Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ

ISTH olarak bilinen bir teknikte in situ hibridizasyon ve tetra boyamanın birleştirilmesiyle, viral antijene özgü immün efektör hücreler ile viral olarak enfekte olmuş hücreler ve dokular arasındaki nispi sayılar ve mekansal ilişkiler belirlenebilir. ISTH, taze SIV ile enfekte olmuş dokuyu agros'a gömerek başlar. Doku bir vibrato kullanılarak 200 mikron kalınlığında kesitler halinde kesilir ve viral antijen için boyanır.

Uygun C etiketli MHC tetramerleri kullanan spesifik CD sekiz pozitif hücre. Dondurulduktan sonra, bu leke bölümleri bir kriyostat kullanılarak sekiz mikrometre kalınlığında bölümlere kesilir ve viral olarak enfekte olmuş hücreleri lokalize etmek için yerinde hibridizasyon gerçekleştirilir. Konfokal mikroskopi, çift leke bölümlerini görüntülemek ve nihayetinde immün efektör ile hedef hücreler arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak için orijinal kalın bölümleri yeniden yapılandırmak için kullanılır.

Erken SIV enfeksiyonunu incelemek için bu prosedürün kullanılmasının, ortaya çıkan hastalığın ciddiyeti için iyi bir belirleyici olduğu kanıtlanmıştır. Merhaba, ben Minnesota Üniversitesi Mikrobiyoloji Bölümü'ndeki Ashley HA'nın laboratuvar ağacından Chinen Lee. Ben Pam Skinner, Minnesota Üniversitesi Veteriner Biyomedikal Bilimler Bölümü'nde yardımcı doçentim.

Bugün size enstitünün içinde hibridizasyon veya kısaca ISTH için bir prosedür göstereceğiz. Bugün gösterdiğimiz gibi inci teer boyamayı inci hibridizasyon ile birlikte kullanmanın yanı sıra, antijene özgü CD sekiz T hücrelerinin yerini, bolluğunu ve protein ekspresyon profilini in situ u belirlemek için immünohistokimya ile birlikte inci teer boyamayı da rutin olarak kullanıyoruz. Bugün kalın kesitlerle yerinde boyama konusunda bize yardımcı olacaklar Dr.Heon Kim ve Terry Matala olacak ve ince kesit hazırlığı ve yerinde hibridizasyon konusunda bize yardımcı olacaklar Öyleyse başlayalım.

Bu işleme başlamak için, steril PBSH içeren Vibram banyosunu iki santigrat dereceye kadar soğutun. Vibratör bıçak açısını 27 dereceye ayarlayın. Mümkün olduğunda, taze dokuları buz üzerinde soğuk tutun ve dokuları topladıktan sonraki 24 saat içinde işleme başlayın.

Bozunma soğumasını en aza indirmek için, vibram ayrıca taze bir dokunun kesilmesini, bağ dokusunun kesilmesini ve numunenin neşter ile küçük parçalara ayrılmasını ve parçaları bir peynir altı suyu teknesine koymasını ve %4 düşük eriyik ile kaplamasını kolaylaştırır. PBS'deki Agros yaklaşık 40 santigrat derecede eridi. Mendilin tabağın dibi ile temas halinde olduğundan emin olun ve yüzerlerse doku parçalarını aşağı itin, üç ila beş dakika buz üzerinde katılaşın.

Burada dalak dokusu kullanılıyor ancak lenf bezi, vajina, rahim ağzı, rahim veya diğer taze dokular da neşter ile kullanılabilir. Agrosları dokunun etrafında kesin ve forseps kullanarak agros gömülü dokuyu dikkatlice doku bloğuna aktarın. Bir Vibram doku bloğunu Loctite yapıştırıcı ile kaplayarak devam edin.

Doku bloğuna yerleştirildikten sonra doku parçasını hareket ettirmeyin. Buz üzerinde yaklaşık 10 dakika kurumaya bırakın. Daha sonra, doku bloğunu vibratöre monte edin ve dokuyu ölü yavaş ileri hız ve nispeten yüksek genlik kullanarak 200 mikrometre kalınlığında bölümler halinde kesin.

Kesilen bölümleri, bir mililitre soğutulmuş PBSH ile önceden doldurulmuş 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının kuyusuna yerleştirilmiş özel bir doku odasına aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Her doku odasına en fazla dört doku bölümü koyun. Numuneleri etiketleyin ve viral spesifik T hücreleri için doku bölümlerini boyamak için kapağı bir lastik bantla plakaya sabitleyin.

ZI konjuge tetramerler ilk önce bloke edici tamponda mililitre başına nwt 0.5 mikrograma seyreltilir. Çözelti, kuyucuk başına bir mililitre hızında 24 oyuklu bir plakaya pipetlenir. Taze kesilmiş doku, doku odalarındaki plakaya aktarılır ve gece boyunca dört santigrat derecede sallanmasına izin verilir.

Sonraki adımlarda çözeltilerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için farklı numuneler içeren doku odaları arasında boş bir kuyu tutun. Bu adımda, hücre dışı veya hücre yüzeyi proteinlerine karşı yönlendirilmiş antikorlar eklenebilir. Yıkama için, birincil inkübasyondan sonra soğutulmuş PBSH içeren 24 oyuklu bir doku kültürü plakası hazırlayın.

Doku odalarını her seferinde 20 dakika boyunca önceden doldurulmuş bir plakaya aktararak iki kez yıkandı, aktarmadan önce doku odalarındaki sıvının çoğunu boşalttığınızdan emin olun. Ayrıca, doku odalarını hareket ettirirken bir numunenin içeriğini diğerine damlatmayın ve yanlara yapışmadıklarından emin olmak için doku odalarındaki bölümleri izleyin. Sabitlemeden sonra bölümleri PBS'de taze% 4 paraldehit ile oda sıcaklığında iki saat boyunca sabitleyin.

Tetramerlerden gelen sinyali yükseltmek için her seferinde beş dakika boyunca soğuk PBSH ile iki kez yıkandı. Bölümleri, bir ila üç gün boyunca bloke edici tamponda bir ila 10.000 oranında tavşan anti-fitzy antikorları ile inkübe edin. Bu aşamada, hücre içi epitoplara karşı antikorlar eklenebilir.

Antikorun eklenmesinden önce hücrelere nüfuz ettiğinden ve spesifik olmayan bölgeleri bloke ettiğinden emin olun. Sinyali yükseltmeyi amaçlayan ikinci uzun inkübasyondan sonra da antijen alımı gerekebilir. Bölümleri PBSH'de en az 20 dakika ve her seferinde birkaç saate kadar üç kez yıkayın.

Uygun floresan etiketli antikorlarla son bir inkübasyon gerçekleştirin. Örneğin, tetramer leke hücrelerinin kırmızı floresan olmasını sağlamak için tavşan anti fitzy antikorlarını bağlamak için keçi anti tavşan SI üç kullanılabilir. Fare antikorları, öldürücü T hücrelerini görselleştirmek için CD sekiz gibi ilgilenilen proteinleri lekelemek için kullanılmışsa, fare antikorlarına bağlanmak ve antikor leke hücrelerinin floresan yeşil olmasını sağlamak için keçi anti-US Alexa 488 kullanılabilir, her bir antikorun seyreltmeleri ampirik olarak belirlenmelidir.

Bir ila üç gün kuluçkaya yatırın, bu inkübasyon sırasında plakaları ve folyoyu sararak bölümleri ışıktan koruyun ve daha sonra ışık flora düştükçe söndürün. Son olarak, tetramerleri ve antikorları yerinde sabitlemek için bölümleri tekrar sabitleyin. Yerinde hibridizasyon için ince kesitler hazırlanana kadar eksi 20 santigrat derecede saklamak için mililitre N profil gallat başına dört miligram gliserol jelatin içeren bir mikroskop lamını yıkayın ve monte edin.

Insitu tetramer boyama kesitleri artık antijene özgü CD'nin lokalizasyonunu, bolluğunu ve protein ekspresyon paternini belirlemek için konfokal bir mikroskop ile analiz edilebilir: gösterilen resimde sekiz pozitif T hücresi, SIV ile enfekte olmuş bir girintiden alınan dalak dokusu kesitleri, SIV spesifik CD, sekiz pozitif T hücresi, CD 20 antikorları ve CD üç antikorlarını etiketlemek için gag tetramerleri ile boyandı. Çünkü antikorlarla lekelenen sayaçlar bir sonraki adımda kaybolacaktır. İlerlemeye devam etmeden önce in situ tetramerleri analiz etmek önemlidir.

Kalın bölümleri slayttan ayırmak için 200 mikron kalınlığındaki bölümleri bir ısı bloğu üzerinde beş dakika boyunca 70 santigrat derecede ısıtarak ince kesit alma işlemine başlayın. Bölümler ayrıldıktan sonra, önce plastik kalıbın altını OCT ile doldurarak kuru buz üzerine OCT'ye gömün. Daha sonra dokuyu OCT'nin üzerine yerleştirin ve OCT ile örtün.

OCT gömülü bölümlerden sekiz mikron kalınlığındaki bölümleri kesmek için bir kriyostat kullanın ve sekiz mikronluk bölümleri silolanmış slaytlara yapıştırın. Slaytlar daha sonra eksi 80 santigrat derecede kapalı bir kutuda saklanabilir ve daha sonra yerinde hibridizasyon için saklanabilir. Standart in situ hibridizasyon, S 35 etiketli virüse özgü kaburga probları aracılığıyla viral olarak enfekte olmuş hücreleri tespit etmek için kullanılır.

Prosedür ayrıca nükleer palet emülsiyonu ve montaj kızakları ile kaplama bölümlerini de içerir. Floresan uyumlu bir paramount ortamında, bir epi tüp mavi yansıma cihazı ile donatılmış bir BioRad MRC 1000 konfokal mikroskop kullanılarak konfokal görüntüler elde edilir. İnsitu tetra boyama, kırmızı tetra florokrom için EPI one 605 ve insitu hibridizasyon için yeşil CD sekiz florokrom için EPI 2 522 DF 32 kullanılarak görselleştirilir.

Geliştirilen radyo imzalarında yerinde hibridizasyon sinyalinden kaynaklanan gümüş taneleri için EPI iki mavi yansımayı kullanın. Görüntü alımına başlamak için, soldan sağa ve yukarıdan aşağıya her bölümden görüntüleri alın ve her görüntüyü komşu görüntülerle yaklaşık %20 örtüşme ile yakaladığınızdan emin olun. Yeniden oluşturulan montaj görüntüsündeki boşlukları önlemek için, her görüntüyü bir Excel dosyasındaki kardeşine ve sütununa göre adlandırın.

Slaytlardan veri toplama işlemi tamamlandığında, yazarlar tarafından sunulan Photoshop yedi eylem prosedürünü kullanarak her kanal için Z seri görüntülerini tek bir görüntüye yansıtmak için konfokal yardımcı yazılımını kullanın, yansıtılan görüntüyü üç kanaldan otomatik olarak tek bir RGB görüntüsünde birleştirin. Ardından, tüm bölümün montaj görüntüsünü oluşturmak için birleştirilmiş görüntüleri katmanlar halinde birleştirin. Metamorf veya Photoshop kullanarak tek tek gümüş tanelerini ve tetramer lekesini montajdaki hücrelerle ilişkilendirin.

Viral RNA pozitif ve tetramer pozitif hücrelerin merkezlerinin veya OID'lerinin XY koordinatlarını atayın. OID verilerini her hücre için sayısal sayılar olarak Excel dosyalarına aktarın ve Excel dosyalarında toplanan verileri, tetramer pozitif ve RNA pozitif hücreler arasındaki uzamsal ilişkileri yakalamak için bölümdeki tetramer pozitif ve viral RNA pozitif hücrelerin toplam sayılarından immün efektör veya e hücrelerinin viral hedeflere veya T hücrelerine oranlarını belirlemek için kullanın. İlgili çizimlerini Excel dosyalarından kopyalayıp Photoshop'ta bir Photoshop belgesine yapıştırın.

Katmanın opaklığını azaltarak ızgaraları renkle çakışacak şekilde hizalayın ve ölçeklendirin, seçin ve ardından kopyalayıp yeni bir katmana yapıştırın. Mavi RNA pozitif hücrelerin konumları, ızgaraları hizalamak için kullanılan katmanı atar ve tetramer pozitif ve viral RNA pozitif hücrelerin konumları düzleştirilmiş görüntüde ortaya çıkar. Burada gösterilen ISTH yöntemini kullanarak, bu giriş portalında ve enfeksiyonun yayıldığı lenfatik dokularda intravajinal inokülasyonu takiben SIV enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisini takip edebiliyoruz.

Enfeksiyondan 10 gün sonra bu doku bölgelerinde çok sayıda enfekte hücre vardır, ancak üç gün sonra yeşil leke CD A pozitif hücreler vardır, ancak henüz değil. Kırmızı lekeli SIV spesifik tetra pozitif hücreler. Bağışıklık tepkisi bu nedenle enfeksiyonu temizlemek için çok geçtir.

Bununla birlikte, enfeksiyondan üç hafta sonra, enfekte olmuş hücrelerde, özellikle giriş portalında bir azalma açıkça görülebilir. Azalmanın derecesinin, tetramer pozitif immün efektör hücrelerinin mekansal yakınlığı ve nispi sayıları ile ilişkili olduğunu göstermek için ISTH'yi kullandık. N-S-I-V-R-N-A pozitif hedef hücreler, buna in vivo E / T oranı diyoruz.

Bu enfekte lenf nodunda kırmızı efektör hücreler ve mavi renkli viral hedefler ile mekansal ilişkiler bu yöntem kullanılarak kolayca görselleştirilir. Birçok efektör ve hedef hücre birbirine yakındır ve birçok efektör hücrenin tek bir S-I-V-R-N-A pozitif hücreyi çevrelediği, diğer alanlarda ise bir S-I-V-R-N-A pozitif hücrenin tek başına durduğu alanlar vardır. ETT oranı, hücrelerin konumları Excel dosyasındaki her birinin numaralarıyla belirlenip oturum açıldığı için basitçe hesaplanır.

Viral enfeksiyonun en iyi kontrolü, yeşil hedeflere göre kırmızı efektörlerde 43'e bir oranında büyük bir fazlalık ile ilişkilidir. Bu olguda enfeksiyonun başladığı rahim ağzı ve vajinada lenf bezlerinde ETT oranları daha düşüktü. Yüksek ETT oranları ile viral yükün zirveden azaltılması arasındaki pozitif korelasyon, giriş portalında daha sağlam bir bağışıklık tepkisinin enfeksiyonun daha iyi kontrolüne dönüştüğünü göstermektedir.

Size çok spesifik CDAT hücrelerini ve virüs enfeksiyonu hücresini yerinde aynı anda nasıl tespit edeceğinizi gösterdik. Bu teknik, dokulardaki antijene özgü T hücrelerini ve virüsle enfekte olmuş hücreleri aynı anda görselleştirmemizi sağlar. Bu teknik, bu prosedürü yaparken CD sekiz pozitif T hücresi bazlı aşıyı ve diğer değersiz patojen ve konak etkileşimini değerlendirmek için uygulanabilir.

Hibridizasyon içgörülerinden önce tüm reaktif RNA'larını serbest tutmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.