Doku Mühendisliği ve Hücre Kültürü için Lifli Polimer Yapı iskeleleri elektrospinning
October 21st, 2009
Polimerlerin doku mühendisliği ve hücre kültürü için elektrospinning süreci, bu makalede ele alınmaktadır. Özellikle multi-polimer elektrospinning photopatterning ve ek işleme yetenekleri ile photoreactive macromers elektrospinning açıklanmıştır.
Bu video, doğal hücre dışı matrisin mimarisini ve boyut ölçeğini taklit eden fiber iskeleler oluşturmak için doku mühendisliği ve hücre kültürü için popüler bir teknik olan elektro eğirme polimerlerini göstermektedir. Burada, ışığa maruz kalma ile çapraz bağlanma yeteneğine sahip fotoreaktif bir hyaluronik asidi elektro döndürüyoruz ve hücresel infiltrasyonu ve doku dağılımını artırmak için kanallar ve iskeleler ve çok ölçekli gözeneklilik oluşturan bir süreç olan foto desenleme gibi daha ileri işleme uygulamalarını tanıtıyoruz. Ek olarak, iki farklı polimerin aynı mat içine elektro olarak eğirilmesine izin veren, iskele mekaniğinin ayarlanmasına ve hücresel sızma için gözenekliliğin bozulmasına ve uyarlanmasına izin veren çok polimerli iskele oluşumu kullanıyoruz.
Merhaba, ben Pennsylvania Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü'nden Jason Burdick'in laboratuvarından Jamie Kovi. Merhaba, ben Harini Swin, aynı zamanda Burdick Lab'den. Bugün size doku mühendisliği için elektro eğirme fiber iskeleler için bir prosedür göstereceğiz.
Ayrıca, fotoğraf desenleme ve çoklu polimer iskele oluşumunun ek işleme yeteneklerini de tanıtacağız. Bu prosedürleri laboratuvarımızda, hyaluronik asit iskelelerindeki HMSE hücre etkileşimlerini ve infiltrasyonlarını incelemek için kullanıyoruz. Bu teknikleri, menisküs ve miyokard gibi lif takviyeli dokuları incelemek için diğer çeşitli polimerlerle de kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Fotoğraf başlatıcının ağırlıkça% 0.5'lik bir çözeltisini hazırlayın. 2 9 5 9 veya I 2 9 5 9'u deiyonize suda 37 santigrat derecede birkaç gün çözerek kürlüyorum.
I kürleme, elektro eğirme için fotoreaktif bir polimere ihtiyaç duyulursa kullanılır. Deiyonize su, %2 ağırlıklı metillenmiş hyaluronik asit veya MEHA, %3 ağırlıklı polietilen oksit veya PEO ve %0.05 ağırlık I 2 9 5 9 solüsyonunda nihai konsantrasyonlara birleştirilmiş elektro eğirme çözeltisini hazırlamak için beş dakika boyunca girdap yapın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Çözeltiyi çözmek için, çözeltiyi bir şırıngaya aktarın ve ucuna 18 gauge, altı inç uzunluğunda künt uçlu bir iğne takın.
Ardından, bir şırınga pompası kullanın ve saatte 1,2 mililitre hızında fırlatacak şekilde ayarlayın. Şırınga motoru iğnesini şırınga pompasına yerleştirin. Yüksek voltajlı bir güç kaynağının topraklı kablosunu toplama aparatına takın.
Bu prosedürde saniyede yaklaşık 10 metre hızla dönen bir mandrel kullanacağız. Hizalanmış lifleri toplamak için, pozitif yüklü ucu iğneye takın, iğneyi veya toplama cihazını ikisi arasında 15 santimetre mesafe olacak şekilde ayarlayın. Şırınga pompası akışını başlatın ve iğnenin ucunda sıvı görüntülendiğinde, güç kaynağını açın ve voltajı 22 kilovolta ayarlayın.
İstenilen kalınlığa ulaşılana kadar lifleri iskele üzerine toplayın. Toplama süresi, istenen kalınlığa ve kullanılan elektro eğirme çözeltisinin hacmine bağlıdır. Fotoğraf desenleme için 16 saat boyunca eğrilmiş elektro eğrilmiş paspaslar kullanıyoruz.
Toplama işlemi tamamlandıktan sonra iskeleyi toplama aparatından çıkarın ve çözücünün tamamen çıkarılması için gece boyunca vakum altında saklayın. İskele paspasından beş milimetreye beş milimetre numuneyi makasla kesin. Çapraz bağlamaya hazırlanmak için her iskeleyi folyo kaplı bir cam slayt üzerine yerleştirin ve fotoğraf maskesini doğrudan iskele üzerine yerleştirin, temiz bir cam slaytla kaplayın ve slaydın her iki ucunu bağlayıcı klipslerle kırpın.
Bir nitrojen odası kullanarak, oksijene maruz kalma nedeniyle çapraz bağlanmanın azalmasını önlemek için iskeleyi boşaltın. İskele kurulumunu, beş dakika boyunca bir harmanlama adaptörüyle santimetre kare 365 nanometre ışık başına yaklaşık 10 miliwatt altındaki nitrojen odasına yerleştirin. Her iskeleyi çıkarın ve 12 oyuklu bir doku kültürü plakasına yerleştirin.
Her birine iki mililitre deiyonize su ekleyin. Suyun EVA anormalliğini önlemek için plakayı iyice yerleştirin ve 24 saat boyunca 37 santigrat derece yerleştirin. Yıkamalar arasında kuyudan deiyonize suyu aspire etmek için bir vakum pipeti kullanarak suyu her sekiz saatte bir değiştirin.
Sıcak bir plaka üzerinde% 90 etanol içinde% 5 ağırlığında% PEO çözeltisi hazırlayın. İşlemden en az iki saat önce 50 santigrat derecede 700 RPM'de karıştırın. Karıştırdıktan sonra, mililitre başına 10 mikrogramlık bir son konsantrasyon için DPI ekleyin.
PEO ve DPI çözeltisini üç mililitrelik bir şırıngaya aktarın ve ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın. Daha sonra, ikinci bölümde açıklanan elektro eğirme çözeltisini hazırlayın ve üç mililitrelik bir şırıngaya 25 mikromolar mikro pipetin nihai konsantrasyonu için metoksi etil biyokarbon mol çubuk domine B ekleyin. Ve ışıktan korumak için bir alüminyum folyo sarın.
22 milimetreye 22 milimetre metillenmiş cam kapak kızaklarının kenarlarını, kapak kızakları mandl çevresine oturacak şekilde mandrel yüzeyine sabitlemek için dikkatlice bant kullanın. Beş milimetre uzunluğunda bir silikon boru parçası kullanarak, bir ucunu yem kilidi ekleri olan şırıngalardan birine takın. Diğer ucunu bir iğneye takın, şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve iğneyi fandaki delikten geçirin.
Fanlar, mandrelin uzunluğunu çevirir ve elde edilen iskelede her iki polimerin eşit dağılımını sağlamak için kullanılır. MEHA içeren şırınga için iğne uçlarının mandrel üzerinde ortalandığından emin olun. İğne ucunu mandrelden 15 santimetre uzağa yerleştirin ve çamurluğu iğne ucundan altı santimetre mesafeye ayarlayın.
Şırınga pompasını saatte 1,2 mililitre verecek şekilde programlayın ve güç kaynağını 22 kilovolta ayarlayın. Şırıngayı PEO ile tam olarak aynı şekilde ayarlayın, ancak iğne ucunu mandrelden 10 santimetre uzağa yerleştirin ve güç kaynağını 15 kilovolta ayarlayın. Bunu takiben, ışıkları kapatın ve mandrel ve şırınga pompalarını açın.
Her iki iğnenin uçlarında sıvı göründüğünde alüminyum folyoyu şırıngalardan çıkarın. Aynı anda güç kaynaklarını açın ve toplama tamamlandığında fanları prize takın. Güç kaynaklarını ve mandreli kapatın ve fanların fişini dikkatlice çekin.
Kapak fişlerini ve bandı bir tıraş bıçağı kullanarak çıkarın. Lifler, rumin ve dpi için filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskopta görselleştirilebilir. Her bir kapak kızağını elektro spon polimeri ile altılı ayrı bir kuyucuğa yerleştirin.
Kuyu plakası: Solvent ve kirleticilerin tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için iskeleleri gece boyunca iki mililitre PBS'de inkübe edin. 24 saat sonra, PBS'yi 30 dakika boyunca laminer akış başlığında mikrop öldürücü bir UV lambası altında kuyu yerleştirme iskelelerinden aspire etmek için vakum kullanın. Sterilizasyon için standart hücre kültürü uygulayın ve istenen hücre yoğunluğunda konsantre bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
Örneğin, 22 x 22 milimetrelik bir kapak kayması için 100 mililitre hücre süspansiyonu kullanın. Kuluçka makinesine bir saat boyunca yerleştirin. Her birine uygun miktarda hücre kültürü ortamı ekleyin.
İskeleleri tekrar kuluçka makinesine yerleştirin. Hücreleri ve lifleri, topraklanmış düz bir plaka üzerine toplanan beklendiği gibi trissy ve fitzy için filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak görselleştirmek için Invitrogen'den ticari olarak temin edilebilen bir canlı ölü kiti kullanarak hücreleri boyayın. İskeleler dönen bir mandrel üzerinde toplanırken rastgele dağıtılmış lifler üretin.
İskelenin foto çapraz bağlanması sırasında taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görüntülendiğinde hizalanmış lifler üretin, iskelenin daldırılmasından ve deiyonize suyun reaktif olmayan ha'ya daldırılmasından sonra iskele ile ışık kaynağı arasına bir fotoğraf maskesi yerleştiriyoruz. Işıktan engellenen bu alanlar çıkarılır ve PEO çıkarılır ve floresan boyadan da anlaşılacağı gibi makro gözeneklerin oluşumunu görürüz. MEHA ve PEO jetlerinin eş zamanlı elektro eğirmesi, tek tek polimerlerden oluşan farklı lif popülasyonları içeren kompozit bir iskele ile sonuçlanır.
HMC'lerin liflerle pozitif etkileşime girdiği görülmektedir. Yeşil lekeden de anlaşılacağı gibi sadece canlı kalmakla kalmazlar, aynı zamanda kendilerini kırmızı lifler boyunca hizalanacak şekilde yönlendirmeye yönlendirilmiş gibi görünürler. Size doku mühendisliği için fiber iskelelerin nasıl elektro döndürüleceğini gösterdik.
Ayrıca fotoğraf desenleme ve çoklu polimer elektro eğirme gibi ek yetenekler de sunduk. Bu prosedürü yaparken, daha fazla deney yapmadan önce tek tip lifler oluşturmak için her polimerin elektro eğirme parametrelerini optimize etmeyi unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, doku mühendisliği ve hücre kültürü için polimerlerin elektroipliğini ele alır ve fotoreaktif makromerlere odaklanır. Fotopatrolama ve çoklu polimer elektroipliği gibi ek işleme yeteneklerini vurgular.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Doku Mühendisliği
- Polimer Bilimi
- Hücre Kültür Teknikleri
Arka Plan
- Elektroipliği, lifli yapı iskeleleri oluşturmak için kullanılan bir tekniktir.
- Bu iskeleler, doğal hücre dışı matrisin mimarisini taklit eder.
- Fotoreaktif malzemeler, ışık maruziyeti kullanılarak çapraz bağlanabilir.
- Çoklu polimer iskeleler, gelişmiş mekanik özellikler ve bozunma oranlarına izin verir.
Çalışmanın Amacı
- Lifli yapı iskeleleri oluşturmak için elektroipliği sürecini göstermek.
- İskele oluşumunda fotoreaktif hyaluronik asidin kullanımını araştırmak.
- Fotopatrolama gibi gelişmiş işlem uygulamalarını tanıtmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fotoreaktif polimerlerin elektroipliği.
- Çapraz bağlanma için ışık maruziyeti uygulaması.
- Fotopatrolama tekniklerinin uygulanması.
- Özelleştirilmiş özellikler için çoklu polimer iskelelerin oluşturulması.
Ana Sonuçlar
- Hücre dışı matrisi taklit eden lifli yapı iskelelerinin başarılı bir şekilde oluşturulması.
- Fotopatrolama yoluyla kanallar ve iskeleler oluşturma yeteneğinin gösterilmesi.
- Çoklu polimer elektroipliği, iskele özelliklerinin özelleştirilmesine izin verir.
- Gelişmiş hücresel infiltrasyon ve doku dağılımının gözlemlenmesi.
Sonuçlar
- Elektroipliği, doku mühendisliği uygulamaları için uygun bir yöntemdir.
- Fotoreaktif polimerler, iskele tasarımında benzersiz avantajlar sunar.
- Gelişmiş işleme teknikleri, iskele işlevselliğini önemli ölçüde iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Electrospinning enables the creation of fibrous scaffolds that replicate the native extracellular matrix, providing a biomimetic platform for studying cell behavior and tissue formation. This approach supports early-stage target validation by offering tunable microenvironments to assess cellular responses, infiltration, and differentiation. The integration of photopatterning and multi-polymer techniques enhances scaffold functionality, allowing for precise control over architecture and degradation to improve predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mimicking native tissue architecture to study cell-scaffold interactions.
- Operational Value: Provides reproducible fibrous substrates for consistent cellular assays across experiments.
- Predictive Value: Supports functional target validation through directed stem cell differentiation and alignment along fiber populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized scaffolds with controlled porosity and fiber alignment for reliable compound screening.
- Operational Value: Facilitates assay scalability through multi-polymer electrospinning and photopatterning for high-throughput applications.
- Translational Value: Produces disease-relevant systems with tailored mechanics to model tissue-specific microenvironments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by correlating scaffold design with cellular infiltration and tissue distribution outcomes.
- Operational Value: Supports continuity from discovery to preclinical validation via sterilizable, cell-compatible scaffolds.
- Predictive Value: Allows risk-adjusted advancement decisions by tuning degradation and mechanics to match target tissue properties.
Pipeline & Workflow Integration
Electrospinning fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, enabling hypothesis-driven scaffold design for mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by directing cellular behavior along aligned fibers to study mechanotransduction.
- Screening: Delivers quantitative outputs such as fiber alignment and porosity that correlate with cellular response patterns.
- Analytics: Provides measurable readouts including fiber diameter, scaffold thickness, and photo-patterned channel formation for comparative analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through multi-polymer scaffolds that model complex tissue interfaces like meniscus or myocardium.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating diverse scaffold libraries across multiple polymer systems and crosslinking chemistries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in cell-material interactions through defined architectural cues.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled voltage, flow rate, and collection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of scaffold-mediated biological effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through tunable degradation and mechanics aligned with disease-relevant timelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer chemistry, high-voltage equipment, and photochemical crosslinking.
- Needs precision syringe pumps, mandrel systems, and UV light sources for consistent fiber deposition and patterning.
- Demands standardization across teams for solution preparation, environmental controls, and post-processing steps.
- Involves adaptation considerations when transferring protocols between different polymer systems or reactive macromers.
- Includes practical limitations such as solvent removal efficiency and potential batch-to-batch variability in fiber morphology.
