Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Stephen Harlem laboratuvarından San Lee. Bugün size, çeşitli toprak ve sediment türleri için de uygulanabilen, orman toprağından yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA ekstraksiyonu prosedürünü göstereceğiz. Toprak mikrobiyal topluluklarının metagenom kütüphanesini oluşturmak için yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA kullanıyoruz.

Bu kütüphanelerle, farklı toprak horizonları arasında bölünen mikrobiyal toplulukların çeşitliliğini ve metabolik potansiyelini inceleyebiliriz. Öyleyse başlayalım. Bu protokol, hücre lizi ile başlamaktadır.

İlk adım, beta-merkaptoetanol ekleyerek denatüre edici tamponu %0,5 konsantrasyona tamamlamaktır. En iyi sonuçlar için denatüre edici çözeltiyi her seferinde taze hazırlayın. Alternatif olarak, dört santigrat derecede saklanmış ve bir haftadan daha eski olmayan tamponu kullanın. Bir sonraki adım için sıvı azot kabı, bir otoklav ve önceden soğutulmuş havan, havan eli ve spatulaya ihtiyacınız olacak.

Önceden soğutulmuş havanın içine iki gram dondurulmuş toprak örneği yerleştirin. Bir mililitre denatürasyon çözeltisi ekleyin. Ardından toprağı tamamen kaplayacak şekilde sıvı azot ekleyin.

Toprak partikülleri toz haline gelip homojen görünene ve örnek erimeye başlayana kadar önceden soğutulmuş bir havan eli ile örneği ezin. Ardından daha fazla sıvı azot ekleyin ve öğütme adımını tekrarlayın. Bu işlem, önceden soğutulmuş bir spatula kullanılarak gerçekleştirilen hücre lizisi adımını tamamlar.

Öğütülmüş örneği 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. DNA ekstraksiyon adımına hemen geçmek için örneği buz üzerinde tutun veya -80 °C'de saklayın. Daha sonraki kullanım için, DNA ekstraksiyonuna başlamadan hemen önce, heksadeksimetilamonyum bromür veya CTAB ve SDS ekleyerek ekstraksiyon tamponunu tamamlayın.

CTAB'nin kristalleşip kristalleşmediğini kontrol edin ve eğer öyleyse, devam etmeden önce 60 °C'de çözün. Ardından, toplam konsantrasyon %1 olacak şekilde çözeltiye ekleyin. Sonrasında, son konsantrasyon %2 olacak şekilde %20'lik SDS çözeltisi ekleyin. Oluşan sütümsü süspansiyon normaldir.

SDS eklendikten sonra, 10 ila 15 dakika sonra 60 °C'de saklayarak tamamlanmış ekstraksiyon tamponunun homojen kalmasını sağlayın. Ekstraksiyon tamponu tamamen çözündüğünde ve homojen hale geldiğinde, toprak örneğine dokuz mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve karıştırmak için düşük hızda kısa bir süre vorteksleyin. Ekstraksiyon tamponu içeren örneği, 65 °C'lik bir hibridizasyon fırınında 40 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, tüpleri her 10 dakikada bir nazikçe ters çevirin veya tüpleri rotorun en düşük hızında sürekli döndürün. İnkübasyon süresince çözelti, işlem sonunda hafifçe viskoz görünebilir. Bir sonraki adım, lizis karışımındaki organik maddelerden DNA'yı saflaştırmak için kloroform izoamil alkol kullanmaktır.

Örneği çeker ocak içerisinde, yaklaşık 10 ila 14 °C'de 1800 Gs hızla 10 dakika boyunca santrifüjleyerek başlayın; pipet ucunuzu tüpün kenarı boyunca dikkatlice kaydırarak, üstteki bej tabakaya ve alttaki organik tabakaya değdirmeden DNA içeren süpernatantı toplayın. Süpernatantı, içerisinde 20 mL kloroform-izoamil alkol (CIA) bulunan önceden soğutulmuş 50 mL'lik bir tüpe aktarın; ardından ekstraksiyon işlemini aynı örnek üzerinde iki kez daha tekrarlayın. Bu sırada, DNA ekstraktını ve kloroform-izoamil alkolü çeker ocaktaki buz üzerinde tutun.

İkinci DNA ekstraksiyonu için, kalıntı ekstraksiyon tamponu ile birlikte toprak peletini içeren tüpe geri dönün ve beş mililitre daha ekstraksiyon tamponu ekleyin. Karıştırmak için bir mililitrelik uçla nazikçe karıştırın ve peleti daha önce yaptığınız gibi yeniden süspande etmek için kısa süreli vorteksleyin. Bu kez 65 °C'de 10 dakika inkübe edin.

Ardından 1800 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Çeker ocak altında, yaklaşık 10 ila 14 °C'de, süpernatanı kloroform, izoamil alkol veya kloroform i a a ve önceki ekstraksiyondan gelen süpernatanı içeren tüpe aktarın. Toprak örneğinden mümkün olduğunca fazla DNA ekstrakte etmek için tüm ekstraksiyon işlemini bir kez daha tekrarlayın.

Toprak örneği üzerinde toplam üç ekstraksiyon tamamladığınızda, toplanan süpernatan ve kloroform içeren tüpü bir döner plaka üzerinde 1.25 RPM hızda 10 dakika boyunca çok hafifçe sallayın. Bu karıştırma adımından sonra, tüpü yaklaşık 10 ila 14 °C'de, 1800 G'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, sulu ve organik fazlar arasındaki arayüzü bozmamak için bir ila iki mililitre SNAT bırakarak sulu fazı dikkatlice yeni bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Şimdi DNA'yı çöktürmek için 0,6 mililitre izopropil alkol ekleyin.

Toplanan süpernatantın her mililitresi için, karıştırmak amacıyla tüpleri birkaç kez nazikçe tersyüz edin. Bu aşamada, DNA'nın uzun iplikçikler halinde çöktüğünü görebilirsiniz. Ardından, DNA'yı izopropanol ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, santrifüjleme yoluyla DNA'yı çöktürme zamanı gelmiştir; tüpü santrifüje yerleştirirken, DNA peletinin nerede oluşacağını bilebilmek için tüpün bir köşesini işaretleyin. 20 ila 25 °C'de, 16,000 g hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminin ardından, izopropil alkolü dekantasyonla veya vakum emişiyle uzaklaştırın. Ekstraksiyon verimliliğine ve toprak örneklerindeki biyokütleye bağlı olarak boyutu neredeyse görünmezden 9 mm genişliğe kadar değişebilen DNA peletini kaybetmemeye dikkat edin. DNA peletini oda sıcaklığında 5 ila 20 dakika boyunca kurutun. Pelet kuruduğunda aşırı kurutmamaya özen gösterin.

DNA'yı 200 ila 400 µL TE içinde yeniden süspande edin. Hafifçe vurarak karıştırın. DNA çözeltisini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.

DNA'yı gece boyunca dört derece Celsius'ta bekletin. DNA'nın tamamen çözünmesi için, DNA toprak örneğinden ekstre edildikten sonra, örneğin konsantrasyonunu ve DNA bütünlüğünü kontrol etmeye yönelik geri kalan adımlar, Hallam laboratuvarının bir başka JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan standart prosedürlerdir. DNA konsantrasyonunu seçtiğiniz yöntemle belirleyin.

Ayrıca, DNA örneğinizin 10 ila 20 µL'sini darbeli alan jel elektroforezi (pulsed field gel electrophoresis veya PFGE) ile yürüterek yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın bütünlüğünü kontrol edin. Medyan DNA boyutu, sonraki uygulamalarınıza bağlı olarak 36 kb veya daha büyük olmalıdır. Sıradaki sezyum klorür gradyan santrifüj adımına geçin; alternatif olarak, DNA ultrasantrifüj işleminden önce -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir.

Bir sonraki adım, safsızlıkları gidererek DNA'yı daha fazla saflaştırmak için sezyum klorür gradyan santrifüjasyonu uygulamak, ardından sezyum klorür gradyan santrifüjasyonu konsantrasyonunu takip etmek ve AmCon ile MicroCon santrifüj filtre cihazlarını kullanarak DNA'yı daha da saflaştırmaktır. Sezyum klorür gradyan santrifüjasyonu, yüksek kaliteli DNA elde etmek için temeldir ve Hallam laboratuvarının başka bir JoVE protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Sezyum klorür gradyan santrifüjasyonu ve konsantrasyon adımlarını gerçekleştirdikten sonra, seçtiğiniz yöntemi kullanarak DNA konsantrasyonunu kontrol edin.

Ardından, DNA'nın küçük bir örneğini PFGE kullanarak çalıştırarak yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın bütünlüğünü bir kez daha kontrol edin. İki gram zorlanmış topraktan izole edilen toplam genomik DNA miktarı, sezyum klorür ultrasantrifügasyonundan önce ve sonra gerçekleştirilen jel çalışmasında gösterildiği gibi 10 ile 180 mikrogram arasında değişmektedir. İzole edilen DNA'nın boyut aralığı genellikle 40 ile 60 kilobaz arasındadır; burada sezyum klorür ultrasantrifügasyonundan önceki ve sonraki genomik DNA örneklerine ait bir kromatogram gösterilmektedir.

Bu adım, DNA saflığını artırarak 260/280 oranını 1,3'ten 1,6'ya, sonrasında ise 1,8 ile 1,9 arasına yükseltir. Ayrıca, hümik asit kontaminasyonuna işaret eden 230 nanometredeki pik absorbans, santrifüj sonrası başarıyla düşürülmüştür. Toprak mikrobiyal topluluklarından yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA'nın nasıl izole edileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, ekstraksiyon ve denatüre edici tampon çözeltinin talimatlara tam olarak uyularak hazırlandığının hatırlanması önemlidir. Ayrıca, izopropil alkol çöktürme işleminden sonra DNA pelletine dokunmamaya dikkat edin. Klorür gradyan santrifügasyonun ardından DNA bandını geri kazandığınızda.

DNA geri kazanımını maksimize etmek için şırıngayı TE ile durulamayı unutmayın. Son olarak, önerilen tüm adımlarda izole ettiğiniz DNA'nın miktarını ve kalitesini kontrol edin. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneyinizde başarılar dileriz.