage astarlanmalıdır geleneksel insan pluripotent kök hücre (hPSC) bir epigenomically-kararlı saf Preimplantasyon epiblast benzeri pluripotent devlet için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem düşük lineage astarlanmalıdır gen ekspresyonu ve yönettiği multilineage ayrımında belirgin iyileşme geleneksel hPSC satırları arasında geniş bir repertuar sonuçlanır.

Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet

Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2'nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Proteaz Floresan Algılama Kit Florimetri kullanarak proteaz aktivitesi ölçümü için tasarlanmıştır. Ayrıca eser miktarda proteaz kontaminasyon tespiti için uygundur. Yöntem FITC etiketli kazein substrat özel bir formülasyon proteolitik hydroysis dayanmaktadır.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

Öğrenin, fare embriyonik kök hücrelerinde LIF olmadan SC1 kullanarak kendi kendini yenilemeyi nasıl sürdüreceğinizi. Bu maliyet etkin yöntem, pluripotentlik belirteçlerinin korunmasını sağlar.

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Daha fazla video keşfet