İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Merhaba, ben STEM Gen'den Leah Kent. Bugün size insan embriyonik kök hücrelerinin nasıl çözüleceğini ve dondurulacağını göstereceğiz. Haydi başlayalım.

İnsan embriyonik kök hücrelerini çözmek için, bir kriyoviyal sıvı azottan çıkarılır ve hızla çözdürülür. 37 °C'lik bir su banyosunda, hücre süspansiyonu kriyoviyalden insan ES hücre kültürü ortamı ile seyreltilmiş konik bir tüpe aktarılır ve santrifüj edilir. Küçük bir hücre peleti oluşturmak için önce süpernatan uzaklaştırılır ve ardından hücre peleti, daha önce ışınlanmış meth feeder tabakası ile kaplanmış altı kuyucuklu bir hücre kültürü plağının tek bir kuyucuğuna ekilmeden önce tüp içinde taze insan ES hücre kültürü ortamı ile yeniden süspande edilir.

İnsan ES hücrelerini çözmekten bir gün önce, jelatin kaplı altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğunda, MEF kültür ortamında ışınlanmış fare embriyonik fibroblastlarından oluşan bir feeder tabakası hazırlayın. Plağı 37 °C ve %5 karbon dioksit altında gece boyunca inkübe edin.

Verimli ve başarılı bir çözme işlemi sağlamak için tüm gerekli ekipman ve reaktiflerin hazır olduğundan emin olun. İnsan ESL'sini sıvı azottan çıkarmadan önce, metal penset kullanarak sıvı azot depolama tankından bir kriyojenik tüp insan ESL çıkarın.

Viyali eldivenli ellerinizin arasında üç ila beş saniye boyunca yuvarlayın. Donmuş tabakayı temizlemek için metal pens kullanarak viyalin etiketindeki bilgileri kaydedin. Viyali 37 °C'lik bir su banyosuna daldırın.

Viyali hafifçe çalkalayın ve buz kristalinin boyutunu görmek için viyali ışığa tutarak çözünme sürecini sık sık ancak hızlıca gözlemleyin. Hücrelerin kontamine olmaması için viyalin kapağını su banyosuna daldırmayın.

Sadece küçük bir buz kristali kaldığında, sterilizasyon için steril bir biyolojik güvenlik kabini içinde viyali etanola daldırın, kriyojenik viyalin içeriğini doğrudan 15 mililitrelik konik bir tüpün altına aktarın. Tüpe yavaşça dört mililitre insan ES hücresi kültür ortamı ekleyin.

Yeni besiyeri tüpe eklenirken, hücrelerin sürekli karışması için tübü nazikçe sallayın. Human E es hücrelerini santrifüjle 200 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha önce hazırlanmış olan meth feeder plağını 37 derece Celsius inkübatörden çıkarın ve üzerine hücre hattı, pasaj numarası ve çözülme tarihi gibi uygun human ESL bilgilerini yazarak etiketleyin.

MEF kültür ortamını aspire edin ve kuyucuğa bir mililitre PBS ekleyin. Pellet haline getirilmiş insan E ESL hücrelerini biyolojik güvenlik kabinine geri getirin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre pelletini aspire etmemeye dikkat edin, ancak dondurma ortamından gelen DMSO içerdiğinden dolayı süpernatanın mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın.Resus.

2,5 mililitre insan ESL kültür medyumu ekleyerek pelletini çok nazikçe süspanse edin. Beş mililitrelik bir cam pipet kullanarak ve üç ila dört kez pipetleme yaparak MEF feeder kuyucuğundaki PBS'yi aspire edin. Hazırlanmış altı kuyucuklu plaka kuyucuğuna, insan ES hücre süspansiyonunun tamamını (2,5 mililitre) yavaşça ekleyin.

Plakayı 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin kuyu boyunca eşit şekilde dağılması için plağı dikkatlice öne arkaya ve yanlara doğru kaydırın. Kolonilerin merkezde toplanmasını önlemek için plağı dairesel hareketlerle sallamayın.

Çözme işlemini takip eden gün, hücrelerin 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca yapışmalarını sağlayın. Yüzen hücreleri içeren besiyerini uzaklaştırın ve kuyucuğa 2,5 mL taze insan ES hücresi kültür besiyeri ekleyin.

Plakaları 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin ve koloniler pasajlanmaya hazır olana kadar kültüre etmeye devam edin. İnsan ES hücresi dondurma protokolü, altı kuyucuklu bir plakada kültüre edilmiş sağlıklı, orta büyüklükteki insan ES hücresi kolonileri ile başlar. Kültür kollagenaz four enzimi ile inkübe edildikten sonra koloniler, beş mililitrelik bir cam pipetle kazınarak konik bir tüpe toplanır ve gevşek bir hücre peleti oluşturmak için santrifüjlenir.

Süpernatant aspire edildikten sonra, hücre peleti yeniden süspanse edilir. Önce insan ES hücre kültür medyumu ile, ardından iki katlı kriyokoruma medyumu ile seyreltilir. Hücreler bir mililitrelik alikotlara eşit şekilde dağıtılır ve kriyojenik tüplerde dondurulur.

Hücreler santrifüjdeyken, güvenlik kabininin içindeki kriyojenik tüpleri hücre hattı pasaj numarası ve dondurma tarihi ile etiketleyin. İnsan E es hücrelerini dondurmak için tipik yoğunluk, altı kuyucuklu bir plakadan bir kuyucuktaki hücrelerin bir kriyojenik tüpe konulmasıdır. İnsan E ESL santrifüj edildiğinde, tüpü biyolojik güvenlik kabinine geri getirin.

Tüpteki süpernatanı aspire edin. Gevşekçe toplanmış hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek, hücre peletini uygun miktarda insan ESL kültürü ile yeniden süspande edin.

Kriyojenik tüp başına 0,5 mililitre insan ESL kültür ortamı. Pipetleme işlemini çok nazikçe yapın, çünkü insan E es hücreleri nispeten büyük koloni parçaları halinde dondurulduğunda daha iyi toparlanır; tüpü yavaşça ve nazikçe sallarken, hücrelere uygun miktarda iki x insan E es hücre dondurma ortamı ekleyin.

Dondurma ortamı eklendikten sonra, çözelti pipetleme yoluyla çok nazikçe bir ila iki kez hızlıca karıştırılır ve her bir kriyojenik tüpe bir mililitre hücre süspansiyonu nazikçe eklenir. Tüpler bir izopropanol dondurma kabına aktarılır ve gece boyunca -80 °C dondurucuya yerleştirilir. Hücreler, izopropanol dondurma kabı içerisinde ertesi güne kadar dakikada 1 °C hızla donacaktır.

Dondurulmuş tüpleri metal penset kullanarak hızlıca bir sıvı azot saklama tankına aktarın. İnsan ES hücreleri çözüldükten sonraki ilk gün, küçük koloniler şeffaf görünebilir ve mikroskop altında görülmeleri zor olabilir. Yeni çözüldükleri için, insan e ESL'ler nispeten yavaş çoğalma eğilimindedir.

Yerleşmiş koloniler şeklinde görünmeleri kültürde birkaç gün sürebilir. Size insan embriyonik kök hücre kültürlerinin nasıl çözüleceğini ve dondurulacağını göstermiş olduk. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.