Name: Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-08T19:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Öğrenin, insan fibroblastlarını lentiviral vektörlerle yeniden programlayarak iPSC üretme yöntemini. Bu protokol, kök hücre biyolojisi ve rejeneratif tıpta kişiselleştirilmiş tedaviler için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Reprogramming <ol><li> 6 plaka başına 1 x 10 5 hücre yoğunluğu Tohum BJ hücreleri. Kültür hücrelerinin büyüme orta 2 ml (EMEM 450 ml, 50 ml ES nitelikli FBS, 5 ml 10 mM non-esansiyel amino asit, 5 ml penisilin / streptomisin, 5 ml 200 mM L-glutamin ve 0.9 ml 55 mM β ile desteklenmiş 37 o gecede merkaptoetanol) ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Aynı gün, 6 plaka su içinde seyreltilmesi jelatin% 0.1 ve 37 geceleme · C ve% 5 CO 2 kuluçka ekleyerek MEF besleyici plakaları hazırlanmaya başlayacak. </li><li> Inkübasyondan sonra, BJ hücrelerden orta kaldırmak ve her iyi polybrene 6 mikrogram / ml tamamlanan 2 ml besi, 500 ul hOct4 lentivirüs, 50 ul hSox2 lentivirüs, 50 ul hNanog lentivirüs ve 50 ul hLin28 lentivirüs ekleyin . Orta hatta kaplama sağlamak için plaka yavaşça sallayın. 37 ° ° C ve% 5 CO 2 gece inkübe. </li><li> Aynı gün, 1 şişe sıvı azot ve çözme CF-1 MEF hücrelerinin çıkarın. Jelatin kaplı kuyular (adım 1.2 &#39;ye bakınız) sıvı çıkarın ve 0,2 x 10 5 hücre / iyi bir yoğunluk MEF besleyici hücreler ekleyin. MEF büyüme orta (450 ml DMEM 50 ml FBS ve 5 ml non-esansiyel amino asitleri ile takviye) yanı başına toplam hacmi hücre 2ml olmalıdır. </li><li> Ertesi gün, 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de 0.05% tripsin / EDTA ve santrifüj BJ hücreleri ayırın. Büyüme orta, orta ve tekrar süspansiyon aspire. MEF besleyici plaka (adım 1.4 &#39;e bakınız), orta çıkarın ve 2 ml / BJ hücre süspansiyonu ekleyin. Hücre konsantrasyonu yaklaşık 5 x 10 4 hücre / iyi olmalıdır. 37 ° ° C ve% 5 CO 2 gece inkübe. </li><li> Orta 24 saat yeniden tohumlama sonra insan ES / iPS hücre kültürü, orta (DMEM/F12 400 ml, 100 ml Nakavt serum Yedek, 5 ml 10 mM non-esansiyel amino asit, 5 ml 200 mM L-glutamin, 0.9 ml ile takviye ile değiştirin 55 mM β-mercaptoethanol ve 20 ng / ml insan rekombinant bFGF). 7 gün boyunca her 24 saatte bir, orta değiştirin. </li><li> Yedi gün sonra, MEF klimalı ortamda orta değiştirme (bkz. Bölüm 2). </li></ol> 2. MEF Koşullu Orta hazırlanması <ol><li> Tohum CF-1, 2 x 10 5 hücre MEF besleyici hücreler / 2 ml MEF büyüme ortamında 6 plaka üzerinde . 37 ° ° C ve% 5 CO 2 gece inkübe. </li><li> Orta ve insan ES / iPS hücre kültür ortamı değiştirin. 37 ° ° C ve% 5 CO 2 gece inkübe. </li><li> Dört gün boyunca her 24 saatte bir süpernatant toplayın. 0.22 mikron filtre ile süpernatantı Filtresi. </li><li> BFGF 50 ng / ml supernatant Ek. </li></ol> 3. iPS Koloni Seçimi ve Pasajlanması <ol><li> CF-1 MEF besleyici hücreler ile hücre kültür yemekleri önceden numaralı seribaşı Stemolecule Y27632 10 mcM ile desteklenmiş insan ES / iPS kültür ortamı ES-benzeri bir koloni ve yeniden tohum seçin. 37 ° ° C ve% 5 CO 2 gece inkübe. </li><li> İlk yedi gün (Stemolecule Y27632 ile tamamlayan olmadan) için her 24 saatte bir, orta kültür değiştirin. Yedi gün sonra, MEF klimalı ortamda orta değiştirmek (hazırlık için bölüm 2&#39;ye bakınız). Tipik bir insan ES morfolojisi gösterdi kadar hücreleri Pasajlanması devam etti. </li></ol> 4. Pluripotency Belirteçleri İmmünositokimyasal Sınav <ol><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> 500 oda sıcaklığında 20 dakika fiksatif ul hücreleri sabitleyin. </li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında bir saat için 500 ul engelleme tampon ile non-spesifik bağlama engelleyin. </li><li> 4 geceleme birincil antikor ile 250 ul hücreleri ° C&#39;de (1:100 TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 dilüsyonları). </li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> (Anti-fare IgG Cy3 konjuge, Keçi anti-fare IgG Cy3 konjuge keçi anti-Sıçan IgM Cy3 konjuge ve keçi anti-Keçi kullanılan ışıktan uzak tutarak, hücrelerin oda sıcaklığında 1 saat süreyle 250 ul ikincil antikor ile inkübe Tavşan Cy3 konjuge) 1:300 dilüsyonları. </li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> Son yıkama DAPI (son konsantrasyonu 1 mcg / ml) ve çekirdekleri görselleştirmek için 5 dakika inkübe edin. </li><li> Büyütme altında hücrelerin analiz edin. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci Sonuçlar 1. Morfoloji Sonuçlar: İnsan sünnet derisi fibroblast (BJ) hücreleri, Sox2, Nanog ve Lin28 Oct4 birlikte transduced. Günde 4 post-transdüksiyon gibi erken morfolojik değişiklikler gözlenir ve hücre kümesi daha sıkı gün 17 (Şekil 1) dolu oldu. Kolonileri 25 gün elle aldı ve CF-1 MEF besleyici hücreler kültüre edildi. IPS hücrenin yeniden programlanması sonra koloni oluşumunu kolaylaştırmak için, biz Stemolecule Y27632ROCK inhibitörü, her geçiş sırasında ilk gecede tohumlama için. iyi morfolojisi iPS hücre kolonileri koloni üç sıralı mermi toplama ve Pasajlanması sonra gözlendi. 2. Pluripotency Markers İfade: Izole iPS hücre kolonileri karakterize etmek için, biz ES hücrelerinin ifade ortak pluripotency belirteçlerin varlığı için baktı. Koloniler güçlü alkalin fosfataz (AP) aktivitesi (Şekil 2) sergiledi. Ayrıca, immünsitokimya (ICC) yüzey belirteçleri TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 ve SSEA-3 gibi nükleer belirteçlerinin de dahil olmak üzere, pluripotency marker spesifik antikorların bir panel ile iPS hücre kolonileri yapıldı Oct4, Sox2 ve Nanog. Izole iPS koloniler Tüm göstergeler için pozitif (Şekil 3). ICC sonuçları iPS hücreleri bu iPS hücreleri farklılaşmamış insan ES hücreleri yakından benzediği gösteren uygun pluripotency işaretleyici ifade desenini ortaya koyduğu göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Morfolojik değişiklikler BJ hücreleri transduced. Aydınlık alan görüntüleri, tipik bir iPS hücre kolonisinin (A) 4 gün ve (B) 17 gün sonrası transdüksiyon kurdu. <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: AP reprogrammed BJ hücreleri aktivite. Üç farklı koloniler Stemgent Alkalin Fosfataz Boyama Seti ile boyandı. <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: yüzey belirteçleri TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 ve SSEA-3, ve nükleer belirteçler Eki 4, Nanog ve Sox2: İnsan iPS hücreleri aşağıdaki ES hücre spesifik belirteçler yüksek düzeyde ifade.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (1917).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+Rho%2FROCK+pathway+reduces+apoptosis+during+transplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors.</a> J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).</li>
</ol>

Bu makalenin yazarları, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Stemgent tarafından istihdam edilmektedir.

Bu sonuçlar, insan fibroblastlarında transkripsiyon faktörleri transduced Stemgent İnsan TF lentivirüs Set verimli ektopik ifade uyararak iPS koloniler oluşturmak için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Reprogramming deneyler tasarlarken, çok değişkenli reprogramming verimliliği optimize etmek için düşünülmelidir. İlk olarak, aktif virüs hedef oranı (enfeksiyon, İçişleri Bakanlığı, çokluk) optimum transduction verim elde etmek için birincil transdüksiyon adım sırasında değiştirilmesi gerekir. İkinci olarak, hedef hücrelerin büyüme durumu yeniden programlama etkileyebilir. Sağlıklı ve proliferatif hücreleri yeniden programlama için daha müsait. Üçüncü olarak, farklı hücre numaraları için protokol değiştirerek, hedef hücre numaraları kültür çanak yüzey alanı ile orantılı ayarlanabilir olması tavsiye edilir. Son olarak, son çalışmaların artırılması embriyonik kök koloni hayatta kalma kendi programını gösterdiği gibi, başarılı bir yeniden programlama yardımcı olmak için ROCK inhibitörleri gibi Y27632 başvurusu dikkate alınması gerekir. 4,5

<table><tbody><tr><td>İnsan TF Lentivirüs Seti</td><td>Stemgent</td><td>00-0005</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Y27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-81 antikoru</td><td>Stemgent</td><td>09-0012</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 antikoru</td><td>Stemgent</td><td>09-0009</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 antikoru</td><td>Stemgent</td><td>09-0003</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-3 antikoru</td><td>Stemgent</td><td>09-0014</td><td></td></tr></tbody></table>

stemgent İnsan tf lentivirüs İnsan fibroblastlar yeniden programlanması bağlı pluripotent kök hücre Üretimi ayarla

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Yamanaka ve arkadaşları 2006 yılında, ilk Oct4, retrovirüs aracılı teslimat ve ifade, Sox2, c-Myc ve Klf4 fare fibroblastlar pluripotent devlet tetikleme kapasitesine sahip olduğunu göstermiştir. 1 aynı grup aynı zamanda insan somatik hücre başarılı bir şekilde yeniden programlanması halinde rapor başka bir dizi faktöre lentivirüs aracılı co-ifade (Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 retroviral vektörler aynı transkripsiyon faktörleri tarafından teslim insan sürümlerini kullanan bağlı pluripotent kök (iPS) hücreleri, 2 Ayrıca, James Thomson ve ark. ) iPS hücreleri içine insan somatik hücre yeniden programlama yeteneğine sahip olan 3 iPS hücreleri morfolojisi, çoğalması ve vücudun tüm doku tiplerine ayırt etme yeteneği ES hücrelere benzer. İnsan iPS hücreleri embriyo imha etik ikilem olmadan ES hücrelerinin temel özellikleri sergilerler ES hücreleri üzerinde ayrı bir avantajı var. Hastaya özgü iPS hücreleri üretimi, kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp tedavilere olmayan otolog nakledilen hücrelerin bağışıklık ret potansiyeli ortadan kaldırarak önemli bir barikat circumvents. Burada Stemgent İnsan TF lentivirüs Set kullanarak insan fibroblast hücreleri yeniden programlama için protokol göstermektedir. Ayrıca bu set ile reprogrammed hücreleri morfolojisi dört gün sonrası transdüksiyon iPS göstermeye başladığını göstermektedir. Stemolecule Y27632 kullanarak, toplama ve koloni üç sıralı mermi Pasajlanması sonra iPS hücreleri ve gözlenen doğru morfolojisi için seçti. Biz de göstermektedir ki hücreleri yeniden programlama pluripotency işaretleyici AP, yüzey belirteçleri TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 ve SSEA-3, ve nükleer belirteçler Oct4, Sox2 ve Nanog görüntülenir.

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

2006 yılında Yamanaka ve meslektaşları, Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4'ün retrovirüs aracılı iletim ve ekspresyonunun ... indükleyebildiğini ilk kez göstermişlerdir.

Merhaba, benim adım Brad Hamilton. STEM Gen'in Araştırma ve Geliştirme departmanında görev yapan bir bilim insanıyım. Bugün size, lentiviral yolla iletilen yeniden programlama faktörlerini kullanarak insan fibroblastlarının nasıl yeniden programlanacağına dair bir prosedür göstereceğiz.Bu prosedür, hem iPS hücreleri üretmek hem de yeniden programlama sürecini incelemek için kullanılabilir. iPS hücreleri; morfoloji, proliferasyon, farklılaşma yeteneği ve vücudun tüm doku türlerine dönüşebilme özellikleri bakımından ES hücrelerine benzerler. İnsan iPS hücreleri, hücreleri elde etmek için bir embriyoyu yok etmenin getirdiği etik ikilem olmadan ES hücrelerinin temel özelliklerini sergiledikleri için ES hücrelerine göre belirgin bir avantaja sahiptir.Hastaya özgü iPS hücrelerinin üretimi, otolog olmayan nakledilmiş hücrelerin immün reddedilme olasılığını ortadan kaldırarak kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp tedavilerinin önündeki önemli bir engeli aşmaktadır. Öyleyse başlayalım. Bu protokolün çeşitli aşamalarında, gelişmekte olan iPSC veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin besiyerini, meth kondisyonlu besiyeri ile değiştireceksiniz.Bu ortamın hazırlanması altı gün sürer. Bu nedenle, deneyinize başlamak istediğiniz tarihten en az bir hafta önce hazırlıklara başlayın. Başlamak için, altılı bir plağın her kuyucuğuna ekim yapın.İki mililitre meth büyüme ortamında 2 × 10⁵ cfu meth feeder hücreleri içeren kuyucuklu plak, 37 °C ve %5 karbon dioksit altında gece boyu inkübe edilir. Ertesi gün, ortam insan E-S-I-P-S hücre kültürü ortamı ile değiştirilir.Besiyerini 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin. Süpernatantı toplayın ve dört gün boyunca her 24 saatte bir taze besiyeri ile değiştirin. Süpernatantı 0,22 µm'lik bir filtreden süzün.Toplanan süpernatantı, mililitre başına 15 nanogram BFGF bazal fibroblast büyüme faktörü ile destekleyin. Toplamda yaklaşık 16 mililitre meth kondisyonlu ortam elde edeceksiniz; her gün toplanan süpernatantı 4 °C'de ayrı ayrı saklayın. Meth kondisyonlu ortam 4 °C'de bir ila iki hafta veya -20 °C'de birkaç ay boyunca saklanabilir.Met kondisyonlu ortamınızın ihtiyacınız olduğunda hazır olduğundan emin olduğunusa göre, hücrelerin hazırlanması hakkında konuşalım. iPSC oluşturmadaki ilk görev, lentivirüsler kullanarak insan sünnet derisi fibroblast hücrelerini veya BJ hücrelerini, kök hücrelerin karakteristik dört transkripsiyon faktörü ile transdüse etmektir. Transdüksiyona hazırlanmak için, BJ hücrelerini altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucuk başına 1×10⁵ hücre yoğunluğunda ekleyin ve kültüre edin.Hücreler, aynı gün içinde 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında, iki mililitre büyüme ortamında gece boyunca inkübe edilir. Altı kuyucuklu bir plakaya, su ile seyreltilmiş 0,1% jelatinin iki mililitresi eklenip 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edilerek besleyici plakaların hazırlanmasına başlanır. Jelatin, kuyucukları kaplayarak hücreler için bir matriks görevi görür.Artık BJ hücreleri, transdüksiyon için virüsü hazırlamak amacıyla lentiviral transdüksiyona hazırdır. İki mililitre taze besiyerini, mililitre başına altı mikrogram polybrene ve her biri insan transkripsiyon faktörlerinden birini eksprese eden dört lentivirüs (T4, SO2, nanog ve lin28) ile destekleyin; öyle ki her biri aynı enfeksiyon çokluğu veya MOI değerinde olsun.Bu lentivirüslerin tamamı insan yeniden programlama faktörü lentivirüs setinde yer almaktadır. Transdüksiyonu gerçekleştirmek için BJ hücre büyüme ortamını, virüs içeren ortamla değiştirmeniz yeterlidir. Ortamın tabana eşit şekilde yayılması için plakayı nazikçe sallayın.Aynı gün, 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Sıvı azottan bir şişe cf one meth feeder hücresi çıkarın ve çözdürün. Jelatin solüsyonunu, her biri şu an jelatin kaplı olan meth feeder plaklarından uzaklaştırın.İki mL meth büyüme ortamına 0,2 × 10⁵ hücre ekleyin. MES'i 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, BJ hücrelerini %0,05 tripsin EDTA ile ayırın ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.Santrifüj işleminin ardından, süpernatan aspire edilsin ve hücreler büyüme ortamında yeniden süspande edilsin. Meth feeder plağındaki ortam uzaklaştırılsın ve her kuyucuğa iki mililitre BJ hücre süspansiyonu eklensin. BJ hücre konsantrasyonu, kuyucuk başına yaklaşık 5 × 10⁴ hücre olmalıdır.37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. BJ hücrelerinin meth feeder plağı üzerinde yerleşmesinden 24 saat sonra, besiyerini insan E-S-I-P-S (embriyonik kök hücre veya indüklenmiş pluripotent kök hücre kültür besiyeri) ile değiştirin. Besiyeri değişimine yedi gün boyunca her 24 saatte bir devam edin.Yedinci günde, ES hücre kültür ortamını iki mililitre meth kondisyonlu ortam ile değiştirin. Meth feeder hücreleri, iPS hücrelerinin büyümesi için gereken çözünür faktörleri sağlamaktaydı. Ancak şimdi, kültürün sağlıklı kalmasını sağlamak için bu faktörlerden daha fazlasını eklememiz gerekiyor.Meth koşullandırılmış ortam, 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edilen meth besleyici hücreleri tarafından salgılanan tüm çözünür faktörleri içerir. Mikroskop altında bir hücre kolonisi seçin. 24 saat önce ccf-1 meth besleyici hücreleri ile hazırlanmış taze bir 24 kuyucuklu plakada, küçük kompakt kubbe benzeri görünümüyle ayırt edilen seçili koloniyi insan E-S-I-P-S kültürüne aktarın.10 µM stem molekül Y 2 7 6 3 2 ile takviye edilmiş besiyeri. Bağımlı bir kinaz inhibitörü. İlk yedi gün boyunca, her 24 saatte bir stem molekül Y 2 7 6 3 2 takviyesi yapmadan kültür besiyerini değiştirin.Yedi gün sonra besiyerini meth. Condition besiyeri ile değiştirin. Hücreler tipik insan ES hücresi morfolojisi gösterene kadar pasajlamaya devam edin. Keskin kenarlı, küçük ve kompakt kubbe benzeri koloniler arayın.Koloniler tekdüze olmalı ve çekirdek-sitoplazma oranı yüksek olmalıdır. Bu noktada, ES hücreleri morfolojisine sahip koloniler geliştirmiş oldunuz; ancak bu koloniler aynı zamanda ES hücrelerine özgü genleri de eksprese ediyor mu? Bunu belirlemek için kolonileri TRA 180 1, TRA one 60, SSEA four s, SE, a three, T four, sox, two, nanog ve SSEA one gibi pluripotens markerları için boyayın. Başlamak için hücreleri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.Ardından, hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 500 µL %4 paraformaldehit veya başka bir fissat ile fikse edin. 20 dakika sonra, fazla fissatı uzaklaştırmak için hücreleri 3 kez daha PBS ile yıkayın. Sonra, hücreleri her kuyucukta 500 µL bloklama tamponu ile oda sıcaklığında bir saat inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. Bloklama adımından sonra, her birine bloklama tamponunda 1:100 oranında seyreltilmiş 250 µL primer antikor ekleyin.Hücreleri bir gece boyunca 4 °C'de primer antikor ile inkübe edin. Bağlanmamış primer antikoru uzaklaştırmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri, 1:300 oranında seyreltilmiş sekonder antikor ve bloklama tamponu içeren 250 µL çözelti ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; fotobeleçingden kaçınmak için sekonder antikorla inkübasyon sonrası ışık almayan bir yerde tutun.Hücreleri üçüncü yıkamaya kadar üç kez PBS ile yıkayın. Çekirdekleri boyamak için mililitre başına bir mikrogram DPI ekleyin. Son olarak, iPS hücrelerinizin gen ekspresyonunu analiz edin.Mikroskop altında morfoloji sonuçlarında, T4, SOX2, Nanog ve Lin28 ile birlikte transduce edilen insan dört deri fibroblast hücresinde, transduksiyon sonrası dördüncü gün kadar erken bir dönemde morfolojik değişiklikler gözlemlenmiş ve hücre kümeleri 17. günde daha sıkı paketlenmiş hale gelmiştir. İzole edilen iPS hücre kolonilerini daha ayrıntılı karakterize etmek için, ES hücrelerinde eksprese edilen yaygın pluripotensi markerlarının varlığını inceledik. Koloniler güçlü alkalin fosfataz aktivitesi göstermiştir.Ek olarak, yüzey belirteçleri TA 180 1 TRA one 60 SSEA four ve SS EEA three ile nükleer belirteçler T four, SOX two ve Nanog'u içeren bir plüripotens belirteç spesifik antikor paneli ile iPS hücre kolonlarında immünokimya veya ICC gerçekleştirilmiştir. İzole edilen iPS kolonları tüm belirteçler için pozitif sonuç vermiştir. ICC sonuçları, iPS hücrelerinin uygun plüripotens belirteç ekspresyon paterni sergilediğini ve bu iPS hücrelerinin diferansiye olmamış insan ES hücrelerine yakından benzediğini göstermektedir.İnsan fibroblastlarının stem gen'ler ile yeniden programlanması yoluyla iPS hücrelerinin nasıl üretileceğini size göstermiş olduk. İnsan yeniden programlama faktörü lentivirüs seti. Bu prosedür uygulanırken, birkaç faktörün dikkate alınması önemlidir.İlk olarak, optimum transdüksiyon verimliliğine ulaşmak için primer transdüksiyon adımında aktif virüs/hedef hücresi oranı modifiye edilmesi gerekebilir. İkinci olarak, hedef hücrelerin büyüme koşulları etkili olabilir. Sağlıklı ve proliferatif hücrelerin yeniden programlanması, yeniden programlamaya daha uygundur.Üçüncü olarak, protokol farklı hücre sayıları için modifiye edilirken, hedef hücre sayılarının kültür kabının yüzey alanıyla orantılı olarak ayarlanması önerilir. Son olarak, güncel çalışmaların insan iPSC kolonlarının sağkalımını artırmadaki faydasını göstermesi nedeniyle, başarılı bir yeniden programlamayı sağlamaya yardımcı olmak için Y 2 7 6 3 2 gibi rock inhibitörlerinin uygulanması düşünülmelidir. İşte böyle.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-reprogramming-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

OCT4 bir retrovirüs-aracılı ektopik ifadesi ile insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (iPSCs) üretmek için bir yöntem olup, SOX2, KLF4 ve MYC tarif edilmektedir. GFP dayanarak insan iPSC koloniler tespit etmek pratik bir yolu da tartışılmaktadır.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, yeniden programlama faktörleri içeren matrigel ve Sendai virüs vektörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, besleyicisiz koşullarda insan periferik T hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nasıl üretileceğini açıklar.

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Bu protokol, insan dermal fibroblastlarında hemojenik bir programın hematopoetik kök ve döl hücreleri üretmek için gata2, GFI1B ve FOS transkripsiyon faktörlerinin zorunlu ekspresyonu ile indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Öğrenin, insan fibroblastlarını lentiviral vektörlerle yeniden programlayarak iPSC üretme yöntemini. Bu protokol, kök hücre biyolojisi ve rejeneratif tıpta kişiselleştirilmiş tedaviler için temel oluşturur.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Daha fazla video keşfet