Name: Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Öğrenin, toprak ve tortul mikrobiyal topluluklarından yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA izolasyonu için güvenilir bir protokol. Bu yöntem, mikrobiyal çeşitlilik ve metabolik potansiyel araştırmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu, Genom British Columbia ve British Columbia Orman Bakanlığı ve Range Kanada Vakfı orman toprak verimliliğini devam eden çalışmaları desteklemek için teşekkür etmek istiyorum. SL Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi bir burs ile desteklenmiştir.

Bölüm I: DNA çıkarımı Prosedür 1. 8 saat 6 örnekleri DNA ölçümü hariç işlenmesi için gereklidir. Çıkarma başlamadan önce, ön-chill harç, havaneli ve -20 ° C derin dondurucu içinde spatula veya sıvı azot kullanılarak gerekecektir. Ayrıca, 20 ml kloroform izoamil alkol (24:1) buz üzerinde içeren ön-chill 50 ml tüpler. 65 hibridizasyon fırın ayarlayın ° C ön ısıtma için. ° C kristalleri eritmek için 60 sıcak kristalize ise, CTAB çözüm kontrol edin. Denatüre çözüm ve çıkarma tampon çıkarımı (tarifi aşağıda görebilirsiniz) başlamadan hemen önce son maddeler ekleyerek tamamlayın. Davlumbaz bütün çıkarma işlemleri yürütmek. 2. Denatüre tampon ve tampon ekstraksiyon hazırlayın. Not: DNA verimi en üst düzeye çıkarmak için, kesin talimatları izleyerek tamponlar yapmak için kritik önem taşımaktadır. 3. 2 g toprak önceden soğutulmuş harç yerleştirin. Not: Toprak alanında toplanan taşımacılığı için kuru buz dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de saklanan olmalıdır Çözülme ve DNA ekstraksiyonu öncesinde 2 mm elek elek toprak. 10 g. kadar toprak miktarını artırabilir 4. Toprak çözüm denatüre 1 ml ekleyin. 5. Dondurma ve toprak parçacıkları toz ve homojen bir görünüm kadar bir havaneli kullanarak 2 sıvı N toprak öğütmek . Dondurma ve taşlama iki kez tekrarlayın. Not: sırasında donmuş toprak numunesi tutun, taşlama toprak örneği tam olarak karşılamak için yeterli sıvı azot kullanarak. Taşlama sırasında hafif bir erime kabul edilir. 6. 50 ml konik tüp önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak bir zemin toprak aktarın. Not: zemin toprak örneği bu noktada -80 ° C, gerekirse saklanabilir. 7. Ekstraksiyon tamponu 9 ml ekleyin. Çözüm ve toprak, vorteks kısa bir süre düşük hızda karıştırın. Not: tampon homojen olduğundan emin olmak için, 60 yaşında sıcak ° C Kullanmadan önce 10-15 dakika. Ekstraksiyon tampon geri kalanı boyunca 60 ° C&#39;de tutun. Vorteks hızı 8 (10 en fazla bir ölçekte). 8. Hibridizasyon fırında 65 ° C&#39;de 40 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, sürekli düşük hızda tüpler döndürmek, ya da hafifçe tüpleri her 10 dakikada bir ters. Not: tampon büyük bir yüzey alanı üzerine toprak temas etmesine izin hibridizasyon fırında tüp yatay yerleştirin. Çözüm inkübasyon sırasında biraz ağdalı görünebilir. 9 - 14 ° C - 10 10 dakika için 1800 x g santrifüjleyin 20 ml kloroform-izoamil alkol (24:1) içeren önceden soğutulmuş 50 ml konik tüp içine supernatant Transferi, buz üzerinde tutun. Not: supernatant aktarırken, organik katmanı (alt tabaka) rahatsız etmemek için dikkatli olun. Sadece temiz süpernatant toplamak için gerekli ise 1-2 ml süpernatant bırakın. Sık sık bej süpernatantı üstünde bir tabaka (kalınlığı yaklaşık 1-3 mm) görebilirsiniz. Süpernatantı toplarken bu katman Rahatsız etmeyin. Bu bej tabakasının kırılması önlemek için tüp duvar boyunca ucu slayt deneyin. Süpernatantı çok bulanık ise, süpernatantı kloroform izoamil alkol çıkarma, bir kez daha tekrarlayın. Kloroform aktarırken kloroform plastik eriyecek gibi, tek kullanımlık plastik pipetler etmeyin. Bir cam pipet kullanın veya cam bir silindir mezun, ya da 50 ml konik tüpler içine doğrudan kloroform dökün. 10 Toprak pelet 2 kez daha ayıkla; 10.1. 5 ml ekstraksiyon tamponu toprak pelet ekleyin, hafifçe, düşük hızda kısa karıştırın 1 ml ucu ile karıştırın. Not: Shake ve tampon kullanmadan önce karıştırın. 10.2. 65 ° C hibridizasyon fırında 10 dakika boyunca inkübe. 14 ° C - 10 10 dakika için 1800 x g santrifüjleyin Adım 9 tüp supernatant aktarın. Tüp toplanan süpernatant ve kloroform-izoamil alkol ile ekstraksiyon sırasında buz üzerinde tutun. Not: süpernatantı örnekleri arasında çapraz karıştırma olmadan aynı tüp eklemek emin olun. 10.3. 9.1 ve 9.2 bir kez daha tekrarlayın. 11. Dönen bir plaka kullanarak, toplanan supernatant (14-19 ml) ve 10 dakika için 1,25 rpm&#39;de kloroform-izoamil alkol içeren tüp çok hafifçe sallayın. Not: kaçağını önlemek için çok sıkı kapağını kapatın. Herhangi bir sızıntı kolaylıkla tespit edilebilir böylece tüp yerleştirmeden önce sallanan plaka üzerinde bir kağıt havlu yatıyordu. 12. 14 ° C - 10, 20 dakika boyunca 1800 x g santrifüjleyin 13. Sulu faz yeni bir tüpe aktarın. Not: sulu faz (üst katman) ve organik katmanı (alt arasında interfaz Rahatsız etmeyintabakası) süpernatant aktarmak. Sadece temiz süpernatant tahsilini sağlamak için yaklaşık 1.5-2 ml supernatant bırakın. 14. Izopropil alkol (21.a adım 15.a) kullanarak DNA kurtarın. Alternatif olarak, Amicon ® Ultra-15 Santrifüj Filtre Aygıtları (adım 15.b 21.b) kurtarmak için zor izopropil alkol yağış zor görünür pelet üretmek örnek biyokütle çok düşük bir miktar bekliyoruz. 15.a. Yeni bir tüp ultrasantrifüjdeki süpernatantı yerleştirin. 16.a. 0.6:1 bir hacim oranı toplanan süpernatant izopropil alkol ekleyin. Tüpler haricindekileri hafifçe bir kaç kez karıştırın. 17.a oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Madde 18.A. &#39; 25 ° C - 20 dk 20 16000 x g santrifüjleyin Tüm tüplerin ağırlıkları santrifüj adım önce iyi dengelenmiş olduğundan emin olun. Not: Mark tüp merkezkaç kuvveti yönü, bu nedenle DNA verimi düşük olduğunda daha kolay DNA pelet algılayabilir. 19.A. Şişeden veya vakum aspirasyon izopropil alkol çıkarın. DNA pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun. Not: en kısa sürede santrifüj tamamlanır tamamlanmaz izopropil alkol çıkarın. DNA pelet kaybetmemek için çok dikkatli olun. DNA pelet boyutu zor görünür, açık bir şekilde görünür (~ 9 mm çapında), toprak tipine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. DNA pelet dışarı emme dikkatle tüp duvar boyunca aspirasyon izopropil alkol artıklarını kaldırmak için tavsiye edilir. Madde 20.A. &#39; 5 oda sıcaklığında kuru DNA pelet - 20 dk. Not: kuru DNA pelet üzerine etmeyin, aksi takdirde DNA çözülür için zor olacak. 21.a. 200 ul TE DNA pelletini tekrar. Hafifçe dokunarak karıştırın. DNA solüsyonu 1.5 ml tüp içine aktarın. 4 tüp tutun ° C DNA tamamen çözünmesi için geceleme. Not: pelet boyutuna bağlı olarak, TE eklemek için ses düzeyini ayarlayabilirsiniz. Genellikle 200 - 400 ul TE iyi çalışır. * Alternatif adımları 15.b takip 21.b. 15.B. Amicon ® Ultra-15 Santrifüj Filtre Cihazları Ön yıkama 10 dk, 3500 x g santrifüj cihazı ve 15 ml TE ekleyin. Flow-through atın. 16.B. DNA çözümü adım 13 ila önceden yıkanmış Amicon filtre yerleştirin. DNA hacmi 200 azalır kadar 3500 x g&#39;de santrifüjleyin - 500 ul. Flow-through atın. 17.B. TE ile DNA iki kez yıkayın; 10 ml TE Amicon filtre cihazları ekleyin. DNA hacmi yaklaşık 200 ul azalır kadar 3500 x g&#39;de santrifüjleyin. Flow-through atın. Bir kez daha tekrarlayın. 18.B. DNA çözümü için filtre üzerinde yeni bir 1.5 ml tüp aktarın. 19.B. 40 ul TE Amicon filtre ekleyin. Filtre üzerinde herhangi bir DNA kalıntı kurtarmak için yukarı ve aşağı pipetleme filtre membranlar iki tarafında yıkayın. Adım 18.B. tüp yıkama solüsyonu 20.B. Gerekirse DNA Microcon ® Ultracel YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi ile daha da yoğun olabilir; 7 dakika 10.000 x g 200 ul TE ve santrifüj ekleyerek filtre ön yıkama. 1 dakika için 5000 x g filtre ve santrifüj DNA çözüm ekleyin. DNA çözüm filtre miktarı yaklaşık 50 ul düşürüldü kadar santrifüj tekrarlayın. Not: Maksimum Microcon filtre için ilk örnek hacmi 500 ul. 14000 x g. üzerindeki hızlarda santrifüj etmeyin Membran tamamen kuruyana kadar santrifüj bitmedi. Bazı sıvı filtre santrifüj sonra hala kapladığından emin olunuz. Üzerinde santrifüj ve membran kuru ise, daha sonra, 15 ul TE eklemek 30 saniye hafifçe ajitasyon ve 21.b. adıma geçin 21.b. DNA kurtarmak için 3 dakika xg 1000 yeni bir Microcon tüp ve santrifüj filtre ünitesi başaşağı yerleştirin. 22. TAE jel DNA (% 0.8, 0.5xTAE, 4 saat 50 V) ile sayısal olarak ve Nanodrop spektrofotometre veya Pico-yeşil tahlil ve plaka okuyucu. Not: DNA miktar jel üzerinde bilinen konsantrasyon (Yüksek moleküler DNA marker veya λHindIII) marker bant için örnek bant karşılaştırarak tahmin edilebilir. 23. (Daha fazla bilgi için Adım II, part2% 1, 1xTAE jel Pulsed Field Jel Elektroforezi (PFGE) kullanarak yüksek molekül ağırlıklı DNA bütünlüğünü denetleyin <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , DOI: Taupp ark 10.3791/1387 2009). Not: yerine düşük erime agaroz bu QC amaçla düzenli agaroz jel kullanabilirsiniz. Kısaca, elektroforez koşulları aşağıdaki gibi: 2-250 kb, 6 volt, ilk geçiş süresi: 5 sn, son bir geçiş süresi: 15 sn, 14 yaşında 12 saat çalıştırılan ° C SYBR Altın jel üzerinde DNA görselleştirmek için bir saat boyama. 24. Çıkarılan DNA molekül ağırlıkları tatmin edici, daha sonra aşağıdaki CSCL degrade santrifüj adıma geçin. Alternatif olarak, DNA -20 ° C veya -80 saklanabilir ° C CSCL santrifüj önce. DNA medyan boyutu büyük bir ekleme metagenomic DNA kütüphanesini inşa etmek istiyorsanız, eşit veya 36 Kb aşması gerekir. Bölüm II. Sezyum klorür degrade Ultrasantrifügasyon kullanarak DNA saflaştırılması Santrifüj hazırlanması: 1,5 - 2 saat Santrifüj adım: 18 saat Ethidium bromür (EtBr) Çıkarma ve santrifüj sonra DNA konsantre: 3 saat Prosedür Ayrıntılı bilgi için, Wright ve ark bakın. 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , DOI: 10.3791/1352 Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç Toplam tutarı 2 orman toprağı organik g (Ç ufuk) ve mineral ufuklar (Ae, AB ve Bt ufuklar) (Uzun Vadeli Toprak Verimlilik (LTSP) Skulow göl, BC, Kanada konumda bulunan numune izole edilen genomik DNA M.Ö. Orman ve Range Bakanlığı tarafından yönetilen) 10 mg ile 180 mg arasında değişmektedir. - Izole edilmiş DNA ortalama büyüklüğü 40 ila 60 kb (Şekil 1) genellikle edildi. 260 nm/280 nm&#39;de absorbans oranı 1,3-1,6 arasında ve genellikle toprak örneklerinde gözlenen hümik asit kirlenme gösterebilir 230 nm dalga boyunda bir tepe vardı. CSCL gradient santrifüj bu kirlenme önemli ölçüde azaltmış ve aynı zamanda 1.8 260/280 oranı arttı - 1.9 Şekil 2a ve 2b de gösterildiği gibi. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 CSCL Ultrasantrifügasyon önce çıkarılan genomik DNA PFGE resimler. lane1: 1 kb işaretleyici 100 ng, şerit 2: λHind III işaretleyici 100 ng, şerit 3: λHind III işaretleyici 250 ng, şerit 4: λHind III işaretleyici 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb işaretleyici 100 ng, şerit 6 ve 7: genomik mineral toprak ufuk Ae, şerit 8 ve 9 izole edilen DNA: LTSP yerinde Skulow göl, M.Ö. bulunan mineral toprak ufuk AB&#39;dan genomik DNA izole <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" /> Genomik DNA Şekil 2 Chromograms önce spektrofotometre tarafından tespit edilen (A) ve (B) sonra CSCL Ultrasantrifügasyon. Genomik DNA kalitesinde düzelme gösterir CSCL Ultrasantrifügasyon sonra 230 nm dalga boyunda absorbans değeri azalma unutmayın. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22AEM%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+insert+environmental+genomic+library+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Reçete * Çözüm denatüre 4 M Guanidin izotiyosiyanat 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) 1 mM EDTA 0.5% 2-mercaptoethanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Denatüre çözüm: toplam 10 ml </td></tr><tr><td> Guanidin izotiyosiyanat (MW 118,16) </td><td> 4.73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7.0) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Toplam 9.95 ml su ekleyin. </td></tr><tr><td colspan="2"> Otoklav. </td></tr><tr><td colspan="2"> Kullanmadan önce 50 ul 2-mercaptoethanol ekleyin. (1 ml denatüre Çözüm başına 2-mercaptoethanol 5 ul) Not: 4 denatüre çözüm tutun ° C Bir hafta daha büyük bir tampon kullanmayın. Mümkünse, taze tampon kullanımı yapmak. </td></tr></table> ** Ekstraksiyon Tampon 100 mM sodyum fosfat tamponu pH 7,0] 100 mM Tris-HCl pH 7,0] 100 mM EDTA pH 8.0] 1.5 M NaCl % 1 hekzadesiltrimetilamonyum bromür (STAB) % 2 SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Toplam 1 L Ekstraksiyon Tampon </td></tr><tr><td> 1M sodyum fosfat tamponu pH 7.0] * </td><td> 100 ml. </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl pH 7,0] </td><td> 100 ml. </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın. </td></tr><tr><td colspan="2"> 200ml,% 5 hekzadesiltrimetilamonyum bromür (STAB, otoklava) ve 100 ml,% 20 SDS (otoklava) kullanmadan hemen önce ekleyin. CTAB kristalize ise, 60 eritebilir ° C * 1M sodyum fosfat tamponu: 57.7 ml 1M sodyum fosfat tekbazlı (NaH 2 PO 4) ve 42.3 ml, 1M sodyum fosfat dibazik (NaH 2 PO 4). PH 7.0 &#39;a ayarlayın Not: 20% SDS yağış varsa kullanmayın. Çözüm için SDS eklediğinizde sütlü süspansiyon görmek normaldir. Bir kere, SDS eklemek ekstraksiyon tamponu yere 60 ° C SDS iyi askıya sağlamak için. </td></tr></table>

topraklar ve tortulları yüksek moleküler ağırlık genomik dna çıkarımı

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Toprak mikrobiyomları, karasal ekosistemler içinde besin ve enerji akışı ile yakından ilişkili genomik çeşitlilik ve metabolik yenilik ve nispeten keşfedilmemiş geniş bir rezervuar. Metagenomic olarak da bilinen Yetiştiriciliği bağımsız çevre genomik yaklaşımlar, bu genetik bilginin değeri yüksek tedavi ve biyokütle dönüşüm süreçleri için yolağı yeniden yapılanma ve fonksiyonel taraması ile ilgili benzeri görülmemiş bir erişim söz veriyorum. Ancak, toprak mikrobiyomları, hala büyük ekleme kütüphane üretimi için yeterli kalitede yüksek molekül ağırlıklı DNA temininde zorluk büyük ölçüde bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada toprak ve tortular yüksek molekül ağırlıklı, mikrobiyal topluluk genomik DNA ayıklamak için bir protokol tanıtmak. Izole genomik DNA kalitesi downstream sıralama ve tarama uygulamaları için büyük ekleme çevre genomik kütüphaneler oluşturmak için idealdir. Bu prosedür, hücre parçalama ile başlar. Mikropların hücre duvarlarını ve membranlar (β-mercaptoethanol) hem mekanik (taşlama) ve kimyasal güçleri tarafından parçalanmış. Genomik DNA ekstraksiyon tamponu, kloroform-izoamil alkol ve izopropil alkol kullanarak izole edilmiştir. Parçalama ve çıkarma adımları istihdam tamponlar guanidin izotiyosiyanat ve yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA bütünlüğünü korumak için hekzadesiltrimetilamonyum bromür (STAB) içerir. Alt uygulanmasına ilişkin olarak, izole genomik DNA sezyum klorür (CSCL) hümik asitler de dahil olmak üzere kirleri azaltır degrade Ultrasantrifügasyon kullanarak saflaştırılmış olabilir. Ilk yordamı, ekstraksiyon, DNA sayısallaması adım hariç, yaklaşık 8 saat sürer. CSCL degrade Ultrasantrifügasyon, iki gün bir süreçtir. Bütün bu prosedür sırasında, genomik DNA kesme önlemek için nazikçe tedavi edilmelidir, ciddi vorteks önlemek ve tekrarlayan ağır pipetleme.

Mikrobiyal topluluk yüksek molekül ağırlıklı ve yüksek kalitede genomik DNA izole etmek için bir metodoloji tarif edilir.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Toprak mikrobiyomu, ... ile yakından ilişkili olan, genomik çeşitlilik ve metabolik inovasyonun geniş ve nispeten keşfedilmemiş bir rezervuarıdır.

Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Stephen Harlem laboratuvarından San Lee. Bugün size, çeşitli toprak ve sediment türleri için de uygulanabilen, orman toprağından yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA ekstraksiyonu prosedürünü göstereceğiz. Toprak mikrobiyal topluluklarının metagenom kütüphanesini oluşturmak için yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA kullanıyoruz.Bu kütüphanelerle, farklı toprak horizonları arasında bölünen mikrobiyal toplulukların çeşitliliğini ve metabolik potansiyelini inceleyebiliriz. Öyleyse başlayalım. Bu protokol, hücre lizi ile başlamaktadır.İlk adım, beta-merkaptoetanol ekleyerek denatüre edici tamponu %0,5 konsantrasyona tamamlamaktır. En iyi sonuçlar için denatüre edici çözeltiyi her seferinde taze hazırlayın. Alternatif olarak, dört santigrat derecede saklanmış ve bir haftadan daha eski olmayan tamponu kullanın. Bir sonraki adım için sıvı azot kabı, bir otoklav ve önceden soğutulmuş havan, havan eli ve spatulaya ihtiyacınız olacak.Önceden soğutulmuş havanın içine iki gram dondurulmuş toprak örneği yerleştirin. Bir mililitre denatürasyon çözeltisi ekleyin. Ardından toprağı tamamen kaplayacak şekilde sıvı azot ekleyin.Toprak partikülleri toz haline gelip homojen görünene ve örnek erimeye başlayana kadar önceden soğutulmuş bir havan eli ile örneği ezin. Ardından daha fazla sıvı azot ekleyin ve öğütme adımını tekrarlayın. Bu işlem, önceden soğutulmuş bir spatula kullanılarak gerçekleştirilen hücre lizisi adımını tamamlar.Öğütülmüş örneği 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. DNA ekstraksiyon adımına hemen geçmek için örneği buz üzerinde tutun veya -80 °C'de saklayın. Daha sonraki kullanım için, DNA ekstraksiyonuna başlamadan hemen önce, heksadeksimetilamonyum bromür veya CTAB ve SDS ekleyerek ekstraksiyon tamponunu tamamlayın.CTAB'nin kristalleşip kristalleşmediğini kontrol edin ve eğer öyleyse, devam etmeden önce 60 °C'de çözün. Ardından, toplam konsantrasyon %1 olacak şekilde çözeltiye ekleyin. Sonrasında, son konsantrasyon %2 olacak şekilde %20'lik SDS çözeltisi ekleyin. Oluşan sütümsü süspansiyon normaldir.SDS eklendikten sonra, 10 ila 15 dakika sonra 60 °C'de saklayarak tamamlanmış ekstraksiyon tamponunun homojen kalmasını sağlayın. Ekstraksiyon tamponu tamamen çözündüğünde ve homojen hale geldiğinde, toprak örneğine dokuz mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve karıştırmak için düşük hızda kısa bir süre vorteksleyin. Ekstraksiyon tamponu içeren örneği, 65 °C'lik bir hibridizasyon fırınında 40 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyon sırasında, tüpleri her 10 dakikada bir nazikçe ters çevirin veya tüpleri rotorun en düşük hızında sürekli döndürün. İnkübasyon süresince çözelti, işlem sonunda hafifçe viskoz görünebilir. Bir sonraki adım, lizis karışımındaki organik maddelerden DNA'yı saflaştırmak için kloroform izoamil alkol kullanmaktır.Örneği çeker ocak içerisinde, yaklaşık 10 ila 14 °C'de 1800 Gs hızla 10 dakika boyunca santrifüjleyerek başlayın; pipet ucunuzu tüpün kenarı boyunca dikkatlice kaydırarak, üstteki bej tabakaya ve alttaki organik tabakaya değdirmeden DNA içeren süpernatantı toplayın. Süpernatantı, içerisinde 20 mL kloroform-izoamil alkol (CIA) bulunan önceden soğutulmuş 50 mL'lik bir tüpe aktarın; ardından ekstraksiyon işlemini aynı örnek üzerinde iki kez daha tekrarlayın. Bu sırada, DNA ekstraktını ve kloroform-izoamil alkolü çeker ocaktaki buz üzerinde tutun.İkinci DNA ekstraksiyonu için, kalıntı ekstraksiyon tamponu ile birlikte toprak peletini içeren tüpe geri dönün ve beş mililitre daha ekstraksiyon tamponu ekleyin. Karıştırmak için bir mililitrelik uçla nazikçe karıştırın ve peleti daha önce yaptığınız gibi yeniden süspande etmek için kısa süreli vorteksleyin. Bu kez 65 °C'de 10 dakika inkübe edin.Ardından 1800 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Çeker ocak altında, yaklaşık 10 ila 14 °C'de, süpernatanı kloroform, izoamil alkol veya kloroform i a a ve önceki ekstraksiyondan gelen süpernatanı içeren tüpe aktarın. Toprak örneğinden mümkün olduğunca fazla DNA ekstrakte etmek için tüm ekstraksiyon işlemini bir kez daha tekrarlayın.Toprak örneği üzerinde toplam üç ekstraksiyon tamamladığınızda, toplanan süpernatan ve kloroform içeren tüpü bir döner plaka üzerinde 1.25 RPM hızda 10 dakika boyunca çok hafifçe sallayın. Bu karıştırma adımından sonra, tüpü yaklaşık 10 ila 14 °C'de, 1800 G'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, sulu ve organik fazlar arasındaki arayüzü bozmamak için bir ila iki mililitre SNAT bırakarak sulu fazı dikkatlice yeni bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Şimdi DNA'yı çöktürmek için 0,6 mililitre izopropil alkol ekleyin.Toplanan süpernatantın her mililitresi için, karıştırmak amacıyla tüpleri birkaç kez nazikçe tersyüz edin. Bu aşamada, DNA'nın uzun iplikçikler halinde çöktüğünü görebilirsiniz. Ardından, DNA'yı izopropanol ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, santrifüjleme yoluyla DNA'yı çöktürme zamanı gelmiştir; tüpü santrifüje yerleştirirken, DNA peletinin nerede oluşacağını bilebilmek için tüpün bir köşesini işaretleyin. 20 ila 25 °C'de, 16,000 g hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminin ardından, izopropil alkolü dekantasyonla veya vakum emişiyle uzaklaştırın. Ekstraksiyon verimliliğine ve toprak örneklerindeki biyokütleye bağlı olarak boyutu neredeyse görünmezden 9 mm genişliğe kadar değişebilen DNA peletini kaybetmemeye dikkat edin. DNA peletini oda sıcaklığında 5 ila 20 dakika boyunca kurutun. Pelet kuruduğunda aşırı kurutmamaya özen gösterin.DNA'yı 200 ila 400 µL TE içinde yeniden süspande edin. Hafifçe vurarak karıştırın. DNA çözeltisini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.DNA'yı gece boyunca dört derece Celsius'ta bekletin. DNA'nın tamamen çözünmesi için, DNA toprak örneğinden ekstre edildikten sonra, örneğin konsantrasyonunu ve DNA bütünlüğünü kontrol etmeye yönelik geri kalan adımlar, Hallam laboratuvarının bir başka JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan standart prosedürlerdir. DNA konsantrasyonunu seçtiğiniz yöntemle belirleyin.Ayrıca, DNA örneğinizin 10 ila 20 µL'sini darbeli alan jel elektroforezi (pulsed field gel electrophoresis veya PFGE) ile yürüterek yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın bütünlüğünü kontrol edin. Medyan DNA boyutu, sonraki uygulamalarınıza bağlı olarak 36 kb veya daha büyük olmalıdır. Sıradaki sezyum klorür gradyan santrifüj adımına geçin; alternatif olarak, DNA ultrasantrifüj işleminden önce -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir.Bir sonraki adım, safsızlıkları gidererek DNA'yı daha fazla saflaştırmak için sezyum klorür gradyan santrifüjasyonu uygulamak, ardından sezyum klorür gradyan santrifüjasyonu konsantrasyonunu takip etmek ve AmCon ile MicroCon santrifüj filtre cihazlarını kullanarak DNA'yı daha da saflaştırmaktır. Sezyum klorür gradyan santrifüjasyonu, yüksek kaliteli DNA elde etmek için temeldir ve Hallam laboratuvarının başka bir JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Sezyum klorür gradyan santrifüjasyonu ve konsantrasyon adımlarını gerçekleştirdikten sonra, seçtiğiniz yöntemi kullanarak DNA konsantrasyonunu kontrol edin.Ardından, DNA'nın küçük bir örneğini PFGE kullanarak çalıştırarak yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın bütünlüğünü bir kez daha kontrol edin. İki gram zorlanmış topraktan izole edilen toplam genomik DNA miktarı, sezyum klorür ultrasantrifügasyonundan önce ve sonra gerçekleştirilen jel çalışmasında gösterildiği gibi 10 ile 180 mikrogram arasında değişmektedir. İzole edilen DNA'nın boyut aralığı genellikle 40 ile 60 kilobaz arasındadır; burada sezyum klorür ultrasantrifügasyonundan önceki ve sonraki genomik DNA örneklerine ait bir kromatogram gösterilmektedir.Bu adım, DNA saflığını artırarak 260/280 oranını 1,3'ten 1,6'ya, sonrasında ise 1,8 ile 1,9 arasına yükseltir. Ayrıca, hümik asit kontaminasyonuna işaret eden 230 nanometredeki pik absorbans, santrifüj sonrası başarıyla düşürülmüştür. Toprak mikrobiyal topluluklarından yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA'nın nasıl izole edileceğini göstermiş olduk.Bu prosedürü uygularken, ekstraksiyon ve denatüre edici tampon çözeltinin talimatlara tam olarak uyularak hazırlandığının hatırlanması önemlidir. Ayrıca, izopropil alkol çöktürme işleminden sonra DNA pelletine dokunmamaya dikkat edin. Klorür gradyan santrifügasyonun ardından DNA bandını geri kazandığınızda.DNA geri kazanımını maksimize etmek için şırıngayı TE ile durulamayı unutmayın. Son olarak, önerilen tüm adımlarda izole ettiğiniz DNA'nın miktarını ve kalitesini kontrol edin. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneyinizde başarılar dileriz.

extraction-high-molecular-weight-genomic-dna-from-soils

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz sezyum klorür yoğunluk gradiyenti santrifüj arıtma için 0.22 mikron Sterivex filtreler, konsantre planktonik biyokütle yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA çıkarılması için bir metodu tanımlar.

0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon

Bu video formalin ile fikse parafine gömülü malzeme DNA ekstraksiyonu için protokol göstermektedir. Bu doku kesitlerinde ksilen ile deparafinize olduğu bir çok günlük bir prosedür, etanol ile sulandırılır ve sonraki gen-spesifik veya genom analizi için DNA arındırmak ve izole etmek için proteinaz K ile tedavi edilir.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Biz hypersaline mikrobiyal paspaslar yüksek molekül ağırlıklı DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir protokol sağlar. Mikrobiyal hücrelerin DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma mat matris önce ayrılır. Bu konsantrasyonları, kalite ve DNA boyutunu artırır. Bu protokol, diğer refrakter numuneler için kullanılabilir.

Mikrobiyal Paspas Yüksek Moleküler Ağırlıklı DNA çıkarımı

Tükürükten DNA ekstraksiyonu, çok az bozunma/parçalanma ile veya hiç bozunma/parçalanma olmadan, kolayca bulunabilen bir yüksek moleküler ağırlıklı DNA kaynağı sağlayabilir.  Bu protokol, tükürük toplama/saklama ve DNA ekstraksiyonu için yüksek kalite gereksinimlerine sahip alt DNA tahlilleri için yeterli kalite ve miktarda olacak şekilde optimize edilmiş parametreler sağlar.

Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı

Kriosfer geçmiş çevre koşullarında kalıcı korunmuş organizmalar erişim imkanı sunmaktadır. Bir protokol toplamak ve toprak ve buz permafrost çekirdeklerini dekontaminasyonunda sunulmuştur. Eksojen kolonilerin ve DNA yokluğu tespit mikroorganizmalar sondaj veya işleme malzeme yerine, kontaminasyonu temsil ettiğini göstermektedir.

Antik Biyolojik Topluluklar barındırmıştır İç Araştırma Dondurulmuş Çekirdek dış bölümünden Eksojen Malzeme Kaldırma

Burada açıklanan, uzun okunan genom dizilemede kullanılmak üzere zorunlu biyotrofik mantar patojeni olan küllemeden genomik DNA'nın ekstraksiyonu, saflaştırılması ve kalite kontrolü için bir yöntemdir.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

Burada, toprak, rizosferde ve kök endosphere microbiomes amplicon sıra verileri elde etmek için bir protokol açıklayın. Bu bilgiler kompozisyon ve çeşitlilik bitki ilişkili mikrobiyal toplulukların araştırmak için kullanılan ve bitki türlerinin geniş bir kullanım için uygundur.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

Burada, düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA oranını artırarak çevresel antimikrobiyal direnci (AMR) değerlendirmek için basit bir teknik sunuyoruz. % 20 -% 30 PEG ve 1.2 M NaCl ile önceki tedavi, hem genomik hem de yatay olarak transfer edilen AMR genlerinin saptanmasına izin verir. Protokol, ek optimizasyon ile kitsiz bir sürece uygundur.

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu 

Bu protokol, mikobakterilerden yüksek kaliteli DNA çıkarmak için CTAB yöntemini tanımlar; bu yöntem, onların dayanıklı, mikolik asit açısından zengin hücre duvarlarının getirdiği zorlukları aşmaktadır. Bu süreç, enzimatik sindirim, CTAB ile hücre lizisi ve organik ekstraksiyon ile etanol çökeltilemesiyle DNA arındırmasını içerir. Bu yöntem, moleküler çalışmalar için uygun DNA üretir ve mikobakteriyel araştırmalar için güvenilirdir.

Mycobacterium Türlerinden Setiltrimetilamonium Bromid Tekniği ile Tam Genom Deoksiribonüklein Asit Ekstraksiyonu

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Öğrenin, toprak ve tortul mikrobiyal topluluklarından yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA izolasyonu için güvenilir bir protokol. Bu yöntem, mikrobiyal çeşitlilik ve metabolik potansiyel araştırmalarını destekler.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Daha fazla video keşfet