Aort Halka Testi
24 Kasım 2009
Anjiyogenez, önceden mevcut olan damarsal kan damarlarının çimlenme hem de doğal ve patolojik süreçleri ile ilişkilidir. Burada anjiyogenik potentiators ve inhibitörleri doğrudan kültür aort halkalar eklenecek sağlayan bir aort halka tahlil göstermektedir. Çimlenme ve neovessel akıbet aort halkaları 6-12 günlük bir süre içinde inceleyerek tespit edilebilir.
Aort halkası testinin genel amacı, kan damarlarının bir 3D matris içinde tüm fare aort parçalarından filizlendiği esnek bir deneysel sistem sağlamaktır. Bu, önce torasik aortun bir fareden çıkarılması ve ardından kalan çevre dokudan dikkatlice temizlenmesiyle elde edilir. Temiz aort veya aort halkalarının dilimleri, her biri kubbeler halinde kalıplanmış bazal matris özütü veya BME tutan 48 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirilir.
Fazladan bir BME damlası, halkayı 3 boyutlu bir yapıda çevreler. Matris, tercih edilen herhangi bir deneysel reaktifi içerebilir. Birkaç gün inkübasyondan sonra, damarların aort halkalarından filizlendiği gözlemlenebilir ve test bileşiklerinin anjiyojenik potansiyeli değerlendirilebilir.
Merhaba, ben Karen Bein, Be Sheva İsrail'deki Beon Negatif Üniversitesi Klinik Biyokimya Bölümü'nde Dr.E Lewis'in laboratuvarından. Bugün size fare aort halkası testi için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü çeşitli materyallerin kan damarı oluşumu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, bazal matris ekstraktının veya BME'nin buz üzerinde veya dört santigrat derecede çözülmesine izin verin. Çözüldükten sonra, tekrar katılaşmasını önlemek için BME'yi soğuk tutmaya devam edin.
Deney gününde, altı ila yedi haftalık bir fareyi standart bir ketamin ve ksilazin enjeksiyonu ile ötenazi yapın, boyun arterlerinden hızla kanayın ve ardından servikal çıkık izleyin. Hayvanı steril bir laminer akış başlığında% 70 etanol ile silerek işleme başlayın. Daha sonra, bir diseksiyon kapsamı altında çalışırken, cildin dikey bir insizyonunu gerçekleştirmek ve periton duvarını açmak için steril forseps ve diseksiyon makası kullanın.
Kesi, göğüs kafesinin de kesildiği ve diyaframın çıkarıldığı üst sternumu ortaya çıkaracak şekilde yapılmalıdır. Aort açıkta kalacak şekilde omurganın yanında bulunan torasik aortu tamamen açığa çıkararak tüm organları dikkatlice bir kenara itmeye devam edin, aort ile omurga arasına ince steril cımbız yerleştirin. Cımbızları açın ve torasik segmenti aortun geri kalanından ayırarak aortu yavaşça yatağından kaldırın.
Artık aort ayrıldığına göre, böbrek damarlarına yakın olan ve kalbin yakınında biten uçtan başlayarak fareden kesmek için keskin bir makas kullanın. Eksize edilmiş torasik aortu soğuk steril PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. Artık aort çıkarıldığına göre, aort halkaları iki steril cımbız kullanılarak ve bir dürbün altında çalışarak hazırlanabilir.
Torasik aortu çevredeki yağ dokusundan temizleyin. Aorta zarar vermediğinizden ve sadece kenarlarından tuttuğunuzdan emin olun. Aort, nihayet temizlenene kadar dehidrasyonu önlemek için Petri kabı içeren PBS'ye tekrar tekrar daldırılmalıdır.
Artık torasik aort temiz olduğuna göre, cerrahi bir bıçak kullanın ve aortu bir milimetrelik halkalar halinde eşit şekilde dilimlemek için dürbün altında çalışın. Kesme yüzeyinin altına yerleştirilmiş bir cetveli kılavuz olarak kullanarak, keskinliği korumak için yeni bir bıçak kullandığınızdan ve zaman zaman değiştirdiğinizden emin olun. Aortun uçları kullanılmaz Her halkayı kestikten sonra, çok nazikçe soğuk PBS içeren yeni bir kaba aktarmak için cımbız kullanın.
Testin randomize edildiğinden emin olmak için tüm halkaları aynı PBS içeren plakaya yerleştirin. Aortun her segmenti biraz farklı anjiyojenik potansiyele sahip olduğundan, halkaları buz üzerinde tutun. Ardından, önceden soğutulmuş pipet uçlarını kullanarak tahlil plakasını hazırlayın.
Her bir oyuğa 48 oyuklu bir plakada, 150 mikrolitre soğuk BME'lik bir damla etrafında ekleyin, damla orta harekette bir kubbeye katılaşır. BME, maddelerin taşınmasına, hücrelerin kemotaksisine ve en önemlisi, neo damar oluşumuna yol açan hücre farklılaşmasına ve göçüne izin verir, çevre kuyuları PBS ile doldurulur BME dehidrasyonunu önlemek için, BME düşüşünün 20 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede katılaşmasına izin verin. BME katılaştıktan sonra, hasarı önlemek için cımbız kullanarak Petri kabından bir aort halkasını dikkatlice çıkarın, halka cımbız uçları arasında oluşan lipit damlasının içine aktarılmalıdır Sıvı yüzey geriliminin bir sonucu olarak, her kubbenin üst ortasına tek bir aort halkası yerleştirin ve her halkanın üzerinde 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin, 150 mikrolitre daha BME ekleyin ve 20 ila 30 dakika inkübe edin.
37 santigrat derecede, halka şimdi BME ve tahlil ile kaplanmıştır. Testi başlatmak için plakaya malzemeler eklenebilir. Pres takviyesi, daha önce hazırlanmış insan endotel serumu serbest ortamı, negatif bir kontrol için pozitif bir kontrol olarak deneysel materyal veya endotel hücre büyüme takviyesi ile
takviye eder.Ortamı tek başına kullanın. Her bir oyuğa 500 mikrolitre pres takviyesi ortamı ekleyin ve altı ila 12 gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu kuluçka süresi boyunca, plakayı mikroskop altında inceleyin ve aorttan filizlenen damarları ve daha fazla dallanan damarlarla tanımlanan ileri olgun damarları arayın.
Halka dokusundan içeri doğru uzanmalı, standart faz kontrast stereoskopu altında altıncı ve 12. günler arasında halkaları üç boyutlu olarak fotoğraflamalıdır. Ek olarak, altıncı ve 12. günler arasında çeşitli günlerde süpernatanları toplayın ve bir gün veya Eloqua içinde kullanmak üzere dört derecede saklayın ve ileride kullanmak üzere eksi 20 veya eksi 80'de saklayın. Süpernatanlar, vgf için Eliza veya nitrik oksit seviyeleri için gres tahlili gibi çeşitli tekniklerle analiz edilebilir.
Bu görüntüler, halkaların kuyucuklara yerleştirilmesinden ve en üst sıradaki görüntülerde görülen kültür, besiyeri veya görülen damar filizlenmesi için pozitif kontrol olarak kullanılan EKG ile inkübasyondan 12 gün sonra toplandı. Alt panelde. Her görüntü, tipik olarak koşul başına tahlilde kullanılan 12 halkadan dördünün temsili bir anlık görüntüsüdür.
Her ayrı kuyucuktaki her aort halkasının köşesi siyahtır. Bu şekilde fotoğraflandığında, EKGS'ye maruz kalan aort halkaları damar büyümesi sergiler ve oklar, oluşan birçok damarın birkaçına işaret eder. Her damar, olgun olduklarını gösteren ara sıra dallanma ile endotel hücrelerinin zincirleri olarak karakterize edilir.
Kültürde filizlenme damarları gözlenemez. Üst paneldeki orta kuyular, Bu işlemi yaparken aort kor testinin nasıl yapılacağını size gösterdik. Doğru bir şekilde çalışmayı ve koşullarını anlamayı unutmamak önemlidir.
İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kontrollü bir ortamda fare aortundan kan damarlarının filizlenmesine izin vererek anjiogenezi incelemek için tasarlanmış bir aort halkası analizi sunar. Analiz, neovasküler çıkıntı üzerindeki etkilerini birkaç gün boyunca değerlendirmek için anjiyojenik bileşiklerin doğrudan eklenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- anjiogenez
- Vasküler biyoloji
- Deneysel analizler
Arka Plan
- anjiogenez hem fizyolojik hem de patolojik süreçler için kritik öneme sahiptir.
- Aort halkası analizi kan damarının oluşumu çalışması için bir model sunar.
- anjiogenezi anlamak çeşitli hastalıklar hakkında bilgilere yol açabilir.
- Analiz, farklı bileşiklerin bir 3D matris içinde test edilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- anjiogenezi incelemek için esnek bir sistem geliştirmek.
- anjiyojenik potansiyatoryler ve inhibitörlerin etkilerini değerlendirmek.
- in vitro aort halkalarından damar filizlenmesini gözlemlemek.
Kullanılan Yöntemler
- farelerden torasik aortun diseksiyonu.
- aort halkalarının hazırlanması ve 3D matris içine yerleştirilmesi.
- aort halkalarının deneysel reaktiflerle inkübasyonu.
- 6-12 gün boyunca neovasküler çıkıntının gözlemlenmesi.
Ana Sonuçlar
- aort halkalarından kan damarlarının başarılı bir şekilde filizlenmesi.
- çeşitli bileşiklerin anjiyojenik potansiyelinin değerlendirilmesi.
- farklı deneysel koşullar için analizin esnekliğinin gösterilmesi.
- anjiogenezin mekanizmalarına dair bilgiler.
Sonuçlar
- aort halkası analizi anjiogenezi incelemek için değerli bir araçtır.
- kontrollü bir ortamda anjiyojenik faktörlerin doğrudan test edilmesine izin verir.
- bulgular vasküler gelişim ve ilgili hastalıkların anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The aortic ring assay provides a physiologically relevant organotypic model for evaluating angiogenic and anti-angiogenic compounds in early discovery. By enabling direct compound testing in a 3D matrix with quantifiable neovessel outgrowth, it supports mechanistic de-risking of vascular targets and pathway validation. This assay bridges in vitro endothelial screens and in vivo models, improving predictive confidence in lead identification for cardiovascular, oncology, and ischemic disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing compound effects on sprouting from intact aortic tissue.
- Operational Value: Enables functional validation of angiogenic targets using a native vascular explant system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with measurable effects on vessel formation in a disease-relevant context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for dose-response screening of angiogenic modulators.
- Operational Value: Standardizes readouts through phase-contrast imaging and supernatant collection for biomarker analysis.
- Scalability Value: Supports 6-replicate testing per condition to address biological variability and ensure assay robustness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through use of murine aorta, reflecting in vivo-like angiogenic responses.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling longitudinal monitoring of neovessel outgrowth.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by identifying compounds with consistent pro- or anti-angiogenic activity across replicates.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a functional readout that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking compound treatment to phenotypic changes in vessel sprouting and maturation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized BME embedding and randomized ring placement to minimize positional bias.
- Analytics: Generates quantitative outputs via image analysis of sprout length/branching and ELISA-based measurement of angiogenic factors in supernatants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling angiogenic responses in a tissue-contextual system.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening diverse compound libraries across therapeutic areas involving vascular pathology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by observing direct effects on neovessel formation from native tissue.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized ring preparation, BME doming, and replicate testing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic validation of vascular activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on angiogenic efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and tissue handling under sterile conditions.
- Dependent on consistent BME quality and proper gelation at 37°C for dome formation.
- Necessitates standardized imaging protocols and blinded analysis to minimize observer variability.
- Involves optimization of compound dosing and incubation times based on solubility and stability in aqueous medium.
- Limited by biological variability between aortic segments, necessitating replicate testing for statistical confidence.
