Name: Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 47 s
Description: Öğrenin, ISTH tekniğiyle virüs spesifik CD8+ T hücreleri ve enfekte hücreler arasındaki uzamsal ilişkileri görselleştirin. Bu yöntem, bağışıklık yanıtlarını in situ haritalandırarak enfeksiyon sonuçlarını değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz J. Sedgewick gümüş taneleri görüntülerini yakalamak için konfokal mikroskop kurma yardım için teşekkür ederiz; Ulusal Araştırma Kaynakları hibe Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüsü, araştırma hibeleri AI48484 (ATH), AI20048 (RA) ve AI066314 (CJM) tarafından kısmen desteklenen. RR00169 (CNPRC, University of California, Davis).

Bu yöntem bildirilen araştırma <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li ve ark, Bilim 323, 1726-1729 (2009)</a> . , In situ tetramer boyama ve in situ hibridizasyon (ISTH) prosedürleri birlikte Antijen spesifik CD8 ISTH prosedürleri 4 adımda içine bölünmüş olması.:) 1 IST boyama + dokularda T hücreleri; 2) virüs-virüslü-RNA + hücreleri tespit için ISH; 3) IST-boyanan hücreler ve viral-RNA konfokal mikroskopik görüntüleme + hücreleri; 4) görüntü analizi, görüntü montajı inşaat ve haritalama tetramer + ve virüs RNA + hücreler de dahil olmak üzere. 1. IST boyama antijen-spesifik CD8 + T hücreleri, doku kesitlerinde. <ol><li> Vibratome veya neşter kullanılarak 200 um kalınlığında kesitler taze dokular kesin. </li><li> Chill vibratome steril PBS-H ile banyo ve soğuk 0-2 ° C, oldukça sarp 27 ° vibratome bıçak açısını ayarlayın. Mümkün olduğunda, doku bozulması en aza indirmek için buz üzerinde soğutulmuş tutmak. Taze dokusu da soğutulmuş bir vibratome kullanarak bölümüne kolaydır. </li><li> Doku, cerrahi makas veya küçük yaklaşık 0.5 cm genişliğinde, 0.25 cm boyunda parçalara neşter ile kesiniz. Bir tartmak tekne veya küçük bir çanak koyun ve doku parçaları ile kaplayın ~ 40 ° C erimiş% 4 PBS agaroz erimeye düşük tamponlu. Doku çanak alt ile temas halinde olduğundan emin olun. Doku parçaları yüzen eğer aşağı doğru itin. Buz üzerinde katılaşmaya. Bu genellikle 3-5 dakika sürer. </li><li> Loctite yapıştırıcı ile kaplayın vibratome doku bloğu. Sonra forseps kullanarak bir neşter ve doku etrafında agaroz Kes, tutkalla kaplı vibratome blok dikkatlice kırılgan agaroz gömülü doku transferi. Doku blok sonra doku parçası hareket ettirmeyin. Buz üzerinde yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Dağı doku vibratome blok ve ölü bir yavaş, ileri hız ve nispeten yüksek genlik kullanarak 200um kalınlığında kesitler doku kesmek. Hız ve genlik ayarları her vibratome ile değişir. Vibratome kullanılabilir, ya da doku kesit vibratome için uygun değildir, ince şeritler halinde bir neşter kullanılarak doku kesin. </li><li> Bölümleri içeren 1 ml soğutulmuş PBS-H 24-iyi doku kültürü plakası iyi ayarlanmış bir doku odasına bir fırça ile aktarın. Dört doku kesitlerinde kadar her doku odasına koyun. Bir lastik bant ile plaka deneysel örnek bilgileri ve güvenli kapak ile doku kültürü plaka kapağı Etiket. </li><li> Alternatif olarak, vibratome ile iyi kesmeyin dokular için, gut gibi, neşter veya ustura bıçağı ile mümkün şeritler gibi ince kesebilir. Neşter kesilmiş bölümler için başına sadece iyi bir bölümünde koyun. </li><li> Bitmiş kesme dokuların hemen sonra boyama geçin. Bölümleri her zaman sabit kadar bozulması en aza indirmek için soğutulmuş tutun. Bölümleri kurumasına izin vermeyin. Soğutulmuş steril PBS-H bölümleri tutun. </li><li> 0.5 mg / ml FITC konjuge tetramers doku bölümleri gece boyunca inkübe edin. Fare ya da çözümü engelleme 1:200 sulandırılmış bu inkübasyon ekstrasellüler epitoplar, örneğin anti-CD8 antikorlar, yönelik olmayan tavşan antikorları içerebilir. Bu ve sonraki tüm inkubasyon için ortalama 1 ml solüsyon kullanın ve bu ve 4 sonraki tüm inkubasyon ° C sallanan bir platform üzerinde plakaları ile gerçekleştirebilirsiniz. Sonraki adımda çözüm çapraz bulaşmayı önlemek için en az bir boş ayrılmış farklı deneysel örnekleri içeren bir doku odaları tutun. </li><li> Birincil inkübasyondan sonra, her biri için 20 dakika soğuk PBS-H iki katı (2X) bölümleri yıkayın. Soğutulmuş PBS-H içeren farklı bir 24-iyi doku kültürü plakası doku odalarına aktararak bunu yapın. Bir deneysel örnek diğerine içeriğini damla dikkatli olun, doku odaları taşırken. Benzer sonraki tüm inkubasyon ve yıkama için uygun bir çözüm içeren temiz bir tabak doku odalarına transfer. Bölümler doku odaları kenarlarına yapışmış alamadım emin olmak için prosedür sırasında doku odaları bölümleri izleyin. </li><li> Taze PBS ile Fix bölümleri, oda sıcaklığında 2 saat için% 4 paraformaldehid tamponlu. Soğuk PBS-H 2X her biri 5 dakika ile yıkayınız. </li><li> 1-3 gün boyunca bloke çözüm, 10.000: tavşan anti-FITC antikorlar, örneğin Biodesign1 inkübe edin. Co-etiketleme için de bu inkübasyon hücrelerarası epitoplar yönelik olmayan tavşan antikorları içerir. Bu seçenek için, gerekirse epitoplar ortaya çıkarmak ve nüfuz ve ikinci inkübasyon öncesinde hücrelerin engellemek. </li><li> Formaldehit fiksasyonu antijen alımı gerektiren intrasellüler epitoplar kullanarak antikorlar, mikrodalga fırın, 0.01m Üre kaynar 3 kez, her seferinde 10 saniye epitoplar maruz. Her ısıtma arasında 2 dakika bekleyin. Kaynar çözüm kuyular bölümleri zorlayabilir çok dikkatli olun. Bu durumda, bir boya fırçası kullanındoku odasının yanında kesitler itmek veya uygun doku odasının altına plaka kapağı. Antijen alımı antikorlar gerektirir yoksa bu adımı atlayabilirsiniz. </li><li> Önce ikinci inkübasyon, hücre içi epitoplar yönelik antikorları kullanarak, permeabolize ve PBS-H, bir saat süreyle% 0.3 triton X-100 ve% 2 normal keçi serumu içeren doku kesitlerinde hücreleri engellemek. Ardından% 0.3 triton X-100 ve% 2 normal keçi serumu içeren PBS-H kalan antikor inkubasyon gerçekleştirin. </li><li> Ikinci bir inkübasyondan sonra, birkaç saat 20 dakika PBS-H bölümleri yıkayın. Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez tekrarlayın. Uygun floresan etiketli antikorlar ile nihai bir inkübasyon gerçekleştirin. Örneğin, keçi anti-tavşan-Cy3 ve keçi anti-fare-Alexa 488 çözüm engelleme 1:1000 her seyreltilir. 1-3 gün süreyle inkübe edin. Bölümlerde ışık besler fluorophores gibi, bundan sonra bu inkübasyon sırasında plakalar kalay folyo sarma ve ışıktan korunmalıdır tutun. </li><li> PBS-H bölümlerde birkaç saat 20 dakika boyunca yıkayın. Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez tekrarlayın. </li><li> ISH post-fix bölümleri yere güvenli tetramers ve antikorlar için 1 saat için% 4 paraformaldehid post-fix ile birlikte IST için, daha sonra tekrar ve montaj bölümleri PBS-H ile durulayın. </li><li> Bir mikroskop lamı bölümler aktarmak için bir fırça kullanın. Kat gliserol / jelatin içeren 4mg/ml n-propil gallat veya bir lamel ile bir fluorofor koruyucu ve kapak içeren diğer montaj medya ile her bölüm. Mağaza -20 ° ışık korumalı slayt konteyner slaytlar. Doku kültürü plakaları yıkayın ve alkol ile kapaklar etiketleri kaldırmak. Plakalar yeniden mi. </li><li> Konfokal mikroskop ile boyanmış doku kesitlerinde analiz edin. Sonra ISH devam edebilirsiniz. </li></ol> 2. In situ hibridizasyon virüs bulaşmış-RNA + hücreler algılar. Bu situ hibridizasyon protokol aşağıdaki gibi 4,5 daha önce yayınlanmış protokoller güncellenmiştir: <ol><li> Re-kesim yerinde tetramer boyanan kesitler kalın 5-8-mikron kalınlığında-sectionss. <ol><li> 200 mikron kalınlığında kesitler slayt bölümünü ayırmak için 70 ° C&#39;de 5 dakika ısıtılır. </li><li> Bu bölüm, daha sonra kuru buz üzerinde OCT yerleştirilmiştir. </li><li> 8 mikron bölümleri kalınlığında kesitler Kriyostat ile kesilir ve Silanlanmış slaytlar yapıştırılır. </li><li> Slaytlar in situ hibridizasyon -80 ° C daha sonraki bir kapalı kutu içinde saklanabilir. </li></ol></li><li> In situ Hibridizasyon <ol><li> 3 dakika her biri için% 90 etanol ve DEPC arıtılmış su kaydırağı çeker doku bölümleri rehidrate. </li><li> 98 ° C su banyosunda 15 dakika süreyle 10mM sitrat tamponu (pH 6.0) ısıtarak doku bölümleri Permeabilize. </li><li> 20-30 dakika süreyle oda sıcaklığında Cool doku kesitlerinde. </li><li> 3 dakika DEPC arıtılmış su iki kez yıkayın. </li><li> 10 dakika için 0.1 M ÇAY (trietanolamin pH8.0)% 0.25 asetik anhidrit slaytlar çeker doku bölüm Acetylate. </li><li> 5 dakika için 0,1 M ÇAY (pH8.0) içine slaytlar aktarın. </li><li> Bölümlerine 35 S etiketli virüs özgü antisens probu veya duyu (HIV-1 için negatif kontrol, SIV), veya 35 G etiketli LCMV riboprobes (toplanmış hissi ve antisens) (HIV-1, SIV gibi). Melezleşme </li><li> 42 gecede hibridizasyon 5 dakika sonra 2xSSC ile iki kez yıkayın bölümleri ° C </li><li> STE bölümleri (0.5 M NaCl, 1mm EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7.5) 5 dakika boyunca yıkayın. </li><li> 30 dakika 37 RNases Ste A ve T1 ° C bölümleri Digest </li><li> 2x SSC bölümleri artı 5 dakika boyunca% 50 formamid yıkayın. </li><li> Bölümleri 1x SSC 10 dakika yıkayın. </li><li> Bölümlere 0,5 x SSC 15 dakika yıkayın. </li><li> 70 bölüm, 80 ve% 100 etanol içeren 0.3 M amonyum asetat, her 5 dakika dehydrate. </li><li> Kat bölümlerinde nükleer iz emülsiyon </li><li> 1 saat boyunca karanlık bir odada kurulayın. </li><li> 4 bölümleri Açığa ° C, 11 gün (SIV) ve 3 gün (LCMV). </li><li> 3 dakika (Kodak, Kedi # 146 4593) D19 bölümleri geliştirmek, dH2O 30 saniye içinde, 4 dakika yıkayın (Kodak, Kedi # 146 4106) Rapid Fixer düzeltmek, dH2O 5 dakika x 3 kere yıkayın. </li><li> % 70,% 80 ve mutlak etanol, her biri 5 dakika dehydrate. </li><li> Floresan uyumlu Permount orta Mount slaytlar. </li></ol></li></ol> 3. Konfokal mikroskop görüntüler elde. <ol><li> Bio-Rad MRC 1000 Konfokal Mikroskop, ya da Epi2-Mavi Yansıma cihaz ile herhangi bir diğer konfokal mikroskop ile ISTH görüntüleri yakalayın. </li><li> (LCMV için), kırmızı tetramer florokrom, yeşil CD8 florokrom Epi2-522 DF32, ve gümüş tahıllar için Epi2-Mavi Yansıma (gelişmiş radioautographs ISH sinyal) 20x (SIV) veya 60x Epi1-605 kullanın. </li><li> Sırayla her alanın üç kanal 1 mikron aralıklarla Z seri görüntüler toplamak. </li><li> Her bölümün soldan görüntüler eldebir Excel dosyası, satır ve sütun göre sağa ve yukarıdan aşağıya doğru ve adı her görüntü. </li><li> Yeniden inşa montaj görüntü boşluklar önlemek için komşu görüntüleri ile bir ~% 20 üst üste her görüntüyü yakalayın. </li></ol> 4. Görüntü analizleri: montaj görüntü rekonstrüksiyonu, hücre centroid hesaplama ve Mekansal analiz. <ol><li> Konfokal Yardımcısı (Sürüm 4.02). Ile her kanal için tek bir görüntü içine Proje Z seri görüntüler. </li><li> Photoshop 7.0 Eylem yordamı kullanarak, tek bir RGB görüntü otomatik olarak üç kanal yansıtılan görüntü birleştirme. </li><li> Photoshop 7.0 katmanları birleştirilmiş görüntüler dikiş montaj bir görüntü oluşturur. </li><li> Önlisans bireysel gümüş tahıl ve tetramer hücreleri ile leke ve X atamak, Y MetaMorph (sürüm 7.1.3) veya Photoshop (yazar), SIV RNA + ve tetramer + hücreler merkezleri (uzaysal) koordinatları </li><li> Her hücre için sayısal numaraları gibi Excel dosyaları içine ağırlık merkezi veri ihracat. E: T oranları Excel dosyaları bölümünde tetramer sayıların toplamı + ve viral RNA + hücreler belirlenir. </li></ol> Mekansal, kırmızı tetramer + ve mavi SIV RNA arasındaki ilişkiler + hücrelerin kopyalama ve yapıştırma Photoshop belgeye Excel dosyaları kendi araziler yakalanır. Bunlar renk-seçerek ve kopyalama ve mavi RNA + hücreleri konumlarını bir yeni tabaka içine yapıştırarak, denk böylece ızgaraları hizalamak ve ölçek için bir katman donukluk, ve sonra ızgaraları hizalamak için kullanılan atarak katmanı, pozisyonlarını azaltarak sonra tetramer + ve viral RNA + hücreleri düzleştirilmiş görüntü ortaya çıkacak. 5. Ek Notlar Bulaşıcı doku kesme Eğer: Bir BSL2.5 laboratuarda çalışın. Tıraş bıçakları ile özel önlemler alın. Jilet bir forseps ile vibratome bıçak monte içine koyun. Bir forseps ile bıçak koyamazsınız, o zaman banyo için doku eklemek için önce koymak ve bıçak yerine geçmez. Bitmiş keserken bıçak, bir forseps ile çıkarın. Kaldırmadan önce, Sprey ile% 70 EtOH veya DMQ bıçak. Her zaman olduğu gibi, bir dikiş iğnesi konteyner bıçaklar atmayın. Dış eldiven değiştirme ya da doku veya tank içinde kirlenmiş PBS ile her temastan sonra dezenfektan durulayın. Bittiğinde, bulaşıcı bir malzeme ile çalışıyorsanız, tank içinde PBS DMQ dezenfektan ve kaldırılması için önce bir kaç dakika bekletin. Boşa dekontamine PBS atın. Sonra tuz ve dezenfektan kaldırmak için tankı su ile durulayın. DMQ ile temiz bir çalışma alanı ve gereçleri. Eşyaları su ile durulayın. Biotinlenmiş MHC monomerlerin tetramers olun: Gibi moleküller biotinlenmiş MHC sınıf Edinme HLA-A * 0201 / B 2 m / ya Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV) Beckman Coulter veya alakasız MART peptid (ELAGIGILTV) peptitler ile üretilen peptid molekülleri. Biotinlenmiş HLA-A * 0301 / ya Gag (KIRLRPGGK) veya NIAID tetramer tesiste Nef (QVPLRPMTYK) ile üretilen B 2 m / peptid molekülleri. Tetramers 6 alikotları etiketli FITC ekleyerek oluşturulur biotinlenmiş Mamu ExtraAvidin (Sigma) * 01 / B 2 m / 8 saat boyunca son molar oranı 4.5:1 bir peptit monomerleri. Extravidin ekleyerek arkasındaki mantığı yavaş yavaş erken zaman noktalarında sırasında Extravidin bağlı dört biotin siteleri alır eklediğiniz garanti monomer bir overabundance olmasıdır. ExtrAvidin bağlı her 4 siteleri olmayacağını bir şans daha az monomer sol ve daha var, çünkü daha sonra tepki olarak, bu süreci daha az verimli. Bir kerede tüm ExtrAvidin eklediyseniz tepki, daha az verimli olacak ve daha Extravidin molekülleri sadece 2 ya da 3 monomerlerin bağlı olurdu.

<ol><li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li>
<li>Qingsheng, L. i, Skinner, P. J., Ha, S. -J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li>
<li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li>
<li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li>
<li>Li, Q. ingsheng, Estes, J. acobD., Schlievert, P. atrickM., Duan, L. ijie, Brosnahan, A. mandaJ., Southern, P. eterJ., Reilly, C. avanS., Peterson, M. arnieL., Schultz-Darken, N. ancy, Brunner, K. evinG., Nephew, K. arlaR., Pambuccian, S. tefan, Lifson, J. effreyD., &amp, J. ohnV. C. arlis, Haase, A. shleyT. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Virüs RNA, bu raporda virüsle enfekte olan hücreleri için bir belirteç olarak kullanılan olduğundan, hibridizasyon önce tüm reaktifler RNAase arındırılmış olmalıdır. In situ hibridizasyon prosedürü burada açıklanan floresan in situ tetramer boyama sinyal korumak için modifiye edilmiştir. In situ hibridizasyon tarafından tespit edilen virüs bulaşmış hücrelerin radioautographic sinyal tek-hücre çapı hakkında bir derinlikte olduğundan, in situ tetramer boyanması için kullanılan kalın bölümlerde 5-8 mikron kalınlığında bölüme recut olmak zorunda. Burada anlatılan roman tekniği, in situ tetramers ve in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek Bu virüse özgül CD8 + T hücreleri ve virüs ile enfekte hedef hücreleri olan uzaysal ilişkisi eş zamanlı görüntüleme, haritalama ve analiz sağlayan. Bu yöntem, CD8 + T hücre tabanlı aşı değerlendirmek için uygulanan ve diğer non-virüs patojen ve konak etkileşimleri olabilir. Görüntü analiz yöntemi, burada açıklanan in situ etkileşen herhangi iki hücre popülasyonlarının mekansal ilişkileri incelemek için de adapte edilebilir, biz son zamanlarda insan dışı primat maymun bağışıklık eksikliği modeli HIV-1 cinsel yolla bulaşmasını eğitim centroid haritalama yöntemi kullanılır, örneğin rhesus, virüs enfeksiyonu 6 makakların

Çözümler ve Reaktifler: <ul><li> PBS-H Fosfat RNASes etkisizleştirmek için tuzlu su içeren heparin (100ug/ml veya 18.7U/ml) tamponlu </li><li> Heparin içeren RPMI doku kültür ortamı (100ug/ml veya 18.7U/ml) RNASes inhibe </li><li> % 4 PBS düşük erime agaroz </li><li> PBS% 2 normal keçi serumu ile (veya fluorofor konjuge antikorların yapıldığı türler serum). </li><li> PBS% 2 normal keçi serumu ve% 0.3 Triton X-100 </li><li> MHC sınıf FITC konjuge tetramers </li><li> Anti-FITC antikorlar, örneğin Biodesign tavşan anti-FITC </li><li> Son derece birden fazla etiketleme, örneğin keçi anti-tavşan-Cy3 ile kullanmak için diğer türler IgG adsorbe çapraz fluorofor konjuge anti-tavşan IgG </li><li> Son derece birden fazla etiketleme ile kullanmak için diğer türler IgG adsorbe çapraz fluorofor konjuge anti-fare IgG </li><li> Taze PBS% 4 paraformaldehid tamponlu </li><li> 0.01m Üre </li><li> Gliserol / jelatin içeren 4mg/ml n-propil gallat </li></ul> Özel ekipman <ul><li> Vibratome </li><li> Skalpel </li><li> Tıraş bıçağı </li><li> Cerrahi makas </li><li> Loctite Hızlı Kurulum Hızlı Yapıştırıcı (ürün # 46.551) </li><li> Forseps </li><li> # 2 deve saç boya fırçaları. Jilet ile istenilen kalınlıkta kırpabilir </li><li> 24-düz dipli doku kültürü tabak örneğin Falcon katalog # 353.226 </li><li> Doku odaları </li><li> Kalay folyo </li><li> Karton slayt klasör örneğin Fisher katalog # 12-587-10 </li><li> Konfokal Mikroskop </li></ul> IST Reaktifler Hızlı Başvuru PBS-H (fosfat tamponlu salin ile heparin) <ul><li> 450 ml 1X PBS </li><li> 50 ml 1X PBS + 10X heparin </li></ul> 1x PBS + 10X heparin <ul><li> 500 ml 1X PBS </li><li> 500 mg heparin toz (kuru kimyasal depolama raf bulundu) </li></ul> PBS-H / 2% NGS (normal keçi serumu) <ul><li> 49 ml Falcon tüp PBS-H </li><li> 1 ml NGS (-20 dondurucuda 1 ml alikotları bulundu) </li></ul> PBS-H / 2% NGS /% 0.3 Triton X-100 <ul><li> Falcon tüp içerisinde 49 ml PBS-H /% 0.3 Triton X-100 </li><li> 1 ml NGS (-20 dondurucuda 1 ml alikotları bulundu) </li></ul> PBS-H /% 0.3 Triton X-100 <ul><li> 500 ml PBS-H </li><li> 1,5 ml Triton X-100 (kuru kimyasal depolama raflarda bulunan kalın bir sıvı) </li></ul> % 4 LMP Agaroz <ul><li> 2 g LMP agaroz tozu </li><li> 50 ml PBS </li><li> , Tozu eriyene kadar karıştırılır, mikrodalga kadar çalkalayın. </li></ul> (N-propil galate jelatin gliserol GG-NPG <ul><li> Eritmek için 50 derece su banyosunda gliserol jelatin bir şişe yerleştirin. </li><li> 0.06 g (Terris raf bulundu) propil galate ekleyin, iyice çalkalayınız. </li><li> Eriyene kadar ara sıra çalkalayarak su banyosunda tutun. </li><li> 1 ml tüpler (kahverengi tüpler) içine kısım </li></ul> 4% paraformaldehid <ul><li> 4 g paraformaldehid toz (kuru kimyasal depolama raflarda bulunan) </li><li> Ml Mezür PBS-H, yaklaşık 10 koyun pf tozu ekleyin </li><li> Hacmi yaklaşık 70 ml ulaşana kadar biraz su ekleyin. </li><li> NaOH bir damlalık ekleyin. </li><li> Çözünmüş (genellikle yaklaşık 20-30 dakika) kadar karıştırın. </li><li> PH 7-8 arasında ulaşıncaya kadar HCl ekleyin. </li><li> 100 ml su ile hacim kazandırın. </li></ul> Üre 0.01 M <ul><li> 0.3 g üre (kuru kimyasal depolama raflarda bulunan) </li><li> 500 ml su </li></ul>

aynı zamanda virüs cd8 + t hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir tekniği in situ</em

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Sayıları ve konumları virüs spesifik CD8 + T hücreleri enfekte hücrenin hedeflerine sayıları ve yerleri göreli açıklık kronik kalıcı enfeksiyonlar bu aralıktaki sonuçlarının belirlenmesinde kritik olduğu düşünülmektedir. Biz burada bir bağışıklık efektör (E) virüs-spesifik CD8 + virüse özgül CD8 + T hücreleri tespit etmek yerinde tetramer (IST) boyama birleştiren T hücreleri ve enfekte hedefleri (T) ve içinde in situ arasında mekansal ve kantitatif ilişkileri değerlendirmek için yöntemi tarif hibridizasyon (ISH), bağışıklık sistemi ve enfeksiyon arasındaki savaş gerçekleşir dokularda viral RNA + hücreleri algılamak için. T oranları: IST boyama ve ISH, kısaltılmış ISTH kombinasyonu immün efektör hücreleri ve hedefleri, ve E facile belirlenmesi yerleri görüntüleme ve haritalama sağlar. Bu parametreler sırayla sonra mekansal yakınlığı arasındaki ilişkileri belirlemek için kullanılır, ve erken enfeksiyon sonuçlarını tahmin immün yanıtın zamanlaması ve büyüklüğü olabilir

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

Virüse özgü CD8+ T hücrelerinin sayılarının ve konumlarının, enfekte oldukları hedef hücrelerin sayıları ve konumlarına oranı; temizlenmeden kronik kalıcı enfeksiyonlara kadar uzanan sonuçların belirlenmesinde kritik olduğu düşünülmektedir. Burada, bağışıklık savunmaları ile enfeksiyon arasındaki savaşın gerçekleştiği dokularda, virüse özgü CD8+ T hücrelerini saptamak için in situ tetramer (IST) boyamasını ve viral-RNA+ hücreleri saptamak için in situ hibridizasyonu (ISH) birleştiren, immün efektör (E) virüse özgü CD8+ T hücreleri ile enfekte hedefler (T) arasındaki mekansal ve kantitatif ilişkileri değerlendirmek için kullanılan bir yöntem tanımlıyoruz. IST boyaması ve ISH'nin kombinasyonu (kısaca ISTH), immün efektör hücrelerin ve hedeflerin konumlarının görselleştirilmesine ve haritalandırılmasına ve E:T oranlarının kolayca belirlenmesine olanak tanır. Bu parametreler ise daha sonra, erken enfeksiyondaki sonuçları öngören mekansal yakınlık ile bağışıklık yanıtının zamanlaması ve büyüklüğü arasındaki ilişkilerin belirlenmesinde kullanılabilir.

ISTH olarak bilinen bir teknikle, in situ hibridizasyon ve tetramer boyama birleştirilerek, viral antijen spesifik immün efektör hücreler ile viral olarak enfekte olmuş hücreler ve dokular arasındaki bağıl sayılar ve mekansal ilişkiler belirlenebilir. ISTH, taze SIV enfekte dokunun agros içine gömülmesiyle başlar. Doku, bir vibratom kullanılarak 200 micron kalınlığında kesitler halinde kesilir ve viral antijen için boyanır.FitC işaretli MHC tetramerleri kullanılarak spesifik CD8 pozitif hücrelerin belirlenmesi. Dondurma işleminden sonra, bu boyanmış kesitler bir kriyostat kullanılarak 8 µm kalınlığında kesitlere ayrılır ve viral olarak enfekte hücreleri lokalize etmek için in situ hibridizasyon uygulanır. Çift boyamalı kesitlerin görüntülenmesi ve nihayetinde immün efektör ile hedef hücreler arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak için orijinal kalın kesitlerin yeniden oluşturulması amacıyla konfokal mikroskopi kullanılır.Erken evre SIV enfeksiyonunu incelemek için bu prosedürün kullanılması, sonrasında gelişen hastalığın şiddeti için iyi bir öngörücü olduğunu kanıtlamıştır. Merhaba, ben Minnesota Üniversitesi Mikrobiyoloji Bölümü'nde Ashley HA'nın laboratuvar ekibinden Chinen Lee. Ben de Minnesota Üniversitesi Veteriner Biyomedikal Bilimler Bölümü'nde yardımcı doçent olan Pam Skinner.Bugün size, kısaca ISTH olarak adlandırılan in situ tetramer boyama ve hibridizasyon prosedürünü göstereceğiz. Bugün uygulamalı olarak göstereceğimiz in situ tetramer boyama ile in situ hibridizasyon kombinasyonunun yanı sıra, antijenle spesifik CD8 T hücrelerinin in situ konumunu, bolluğunu ve protein ekspresyon profilini belirlemek için rutin olarak in situ tetramer boyama ile immünohistokimyayı birlikte kullanıyoruz. Bugün kalın kesitlerle gerçekleştirilecek in situ tetramer boyama aşamasında bize Dr. Heon Kim ve Terry Matala yardımcı olacak; ince kesit hazırlama ve in situ hibridizasyon aşamasında ise So bize destek verecek. Hadi başlayalım.Bu prosedüre başlamak için, steril PBSH içeren Vibram banyosunu 2 °C'ye kadar soğutun. Vibratör bıçak açısını 27 dereceye ayarlayın. Mümkün olduğunca taze dokuları buz üzerinde soğutun ve prosedüre dokular toplandıktan sonraki 24 saat içinde başlayın.Degradasyonu minimize etmek için, vibrotom aynı zamanda taze dokunun kesilmesini, bağ dokusunun temizlenmesini ve numunenin bistüri ile küçük parçalara ayrılarak bir whey boat içerisine yerleştirilmesini ve yaklaşık 40 °C'de eritilmiş PBS içindeki %4 düşük erime noktalı agar ile kaplanmasını kolaylaştırır. Dokunun kabın tabanıyla temas ettiğinden emin olun ve eğer parçalar yüzüyorsa onları aşağıya doğru itin, ardından üç ila beş dakika boyunca buz üzerinde dondurun.Burada dalak dokusu kullanılmaktadır, ancak bistüri ile lenf düğümü, vajina, serviks, uterus veya diğer taze dokular da kullanılabilir. Dokunun etrafındaki agros'u kesin ve pens yardımıyla agros gömülü dokuyu doku bloğuna dikkatlice aktarın. Bir Vibram doku bloğunu Loctite yapıştırıcı ile kaplayarak işleme devam edin.Doku parçası doku bloğu üzerine yerleştirildikten sonra hareket ettirmeyin. Buz üzerinde yaklaşık 10 dakika boyunca kurumaya bırakın. Ardından, doku bloğunu vibratöre yerleştirin ve çok düşük bir ileri hız ile nispeten yüksek bir amplitüd kullanarak dokuyu 200 mikrometre kalınlığında kesitler halinde kesin.Kesilmiş bölümleri, bir 24 kuyucuklu doku kültürü plağının kuyucuğuna yerleştirilmiş ve içi bir mililitre soğutulmuş PBSH ile önceden doldurulmuş özel bir doku haznesine aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Her doku haznesine dört adede kadar doku bölümü yerleştirin. Viral spesifik T hücreleri için doku bölümlerini boyamak amacıyla örnekleri etiketleyin ve plağın kapağını bir paket lastiği ile sabitleyin.ZI konjuge tetramerler önce bloklama tamponu ile ml başına 0,5 µg olacak şekilde seyreltilir. Çözelti, her kuyucuğa 1 ml olacak şekilde 24 kuyucuklu bir plakaya pipetle aktarılır. Taze kesilmiş doku, plaktaki doku bölmelerine aktarılır ve 4 °C'de gece boyunca sallanmaya bırakılır.Sonraki adımlarda solüsyonların çapraz kontaminasyonunu önlemek için farklı örnekler içeren doku odacıkları arasında boş bir kuyucuk bırakın. Bu adımda, hücre dışı veya hücre yüzeyi proteinlerine yönelik antikorlar eklenebilir. Yıkama işlemi için, birincil inkübasyondan sonra soğutulmuş PBSH içeren 24 kuyucuklu bir doku kültürü plakası hazırlayın.Doku odacıklarını, her seferinde 20 dakika boyunca önceden doldurulmuş bir plakaya aktararak iki kez yıkayın; aktarmadan önce doku odacıklarındaki sıvının çoğunun boşaldığından emin olun. Ayrıca, doku odacıklarını taşırken bir örneğin içeriğinin diğerine damlamamasına dikkat edin ve kesitlerin doku odacıklarının kenarlarına yapışmadığından emin olmak için onları izleyin. Fiksasyondan sonra, kesitleri oda sıcaklığında iki saat boyunca PBS içinde taze %4 paraformaldehit ile sabitleyin.Tetramerlerden gelen sinyali artırmak için soğuk PBSH ile her biri beş dakika sürecek şekilde iki kez yıkandı. Kesipleri, bloklama tamponu içinde 1:10.000 oranındaki tavşan anti-fitzy antikorları ile bir ila üç gün boyunca inkübe edin. Bu aşamada, hücre içi epitoplara karşı antikorlar eklenebilir.Antikor eklemeden önce hücrelerin permeabilize edildiğinden ve spesifik olmayan bölgelerin bloke edildiğinden emin olun. Sinyali güçlendirmeyi amaçlayan ikinci uzun inkübasyondan sonra antijen geri kazanımı da gerekebilir. Kesitleri PBSH ile her seferinde en az 20 dakika ve birkaç saate kadar olmak üzere üç kez yıkayın.Uygun floresan işaretli antikorlarla son bir inkübasyon gerçekleştirin. Örneğin, tetramer boyamalı hücrelerin kırmızı floresan vermesini sağlamak için tavşan anti-fitzy antikorlarını bağlamak amacıyla goat anti-rabbit SI three kullanılabilir. Katil T hücrelerini görselleştirmek için CD eight gibi ilgi duyulan proteinleri karşıt boyamak amacıyla fare antikorları kullanılmışsa, fare antikorlarına bağlanmak ve antikor boyamalı hücrelerin yeşil floresan vermesini sağlamak için goat anti-US Alexa 488 kullanılabilir; her bir antikorun dilüsyonları ampirik olarak belirlenmelidir.Plakları ve alüminyum folyoyu sararak kesitleri ışıktan koruyun ve bir ila üç gün boyunca inkübe edin; inkübasyon sırasında ve sonrasında ışık floresan sinyallerini söndürür. Son olarak, tetramerleri ve antikorları sabitlemek için kesitleri tekrar fikse edin. Yıkayın ve in-situ hibridizasyon için ince kesitler hazırlayana kadar -20 °C'de saklamak üzere, mililitrede dört miligram N profil gallat içeren gliserol jelatin ile mikroskop lamına monte edin.İn situ tetramer boyamalı kesitler, antijen spesifik CD8+ T hücrelerinin lokalizasyonu, bolluğu ve protein ekspresyon paterni belirlenmek amacıyla konfokal mikroskop ile analiz edilebilir; gösterilen görüntüde, SIV enfekte bir rhesus macaque'den alınan dalak doku kesitleri, SIV spesifik CD8+ T hücrelerini işaretlemek için gag tetramerleri ile, ayrıca CD20 antikorları ve CD3 antikorları ile boyanmıştır. Antikorlarla yapılan karşıt boyamalar bir sonraki adımda kaybolacağı için, işlemlere devam etmeden önce in situ tetramerlerin analiz edilmesi önemlidir.Kalın kesitleri lamdan ayırmak için, 200 mikron kalınlığındaki kesitleri bir ısıtma bloğunda 70 °C'de beş dakika ısıtarak ince kesit alma işlemine başlayın. Kesitler ayrıldıktan sonra, önce plastik kalıbın altını OCT ile doldurarak, kesitleri kuru buz üzerinde OCT'ye gömün. Ardından dokuyu OCT'nin üzerine yerleştirin ve üzerini tekrar OCT ile kapatın.OCT gömülü kesitlerden sekiz mikron kalınlığında kesitler almak için bir kriyostat kullanın ve sekiz mikronluk kesitleri silanize lamlara yapıştırın. Lamlar daha sonra sonraki in situ hibridizasyon işlemi için sızdırmaz bir kutuda eksi 80 derece Celsius'ta saklanabilir. Virüsle enfekte olmuş hücreleri S 35 işaretli virüse özgü rib problar aracılığıyla tespit etmek için standart in situ hibridizasyon kullanılır.Prosedür ayrıca kesitlerin nükleer iz emülsiyonu ile kaplanmasını ve lamların hazırlanmasını içerir. Floresan uyumlu paramount ortamında konfokal görüntüler, epi tüp mavi yansıma cihazı ile donatılmış bir BioRad MRC 1000 konfokal mikroskop kullanılarak elde edilir. In situ tetra boyaması, kırmızı tetra florokromu için EPI one 605 ve in situ hibridizasyon için yeşil CD8 florokromu için EPI 2 522 DF 32 kullanılarak görselleştirilir.Geliştirilmiş radyografideki in-situ hibridizasyon sinyalinden kaynaklanan gümüş tanecikleri için EPI iki mavi yansımayı kullanın. Görüntüleme işlemine başlamak için, her kesitin görüntülerini soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru alın ve her görüntünün komşu görüntülerle yaklaşık %20 örtüştüğünden emin olun. Yeniden oluşturulan montaj görüntüsünde boşluklar oluşmasını önlemek için, her görüntüyü bir Excel dosyasındaki satır ve sütununa göre adlandırın.Slaytlardan veri toplama işlemi tamamlandığında, yazarlardan temin edilebilen bir Photoshop seven işlem prosedürünü kullanarak, her kanal için Z seri görüntülerini tek bir görüntüye izdüşürmek amacıyla konfokal asistan yazılımını kullanın; üç kanaldan gelen izdüşürülmüş görüntüyü otomatik olarak tek bir RGB görüntüsünde birleştirin. Ardından, tüm kesitin bir montaj görüntüsünü oluşturmak için birleştirilmiş görüntüleri katmanlar halinde birbirine ekleyin. Montaj üzerindeki bireysel gümüş tanelerini ve tetramer boyamasını, metamorph veya Photoshop kullanarak hücrelerle ilişkilendirin.Viral RNA pozitif ve tetramer pozitif hücrelerin merkezlerinin XY koordinatlarını veya OID'lerini atayın. OID verilerini her hücre için sayısal değerler olarak Excel dosyalarına aktarın ve tetramer pozitif ve viral RNA pozitif hücrelerin toplam sayıları üzerinden, kesitteki immün efektör (e) hücrelerin viral hedef (T) hücrelere oranını belirlemek ve tetramer pozitif ile RNA pozitif hücreler arasındaki uzamsal ilişkileri saptamak için Excel dosyalarında toplanan verileri kullanın. Bunların ilgili grafiklerini Excel dosyalarından kopyalayıp Photoshop'taki bir Photoshop belgesine yapıştırın.Izgaraların renk ve seçim açısından örtüşmesi için bir katmanın opaklığını azaltarak hizalama ve ölçeklendirme yapın, ardından seçip yeni bir katmana kopyalayıp yapıştırın. Mavi RNA pozitif hücrelerin konumları belirlendikten sonra, ızgaraları hizalamak için kullanılan katmanı kaldırın; böylece düzleştirilmiş görüntüde tetramer pozitif ve viral RNA pozitif hücrelerin konumları ortaya çıkacaktır. Burada gösterilen ISTH yöntemi ile, intravajinal inokülasyon sonrası giriş kapısındaki ve enfeksiyonun yayıldığı lenfatik dokulardaki SIV enfeksiyonuna karşı verilen bağışıklık yanıtını takip edebiliyoruz.Enfeksiyondan 10 gün sonra bu doku bölgelerinde çok sayıda enfekte hücre bulunmaktadır; ancak üç gün sonrasında bile, yeşil boyalı CD A pozitif hücreler mevcutken, henüz kırmızı boyalı SIV spesifik tetra pozitif hücreler görülmemektedir. Bu nedenle, bağışıklık yanıtı enfeksiyonu temizlemek için çok geç kalmıştır.Bununla birlikte, enfeksiyondan üç hafta sonra, özellikle giriş portalında enfekte hücrelerdeki azalma açıkça görülmektedir. Azalmanın boyutunun, tetramer pozitif immün efektör hücrelerin mekansal yakınlığı ve göreceli sayıları ile ilişkili olduğunu göstermek için ISTH kullandık. N-S-I-V-R-N-A pozitif hedef hücreler; buna in vivo E/T oranı diyoruz.Mekansal ilişkiler, bu enfekte lenf düğümünde efektör hücrelerin kırmızı, viral hedeflerin ise mavi ile renklendirildiği bu yöntem kullanılarak kolayca görselleştirilmektedir. Birçok efektör ve hedef hücre birbirine yakın konumdadır ve bazı bölgelerde birçok efektör hücre tek bir S-I-V-R-N-A pozitif hücreyi çevrelerken, diğer bölgelerde S-I-V-R-N-A pozitif bir hücre tek başına bulunmaktadır. ETT oranı, hücrelerin konumları belirlenip Excel dosyasına her birinden kaç adet olduğu kaydedildikten sonra basitçe hesaplanmaktadır.Viral enfeksiyonun en iyi kontrolü, kırmızı efektörlerin yeşil hedeflere oranının 43'e bir gibi büyük bir fazlalıkla korelasyon göstermesiyle ilişkilidir. Bu durumda, enfeksiyonun başladığı serviks ve vajinada ETT oranları lenf düğümlerinde daha düşüktü. Yüksek ETT oranları ile viral yükün zirve noktadan itibaren azalması arasındaki pozitif korelasyon, giriş kapısındaki daha güçlü bir bağışıklık yanıtının enfeksiyonun daha iyi kontrol edilmesi anlamına geldiğini göstermektedir.Çok spesifik CDAT hücrelerini ve virüs enfekte hücresini in situ olarak eş zamanlı olarak nasıl tespit edeceğinizi göstermiş olduk. Bu teknik, dokulardaki antijen spesifik T hücrelerini ve virüsle enfekte hücreleri aynı anda görselleştirmemize olanak tanır. Bu teknik, CD 8 pozitif T hücresi tabanlı aşıların yanı sıra diğer non-viral patojen ve konak etkileşimlerini değerlendirmek için uygulanabilir.Hibridizasyon işlemlerinden önce tüm reaktiflerin RNaz'lardan arındırılmış olduğundan emin olmak önemlidir. İşte hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

a-technique-to-simultaneously-visualize-virus-specific-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Bu protokol, lenf nodu dilimler halinde sunulan görüntü floresan T hücreleri için bir yöntem açıklanır. Bu teknik, geleneksel widefield floresan veya konfokal mikroskoplar ile T hücre göç gerçek zamanlı analiz izin verir.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Bu videoda, insan akciğer tümörü dilimleri içinde floresan olarak bağlanmış antikorlarla işaretlenmiş yerleşik tümöre sızan CD8 T hücrelerinin görüntülenmesi açıklanmaktadır. Bu teknik, konfokal mikroskopi kullanılarak CD8 T hücre göçünün gerçek zamanlı analizlerine izin verir.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Farklı Tümör Bölgelerinde Yerleşik T Hücresi Migrasyonunun Gerçek Zamanlı Analizi

Bu video, tümör  dokusunda sızan T hücrelerinin farklı alt popülasyonlarını analiz etmek için yerinde floresan multispektral görüntüleme tekniğini göstermektedir. Bir renal hücreli karsinom doku kriyoseksiyonu, spesifik inhibitör reseptörleri eksprese eden ve immünoterapiye dirençli bir fenotip sergileyen CD8 + T hücrelerini etiketlemek için antikorlarla tedavi edilir. Etiketli bölüm, farklı CD8 + T hücresi alt popülasyonlarını tanımlamak için multispektral bir mikroskop kullanılarak...

İmmünoterapiye Dirençli T Hücresi Alt Popülasyonlarını Analiz Etmek için Çoğullanmış İmmünofloresan Görüntüleme

Bu video, herpes simpleks virüsü-1 enfeksiyonunda enfekte hücre proteini 0, ICP0 trafiğini izlemek için bir yöntem göstermektedir. Post-de novo sentez, ICP0 çekirdeğe yer değiştirir ve daha sonra enfeksiyon ilerlemesi sırasında sitoplazmaya hareket eder. İmmünofloresan mikroskobu, proteinin hücre altı lokalizasyonunu ortaya çıkarır ve analiz ederek, enfeksiyon aşamaları boyunca kaçakçılığına ilişkin içgörüler sunar.

Enfekte Hücrelerde Viral Protein Lokalizasyonu için Bir İmmünofloresan Tekniği

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Bu iletişim kuralı insan akciğer tümörü dilimleri içinde fluorescently eşleşmiş antikorlar ile etiketli görüntü ikamet tümör infiltre CD8 T hücreleri bir yöntem açıklanır. Bu teknik CD8 T hücre göç confocal mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı analiz izin verir.

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

Burada, situ MHC-tetramer boyama immünhistokimya yerelleştirme, fenotip ve dokularda antijen spesifik T hücrelerinin miktarını belirlemek ile bir araya getiren bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı diğer hücre tipi ve dokularda yapıları göreli antijen spesifik CD8 T hücrelerinin kayma ve fenotipik özellikleri belirlemek için kullanılır.

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

Burada, eski için bir iletişim kuralı mevcut antijen spesifik CD8 vivo nitel tespiti+ T hücreleri. Analiz tek hücre süspansiyonlar organları veya küçük miktarda kan ile mümkündür. Çok çeşitli çalışmalar sitotoksik T hücre yanıt (aşı ve kanser immünoterapi çalışmaları) analizini gerektirir.

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Öğrenin, ISTH tekniğiyle virüs spesifik CD8+ T hücreleri ve enfekte hücreler arasındaki uzamsal ilişkileri görselleştirin. Bu yöntem, bağışıklık yanıtlarını in situ haritalandırarak enfeksiyon sonuçlarını değerlendirmeye yardımcı olur.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ

Daha fazla video keşfet