Doku Mühendisliği ve Hücre Kültürü için Lifli Polimer Yapı iskeleleri elektrospinning

Bu video, doku mühendisliği ve hücre kültürü için popüler bir teknik olan, doğal hücre dışı matrisin mimarisini ve boyut ölçeğini taklit eden fiber iskeleler oluşturmak amacıyla kullanılan elektro eğirme polimerlerini göstermektedir. Burada, ışık maruziyeti ile çapraz bağlanma yeteneğine sahip fotoreaktif bir hyaluronik asidi elektro eğirme yöntemiyle işliyoruz ve hücresel infiltrasyonu ve doku dağılımını artırmak için kanallar, iskeleler ve çok ölçekli gözeneklilik oluşturan bir işlem olan foto desenleme gibi ek işleme uygulamalarını tanıtıyoruz. Ayrıca, iki farklı polimerin aynı mat içine elektro eğirilmesine olanak tanıyan, iskele mekaniklerinin ve bozunmasının ayarlanmasına ve hücresel infiltrasyon için gözenekliliğin özelleştirilmesine imkan veren çoklu polimer iskele oluşumunu kullanıyoruz.

Merhaba, ben Pennsylvania Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü'ndeki Jason Burdick laboratuvarından Jamie Kovi. Merhaba, ben de Burdick Laboratuvarı'ndan Harini Swin. Bugün size doku mühendisliği için elektro eğirme yöntemiyle fiber iskelelerin hazırlanması prosedürünü göstereceğiz.

Ayrıca, foto-desenleme ve çoklu polimer iskele oluşumunun ek işlem yeteneklerini tanıtacağız. Laboratuvarımızda bu prosedürleri, hyaluronik asit iskelelerdeki HMSE hücre etkileşimlerini ve infiltrasyonlarını incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca bu teknikleri; menisküs ve miyokard gibi fiberle güçlendirilmiş dokuları incelemek amacıyla çeşitli diğer polimerlerle birlikte kullanmaktayız.

Hadi başlayalım. Foto başlatıcının %0,5'lik (ağırlıkça) bir çözeltisini hazırlayın. Irgacure 2959'u veya I 2959'u, birkaç gün boyunca 37 °C'de çözerek deiyonize su içerisinde hazırlıyorum.

Elektro eğirme için fotoreaktif bir polimer gerektiğinde I cure kullanılır. Deiyonize su içerisinde nihai konsantrasyonları %2 (ağırlıkça) metillenmiş hiyaluronik asit veya MEHA, %3 (ağırlıkça) polietilen oksit veya PEO ve %0,05 (ağırlıkça) I 2 9 5 9 çözeltisi olacak şekilde hazırlanan elektro eğirme çözeltisini beş dakika boyunca vortekslenmiş ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Çözeltiyi çözmek için, çözeltiyi bir şırıngaya aktarın ve ucuna 18 gauge, altı inç uzunluğunda küt uçlu bir iğne takın.

Ardından, bir şırınga pompası kullanın ve 1,2 mililitre/saat hızda boşaltacak şekilde ayarlayın. Şırınga motoru iğnesini şırınga pompasına yerleştirin. Bir yüksek voltaj güç kaynağının topraklandırma ucunu toplama düzeneğine bağlayın.

Bu prosedürde, yaklaşık 10 metre/saniye hızda dönen bir mandrel kullanacağız. Hizalanmış fiberler toplamak için, pozitif yüklü ucu iğneye bağlayın, iğneyi veya toplama düzeneğini ikisi arasında 15 santimetre mesafe olacak şekilde ayarlayın. Şırınga pompasının akışını başlatın ve iğnenin ucunda sıvı görüldüğünde, güç kaynağını açıp voltajı 22 kilovolt seviyesine ayarlayın.

İstenilen kalınlığa ulaşılana kadar lifleri iskele üzerine toplayın. Toplama süresi, hedeflenen kalınlığa ve kullanılan elektro eğirme çözeltisinin hacmine bağlıdır. Foto-desenleme için 16 saat boyunca eğrilmiş elektro eğirme matları kullanıyoruz.

Toplama işlemi tamamlandıktan sonra iskeleyi toplama aparatından çıkarın ve çözücünün tamamen uzaklaştırılması için gece boyunca vakum altında saklayın. İskele matından makas yardımıyla beş milimetreye beş milimetre boyutunda örnekler kesin. Çapraz bağlama hazırlığı için her bir iskeleyi folyo kaplı bir cam lam üzerine yerleştirin ve foto maskeyi doğrudan iskelenin üzerine koyup temiz bir cam lam ile kapatarak lamın her iki ucunu ataçlarla sabitleyin.

Oksijen maruziyeti nedeniyle çapraz bağlanmanın azalmasını önlemek için bir azot kamarası kullanarak iskale temizleme işlemi yapın. İskele düzeneğini, bir kollatör adaptör ile santimetrekare başına yaklaşık 10 miliwatt 365 nanometre ışık altında, azot kamarasına beş dakika boyunca yerleştirin. Her bir iskeleyi çıkarıp 12 kuyucuklu doku kültürü plakasına yerleştirin.

Her birine iki mililitre deiyonize su ekleyin. Suyun EVA aberasyonunu önlemek için plakayı kuyu şeklinde doldurun ve 37 °C'de 24 saat boyunca bekletin. Yıkamalar arasında kuyucuklardaki deiyonize suyu aspire etmek için vakum pipeti kullanarak suyu her sekiz saatte bir değiştirin.

Sıcak tabla üzerinde %90 etanol içinde ağırlıkça %5'lik PEO çözeltisi hazırlayın. İşlemden önce en az iki saat boyunca 50 °C'de 700 RPM'de karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, son konsantrasyonu 10 µg/mL olacak şekilde DPI ekleyin.

PEO ve DPI çözeltisini üç mililitrelik bir şırıngaya aktarın ve ışık koruması sağlamak için alüminyum folyo ile sarın. Ardından, ikinci bölümde açıklanan elektrospinning çözeltisini hazırlayın ve mikropipet yardımıyla nihai konsantrasyonu 25 µM olacak şekilde methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B ekleyip üç mililitrelik bir şırıngaya alın. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın.

22 milimetre x 22 milimetre boyutundaki metillendirilmiş cam lamların kenarlarını, lamlar mandrel çevresine uygun şekilde yerleşecek şekilde scotch bant kullanarak dikkatlice mandrel yüzeyine sabitleyin. Beş milimetre uzunluğunda bir silikon tüp parçası kullanarak, bir ucunu luer lock bağlantılı şırıngalardan birine takın. Diğer ucunu bir iğneye bağlayın, şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve iğneyi fan üzerindeki delikten geçirin.

Yelpaze mekanizmaları, mandrel boyunca hareket eder ve sonuçta oluşan iskelede her iki polimerin eşit dağılımını sağlamak için kullanılır. MEHA içeren şırınganın iğne uçlarının mandrel üzerinde merkezlendiğinden emin olun. İğne ucunu mandrelden 15 santimetre uzaklığa konumlandırın ve yelpazeyi iğne ucundan altı santimetre mesafeye ayarlayın.

Şırınga pompasını saatte 1,2 mililitre verecek şekilde programlayın ve güç kaynağını 22 kilovolt olarak ayarlayın. PEO içeren şırıngayı tamamen aynı şekilde hazırlayın, ancak iğne ucunu mandrelden 10 santimetre uzaklığa konumlandırın ve güç kaynağını 15 kilovolt olarak ayarlayın. Ardından, ışıkları kapatıp mandreli ve şırınga pompalarını çalıştırın.

Her iki iğnenin uçlarında sıvı görünür olduğunda, şırıngalardaki alüminyum folyoyu çıkarın. Toplama işlemi tamamlandığında, güç kaynaklarını açın ve fanları aynı anda fişe takın. Güç kaynaklarını ve mandreli kapatın, ardından fanların fişini dikkatlice çekin.

Lam örtülerini ve bandı bir jilet kullanarak çıkarın. Lifler, rümin ve dpi için filtrelere sahip bir floresan mikroskop altında görüntülenebilir. Elektro salkım polimeri yapışmış her bir lam örtüsünü altılı bir plağın ayrı kuyucuklarına yerleştirin.

Çok kuyucuklu plaka İskelelerin içindeki solvent ve kontaminantların tamamen temizlendiğinden emin olmak için iskeleleri iki mililitre PBS içinde gece boyunca inkübe edin. 24 saat sonra, vakum kullanarak PBS'yi kuyucuklu plakadan aspire edin; iskeleleri laminar akışlı bir kabin içerisinde, germisidal bir UV lambası altında 30 dakika boyunca bekletin. Sterilizasyon için standart hücre kültürü işlemlerini gerçekleştirin ve istenen hücre yoğunluğunda konsantre bir hücre süspansiyonu hazırlayın.

Örneğin, 22 by 22 milimetrelik bir lamel için 100 mililitre hücre süspansiyonu kullanın. Bir saat boyunca inkübatörde bekletin. Her birine uygun miktarda hücre kültürü medyumu ekleyin.

İskeleleri inkübatöre geri yerleştirin. Hücreleri ve fiberleri, trisy ve fitzy için filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobu altında görüntülemek için Invitrogen'den ticari olarak temin edilen bir canlı-ölü kiti kullanarak hücreleri boyayın; beklendiği üzere, düz bir plaka üzerine toplanan iskelelerde hücreler ve fiberler görüntülenir. Dönen bir mandrel üzerine toplanan iskelelerde ise rastgele dağılmış fiberler oluşur.

İskelelerin fotokrosetlemesi sırasında taramalı elektron mikroskobu ile incelendiğinde hizalanmış lifler elde etmek için, iskelenin deiyonize su ve reaktif olmayan ha içerisine daldırılmasının ardından iskele ile ışık kaynağı arasına bir fotomaske yerleştiriyoruz. Işıktan korunan bu alanlarda PEO uzaklaştırılır ve floresan boyadan anlaşıldığı üzere makrogözeneklerin oluşumu görülür. MEHA ve PEO jetlerinin eş zamanlı elektro eğirmesi, münferit polimerlerden oluşan belirgin lif popülasyonları içeren kompozit bir iskele ile sonuçlanır.

HMC'lerin fiberlerle pozitif etkileşime girdiği görülmektedir. Yeşil boyama ile kanıtlandığı üzere sadece canlı kalmakla kalmazlar, aynı zamanda kendilerini kırmızı fiberler boyunca hizalayacak şekilde yönlendirdikleri görülür. Size doku mühendisliği için fiber iskelelerin nasıl elektro eğirme yöntemiyle hazırlanacağını göstermiş olduk.

Ayrıca, foto-desenleme ve çoklu polimer elektro eğirme gibi ek yetenekler de tanıttık. Bu prosedürü uygularken, daha fazla deney denemeden önce homojen lifler oluşturmak için her bir polimerin elektro eğirme parametrelerini optimize etmeyi hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.