Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Stephen Harlem laboratuvarından San Lee. Bugün size, çok çeşitli toprak ve tortu türleri için de geçerli olan, yüksek moleküler ağırlıklı genomik, ormandan toprağa DNA ekstraksiyonu için bir prosedür gösteriyoruz. Toprak mikrobiyal topluluklarının orman ölçer kütüphanesini oluşturmak için yüksek moleküler ağırlıklı genomik, DNA kullanıyoruz.

Elimizdeki bu kütüphanelerle, farklı toprak horizonları arasında bölünen mikrobiyal toplulukların çeşitliliğini ve metabolik potansiyelini inceleyebiliriz. Öyleyse başlayalım. Bu protokol hücre lizizi ile başlar.

İlk adım, betta mer capto etanolü %0,5'lik bir konsantrasyona ekleyerek denatüre edici tamponu tamamlamaktırEn iyi sonuçlar için, denatüre edici solüsyonu her seferinde taze hale getirin. Alternatif olarak, dört santigrat derecede tutulmuş bir haftadan daha eski bir tampon kullanın. Bir sonraki adım için, bir sıvı nitrojen yapıcıya ve bir otoklav ve önceden soğutulmuş havan tokmağı ve spatulaya ihtiyacınız olacak.

Önceden soğutulmuş harcın içine iki gramlık donmuş toprak numunesi koyun. Bir mililitre denatüre edici çözelti ekleyin. Ardından toprağı tamamen kaplamak için sıvı nitrojen ekleyin.

Toprak parçacıkları toz ve homojen görünene ve numune erimeye başlayana kadar numuneyi öğütmek için önceden soğutulmuş bir havaneli kullanın. Ardından daha fazla sıvı nitrojen ekleyin ve öğütme adımını tekrarlayın. Bu, önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak hücre lizis adımını tamamlar.

Öğütülmüş numuneyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hemen DNA ekstraksiyon adımına geçmek için numuneyi buz üzerinde tutun veya eksi 80 santigrat derecede saklayın. Litre kullanımı için, DNA ekstraksiyonuna başlamadan hemen önce, hexa deco trimetil amonyum bromür veya CTAB ve SDS ekleyerek ekstraksiyon tamponunu tamamlayın. Birinci.

CTAB'ın kristalleşip kristalleşmediğini kontrol edin ve eğer öyleyse, devam etmeden önce 60 santigrat derecede çözün. Daha sonra toplam %1'lik bir konsantrasyon için çözeltiye ekleyinArdından, %2'lik nihai konsantrasyona %20'lik SDS çözeltisi ekleyin. Bu formlar normaldir.

SDS eklendikten sonra, tamamlanan ekstraksiyon tamponunu 10 ila 15 dakika sonra 60 santigrat derecede saklayarak homojen tutun. Ekstraksiyon tamponu iyi çözündüğünde ve homojen hale geldiğinde, toprak numunesine dokuz mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve karıştırmak için düşük hızda kısa bir süre girdaplayın. Numuneyi ekstraksiyon tamponu ile 65 derece Santigrat derece hibridizasyon fırınında 40 dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, tüpleri her 10 dakikada bir nazikçe ters çevirin veya tüpleri rotorun en düşük hızında sürekli olarak döndürün. İnkübasyon sırasında, çözelti inkübasyondan sonra hafif viskoz görünebilir. Bir sonraki adım, DNA'yı lizis karışımındaki organik materyalden uzaklaştırmak için kloroform izoamil alkol kullanmaktır.

Numuneyi başlıkta yaklaşık 10 ila 14 santigrat derecede 1800 Gs'de 10 dakika santrifüjleyerek başlayın, pipet ucunuzu tüpün kenarı boyunca dikkatlice kaydırarak, üstteki bej tabakadan kaçınarak süpernatan içeren DNA'yı toplayın ve alttaki organik tabaka. Süpernatanı, 20 mililitre kloroform ISL alkol içeren önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın veya daha sonra, ekstraksiyon işlemini aynı numune üzerinde iki kez daha tekrarlayın. Bu arada, DNA ekstraktını ve kloroformu kaputta buz üzerinde tutun.

İkinci DNA ekstraksiyonu için, artık ekstraksiyon tamponu ile toprak peletini içeren tüpe geri dönün ve beş mililitre daha ekstraksiyon tamponu ekleyin. Karıştırmak için bir mililitrelik bir uçla hafifçe karıştırın ve peleti daha önce olduğu gibi yeniden süspanse etmek için kısa bir süre girdap yapın. 65 santigrat derecede bu sefer 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra 1800 Gs'de 10 dakika santrifüjleyin. Davlumbazda yaklaşık 10 ila 14 santigrat derecede, süpernatanı kloroform, izoamil alkol veya kloroform i a a ve önceki ekstraksiyondan elde edilen süpernatanı içeren tüpe aktarın. Toprak örneğinden mümkün olduğunca fazla DNA çıkarmak için tüm ekstraksiyon işlemini bir kez daha tekrarlayın.

Toprak numuneniz üzerinde toplam üç ekstraksiyonu tamamladığınızda, toplanan supra natant ve kloroform i a a içeren tüpü 1.25 RRP m'de dönen bir plaka üzerinde 10 dakika boyunca çok nazikçe çalkalayın Bu karıştırma adımından sonra, tüpü 1800 Gs'de 20 dakika boyunca yaklaşık 10 ila 14 santigrat derecede santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, sulu ve organik fazlar arasındaki arayüzü bozmamak için sulu fazı dikkatlice yeni bir ultra santrifüj tüpüne aktarın ve bir ila iki mililitre SNAT bırakın. Şimdi DNA'yı çökeltmek için 0.6 mililitre izopropil alkol ekleyin.

Toplanan süpernatanın her mililitresine göre, karıştırmak için tüpleri birkaç kez hafifçe ters çevirin. Bu noktada, DNA'nın uzun iplikler halinde çökeldiğini görebilirsiniz. Daha sonra DNA'yı izopropanol ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, DNA'yı santrifüjleme ile peletlemenin zamanı gelmiştir, tüpün bir köşesini santrifüje yerleştirirken işaretleyin, böylece DNA pelet dönüşünü nerede bekleyeceğinizi bilirsiniz 16.000 GS'de 20 dakika boyunca 20 ila 25 santigrat derece Santrifüjlemeyi takiben, izopropil alkolü boşaltarak ve / veya vakumla emerek çıkarın. Toprak örneklerindeki ekstraksiyon verimliliğine ve biyokütleye bağlı olarak, boyutları neredeyse görünmez ile dokuz milimetre genişliğinde değişen DNA peletini kaybetmemeye dikkat edin, DNA peletini oda sıcaklığında beş ila 20 dakika kurutun. Pelet kuruduğunda aşırı kurutmamaya dikkat edin.

DNA'yı 200 ila 400 mikrolitre te içinde yeniden süspanse edin. Hafifçe vurarak karıştırın. DNA çözeltisini 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

DNA'yı gece boyunca dört santigrat derecede tutun. DNA toprak örneğinden ekstrakte edildikten sonra DNA'yı tamamen çözmek için, numunenin konsantrasyonunu ve DNA bütünlüğünü kontrol etmek için kalan adımlar, Hallam laboratuvarından başka bir JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan standart prosedürlerdir. Seçtiğiniz yöntemi kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin.

Ayrıca, darbeli alan jeli elektroforezi veya PFGE kullanarak DNA numunenizin 10 ila 20 mikrolitresini tüketerek yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın bütünlüğünü kontrol edin. Medyan DNA boyutu, aşağı akış uygulamanıza bağlı olarak 36 kilobaz veya daha büyük olmalıdır. Alternatif olarak aşağıdaki sezyum klorür gradyan santrifüj adımına geçin, DNA ultrasantrifüjlemeden önce eksi 20 santigrat derece veya eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.

Bir sonraki adım, sezyum klorür gradyan santrifüjleme konsantresini takiben safsızlıkları gidererek DNA'yı daha da saflaştırmak için sezyum klorür gradyan santrifüjlemesi kullanmak ve AmCon ve MicroCon santrifüj filtre cihazlarını kullanarak DNA'yı daha da saflaştırmaktır. Sezyum klorür gradyan santrifüjü, yüksek kaliteli DNA elde etmenin anahtarıdır ve Hallam laboratuvarından başka bir JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Sezyum klorür gradyan santrifüjleme ve konsantrasyon adımlarını gerçekleştirdikten sonra, seçtiğiniz yöntemi kullanarak DNA konsantrasyonunu kontrol edin.

Ardından, PFGE kullanarak küçük bir DNA örneğini çalıştırarak yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın bütünlüğünü bir kez daha kontrol edin. İki gram zorlanmış topraktan izole edilen toplam genomik DNA miktarı, sezyum klorür ultrasantrifüjasyonundan önce ve sonra jel çalışmasında gösterildiği gibi 10 ila 180 mikrogram arasında değişmektedir. İzole edilen DNA'nın boyut aralığı genellikle 40 ila 60 kilobaz arasında değişir, burada gösterilen sezyum klorür ultrasantrifüjlemeden önce ve sonra genomik DNA örneklerinin bir kromatogramıdır.

Bu adım, DNA'nın saflığını arttırır ve iki 60'a iki 80 oranını daha önce 1.3'ten 1.6'ya, daha sonra 1.8'e 1.9'a yükseltir. Ayrıca, hümik asit kontaminasyonu anlamına gelen 230 nanometredeki tepe absorbansı, santrifüjlemeden sonra başarıyla azaltılmıştır. Az önce size yüksek moleküler genomik DNA'yı toprak mikrobiyal topluluklarından nasıl izole edeceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, ekstraksiyon ve denatüre etme tamponunu tam olarak talimatı izleyerek yapmayı unutmamak önemlidir. Ve izopropil alkol çökeltisinden sonra DNA damağınıza ulaşmamaya dikkat edin. Klorür gradyan santrifüjünden sonra DNA bandını geri kazandığınızda.

DNA geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için şırıngayı TE ile durulamayı unutmayın. Ve son olarak, önerilen tüm adımlarda izole edilmiş DNA'nızın miktarını ve kalitesini kontrol etmek için. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve denemenizde iyi şanslar.