Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Merhaba, benim adım Brad Hamilton. Bugün size, lentiviral olarak verilen yeniden programlama faktörlerini kullanarak insan fibroblastlarının nasıl yeniden programlanacağına dair bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedür hem IPS hücreleri oluşturmak hem de yeniden programlama sürecini incelemek için kullanılabilir. IPS hücreleri, morfoloji, proliferasyon ve farklılaşma yeteneği ve vücudun tüm doku tipleri açısından ES hücrelerine benzer. İnsan IPS hücreleri, hücreleri elde etmek için bir embriyoyu yok etmek gibi etik bir ikilem olmaksızın ES hücrelerinin temel özelliklerini sergiledikleri için ES hücrelerine göre belirgin bir avantaja sahiptir.

Hastaya özgü IPS hücrelerinin oluşturulması, otolog olmayan nakledilen hücrelerin bağışıklık reddi potansiyelini ortadan kaldırarak kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp tedavilerinin önündeki önemli bir engeli aşmaktadır. Öyleyse başlayalım. Bu protokolün birkaç noktasında, gelişmekte olan IPSC veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin ortamını metamfetamin şartlandırılmış ortamla değiştirirsiniz.

Bu ortamın hazırlanması altı gün sürer. Bu nedenle, denemenize başlamak istemeden en az bir hafta önce başlayın. Başlamak için, her altı kuyusunu tohumlayın.

İki mililitre metamfetamin büyümesinde iki kez 10 ila beşinci cf bir meth besleyici hücrelere sahip kuyu plakası. Orta: Gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, ortamı insan E-S-I-P-S hücre kültürüne değiştirin.

Orta: Gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Süpernatanı toplayın ve dört gün boyunca her 24 saatte bir taze ortamla değiştirin. Süpernatanı 0.22 mikrometrelik bir filtreden süzün.

Toplanan süpernatanı mililitre BFGF temel fibroblast büyüme faktörü başına 15 nanogram ile destekleyin. Her gün toplanan süpernatanı dört derece SIU'da ayrı ayrı yaklaşık 16 mililitre metamfetamin şartlandırılmış orta depoya sahip olacaksınız. Metamfetamin şartlandırılmış ortam, dört santigrat derecede bir ila iki hafta veya eksi 20 santigrat derecede birkaç ay saklanabilir.

Artık metamfetamin şartlandırılmış ortamınızın ihtiyacınız olduğunda hazır olacağından emin olduğunuza göre, hücreleri hazırlamaktan bahsedelim. IPSC üretmenin ilk görevi, insan sünnet derisi fibroblast hücrelerini veya kök hücrelerin dört transkripsiyon özelliğine sahip BJ hücrelerini transdüle etmek için lentivirüsleri kullanmaktır. Transdüksiyon için hazırlanmak için, BJ hücrelerini altı oyuklu bir plaka ve kültürün oyuklu başına 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda tohumlayın.

İki mililitre büyümedeki hücreler, gece boyunca 37 santigrat derecede orta ve aynı gün% 5 karbondioksit. Altı oyuklu bir plakaya su ile seyreltilmiş iki mililitre %0.1 jelatin ekleyerek ve gece boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte inkübe ederek meth besleme plakalarını hazırlamaya başlayın. Jelatin kuyuları kaplar ve bunlar için bir matris görevi görür.

Artık BJ hücreleri, virüsü transdüksiyona hazırlamak için lentiviral transdüksiyona hazırdır. İki mililitre taze ortamı, mililitre poli beyin başına altı mikrogram ve her biri insan transkripsiyon faktörlerinden birini ifade eden dört lentivirüs ile destekleyin. T dört, SO iki nanog ve lin 28, öyle ki her biri aynı enfeksiyon veya MOI çokluğunda.

Bu lentivirüslerin tümü, insan yeniden programlama faktörü lentivirüs setine dahil edilmiştir. Transdüksiyonu gerçekleştirmek için, BJ hücre büyüme ortamını virüs içeren ortamla değiştirmeniz yeterlidir. Plakayı yavaşça sallayın, böylece ortam tabanı eşit şekilde kaplar.

Aynı gün 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte gece boyunca inkübe edin. Sıvı nitrojenden bir şişe cf bir meth besleyici hücreyi çıkarın ve çözdürün. Jelatin çözeltisini, artık her birine jelatin kaplı olan metamfetamin besleme plakalarından çıkarın.

İki mililitre metamfetamin büyümesinde beşinci hücrelere 0.2 çarpı 10 ekleyin. Orta. MES'i gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, BJ hücrelerini %0.05 tripsin EDTA ile ayırın ve beş dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve hücreleri büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Ortamı meth besleme plakasından çıkarın ve BJ hücre süspansiyonunun oyuğu başına iki mililitre ekleyin. BJ hücre konsantrasyonu, kuyucuk başına yaklaşık beş kez 10 ila dördüncü hücre olmalıdır.

Gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Geri çekildikten 24 saat sonra, metamfetamin besleyici plakadaki BJ hücreleri, ortamı embriyonik kök kök veya indüklenmiş pluripotent kök hücre kültürü olan insan E-S-I-P-S ile değiştirin. Orta. Ortamı yedi gün boyunca her 24 saatte bir değiştirmeye devam edin.

Yedinci günde, ES hücre kültürü ortamını iki mililitre metamfetamin şartlandırılmış ortamla değiştirin. Metamfetamin besleyici hücreler, IPS hücrelerini büyütmek için gereken çözünür faktörleri sağlamaktadır. Ama şimdi kültürü sağlıklı tutmak için bu faktörlerden daha fazlasını eklememiz gerekiyor.

Metamfetamin şartlandırılmış ortam, metamfetamin besleyici hücreler tarafından salgılanan tüm çözünür faktörleri içerir, gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edilir. Kapsama bakarak bir hücre kolonisi seçin. 24 saat önce ccf ile geçirdiğiniz 24 oyuklu taze bir plakada küçük, kompakt bir kubbe benzeri görünümle ayırt edilen bir metamfetamin besleyici hücreler, insan E-S-I-P-S kültüründe seçilen koloniyi geri çeker.

10 mikromolar kök molekülü Y 2 7 6 3 2 ile desteklenmiş ortam. Bağımlı bir kinaz inhibitörü. İlk yedi gün boyunca her 24 saatte bir kök molekülü Y 2 7 6 3 2 ile takviye etmeden kültür ortamını değiştirin.

Yedi gün sonra ortamı meth olarak değiştirin. Ortamın durumu, tipik insan ES hücre morfolojisini gösterene kadar hücreleri geçmeye devam eder. Keskin kenarlı koloniler gibi küçük, kompakt kubbe arayın.

Koloniler tek tip olmalı ve yüksek bir çekirdek / sitoplazma oranına sahip olmalıdır. Bu noktada, ES hücrelerinin morfolojisine sahip koloniler geliştirdiniz, ancak bunlar aynı zamanda ES hücrelerinin karakteristik genlerini de ifade ediyorlar mı? Bulmak için, kolonileri TRA 180 1, TRA bir 60 SSEA, dört s, SE, üç T, dört sox, iki nanog ve SSEA bir gibi pluripotent belirteçler için boyayın: Başlamak için, hücreleri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.

Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 500 mikrolitre% 4 paraform, aldehit veya başka bir fiksatif ile sabitleyin. 20 dakika sonra, fazla fiksatifi çıkarmak için hücreleri PB S3 ile bir kez daha yıkayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca oyuk başına 500 mikrolitre bloke edici tampon içinde inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin Bloke etme adımından sonra, her birine bir ila 100 oranında seyreltilmiş 250 mikrolitre primer antikor ekleyin.

Hücreleri ertesi gün dört santigrat derecede gece boyunca birincil antikorda inkübe edin. Bağlanmamış primer antikoru çıkarmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri, biri 300 ila 300 oranında seyreltilmiş 250 mikrolitre ikincil antikor ile inkübe edin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca tamponu bloke edin, ikincil antikor ile inkübasyondan sonra fotoağartmayı önlemek için ışıktan uzak tutun.

Hücreleri üçüncü yıkamaya kadar PBS ile üç kez yıkayın. Çekirdeği boyamak için mililitrede bir mikrogram DPI ekleyin. Son olarak, bakın, IPS hücrelerinizin gen ifadesini analiz edin.

Mikroskop morfoloji sonuçları altında, manşonun T, dört SOX, iki nanog ve lin 28 ile transdüksiyona tabi tutulduğu insan dört cilt fiberblast hücresi, transdüksiyondan sonraki dördüncü gün gibi erken bir tarihte morfolojik değişiklikler gözlendi ve hücre kümesi, plurry potens belirteçlerinin 17. gününde daha sıkı bir şekilde paketlendi. İzole edilmiş IPS hücre kolonilerini daha fazla karakterize etmek için, ES hücrelerinde eksprese edilen ortak pluripotens belirteçlerinin varlığını aradık. Koloniler güçlü alkalin fosfataz aktivitesi sergiledi.

Ek olarak, IPS hücre kolonileri üzerinde, TA 180 1 TRA bir 60 SSEA dört ve SS EEA üç yüzey belirteçleri ve ayrıca nükleer belirteçler, T dört, SOX iki ve Nanog dahil olmak üzere pluripotens işaretleyici spesifik antikorlardan oluşan bir panel ile gerçekleştirildi. İzole edilen IPS kolonileri tüm belirteçler için pozitifti. ICC sonuçları, IPS hücrelerinin uygun pluripotens belirteç ekspresyon paterni sergilediğini ve bu IPS hücrelerinin farklılaşmamış insan E es hücrelerine çok benzediğini göstermektedir.

İnsan fibroblastlarını kök genlerle yeniden programlayarak IPS hücrelerinin nasıl üretileceğini gösterdik. İnsan yeniden programlama faktörü lentivirüs seti. Bu prosedürü yaparken, birkaç faktörü hesaba katmak önemlidir.

İlk olarak, optimum iletim verimliliğini elde etmek için birincil iletim adımı sırasında aktif virüsün hedef oranının değiştirilmesi gerekebilir. İkincisi, hedef hücrelerin büyüme durumu etkileyebilir. Sağlıklı ve proliferatif hücrelerin yeniden programlanması, yeniden programlamaya daha uygundur.

Üçüncüsü, farklı hücre sayıları için protokolü değiştirirken, hedef hücre sayılarının kültür kabının yüzey alanıyla orantılı olarak ayarlanması önerilir. Son olarak, Y 2 7 6 3 2 gibi kaya inhibitörlerinin uygulanması, son çalışmalar insan evet kolonisinin sağkalımını arttırmadaki faydasını gösterdiğinden, başarılı bir yeniden programlamanın sağlanmasına yardımcı olmak için düşünülmelidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.