İzolasyon ve Arıtma Drosophila Periferik Nöronlar

DA nöronlarını izole etmek için nöron spesifik CD8 GFP füzyon reporter transgenine sahip Drosophila larvaları kullanılır. Larvalar, kütiküllerinin tersyüz edilerek periferik sinir sisteminin açığa çıkarılmasıyla diseke edilir. Tersyüz edilen larvalar, önce enzimatik dissosyasyona, ardından vorteksleme ve pipetleme yoluyla mekanik dissosyasyona tabi tutulur.

Ardından, öncelikle epitelial kas ve nöronlar içeren tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreler filtrelenir. Hücre süspansiyonuna, CD sekiz etiketli GFP füzyon proteinini eksprese eden nöronlara bağlanan antikor kaplı manyetik boncuklar eklenir. Son olarak, çözelti güçlü bir manyetik alana yerleştirilerek manyetik boncuk kaplı nöronlar izole edilir ve böylece yüksek saflıkta nöron popülasyonları elde edilir.

Merhaba, ben George Mason Üniversitesi'ndeki Krasno İleri Araştırmalar Enstitüsü Moleküler ve Mikrobiyoloji Bölümü'nden Dan Cox. Merhaba, ben Dr. Dan Cox'un laboratuvarından Ish AER. Bugün size manyetik boncuk ayıklama yöntemiyle DLO periferik nöronlarının izolasyonu ve saflaştırılması için bir prosedür göstereceğiz.

Sınıfa özgü ve sağ morfogenezi düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, yaşları uygun 30 ila 50 adet üçüncü evre larva seçin ve bunları 1 ile 1,2 mL 1X PBS içeren 1,6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.

Tüpün kapağını kapatın ve maksimum ayarda, her biri bir saniye sürecek şekilde üç kez vorteksleyin. Ağzı ateşle cilalanmış bir pipet kullanarak süpernatantı tamamen uzaklaştırın. Bir mililitre PBS ekleyin ve süpernatant, gıda partikülleri ile kalıntılardan görünür şekilde temizlenene kadar yıkama ve vorteksleme adımlarını üç kez tekrarlayın.

Yıkama işlemini bir mililitre %70 ethanol ile kısaca tekrarlayın. Ardından larvaları bir mililitre çift distile su ile iki kez yıkayın. Son olarak, RNase Away kalıntılarını tamamen uzaklaştırmak için yıkama işlemini bir mililitre RNase Away ile bir kez ve bir mililitre çift distile su ile üç kez daha tekrarlayın; larvalar artık disseksiyon için hazırdır.

Sill koruyuculu 35 milimetrelik bir Petri plağının merkezine 10 ila 12 larva yerleştirin. Larvaları birbirlerinden hafifçe uzak konumlarda tutun ve uygun gelişim aşamasında görünmeyen larvaları atın. Ardından, ince bir diseksiyon makası ve küt uçlu bir dumont kullanarak larvaların ön ucunu kesin.

Beş numara, penset. Larvaları tersyüz edin. Bir penseti larval kütikülün içine, posterior uca kadar yerleştirerek başlayın.

Kütikülün posterior ucunu kavramak için forsepslerin uçlarını birbirine bastırın. Kütikülü syl guard yüzeyine doğru bastırmak bu işlemi kolaylaştırır. İkinci bir forseps çifti kullanarak larval kütikülü tersyüz ederek dışarı itin.

Hücrelerin kolayca ayrışması için yumuşak dokuların tamamının çözeltiye maruz kalmasını sağlayacak şekilde larvaların tamamen ters çevrildiğinden emin olun. Hücre ayrıştırma işlemine geçmeden önce bu işlemi birkaç kez deneyin. Üç ila dört larvayı dissekt ettikten sonra, larvaları hemen bir mikrosantrifüj tüpü içindeki taze, buz gibi soğuk PBS'ye aktarın.

Spesifik olmayan hücreleri uzaklaştırma işlemine geçmeden önce, gerekli olan 30 ila 40 larva toplanana kadar işlemi tekrarlayın. Tüm larvalar diseke edildiği için, diseksiyon ve ilişkilendirme sırasında %10 ila %20 oranında kayıp beklenmelidir. Yağ cisimcikleri ve merkezi sinir sistemi hücreleri gibi gevşekçe yapışmış spesifik olmayan dokuları temizleyin.

Ters çevrilmiş larval kütikülleri içeren tüpteki supernatantı 700 ila 800 microliter taze buz gibi soğuk PBS ile değiştirerek işlemi gerçekleştirin. Son olarak, mikrosantrifüj tüpünü tam hızda, her bir vuruş üç saniye sürecek şekilde beş kez pulse vortexleyin.

Ardından süpernatantı atın ve yerine yaklaşık 700 ila 800 µL taze buz gibi soğuk PBS ekleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın ve son olarak larva kütiküllerini 400 µL taze buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.

Dendritik arborizasyonu veya da larval nöronları izole etmek amacıyla hücreleri disosiye etme aşamasına geçmeden önce soğuk PBS kullanın. Enzimatik ve mekanik disosiyasyonun bir kombinasyonunu uygulayın. Hücre yüzey markerlarının kaybına yol açarak düşük hücre verimi ve düşük hücre viyabilitesine neden olabilecek aşırı disosiyasyona karşı dikkatli olun.

400 µL PBS içinde süspande edilmiş larval kütiküllere, şişe başına 28 ünite içeren 1x liase zyme three'den 1,5 µL ekleyerek disosiyasyonu başlatın. Kütiküllere gevşekçe yapışmış hücreleri çözeltiye geçirmek için çözeltiyi maksimum ayarda, her biri bir saniye sürecek şekilde iki ila üç kez vorteksleyin.

Ardından çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi, nihai hücre ayıklama verimliliğini büyük ölçüde etkilediğinden, inkübasyon aşamasının sonunda 15 dakikayı geçmeyin.

Tüpü, her bir darbede iki saniye boyunca tam hızda 20 ila 30 kez vorteksleyin. Bu işlem, kasların ve diğer spesifik olmayan dokuların çözeltiye geçmesini sağlamalıdır. Periferik nöronların kütiküle hala bağlı olup olmadığını belirlemek için örneği periyodik olarak floresan destekli bir stereo mikroskop altında inceleyin.

Disosyasyon seviyesini belirlemek için, floresan özellikli bir stereo mikroskop altında mikro santrifüj tüpünü doğrudan gözlemleyerek solüsyondan küçük bir örnek inceleyin. Periferik nöronlar kütikülden ayrılarak solüsyona geçene kadar, disosyasyonun her adımında vortekslemeyi durdurarak bunu yapmaya devam edin. Larva kütiküllerini, her biri 1 mL taze buz soğukluğunda PBS kullanılarak iki ila üç kez kısa süreli yıkamadan geçirin.

Ve son olarak, resüsitasyon. Hücreleri %1 BSA içeren 500 µL taze buz gibi soğuk PBS içinde süspande edin. Hücrelerin mekanik disosiyasyonuna devam etmek için %1 BSA içeren PBS çözeltisiyle birlikte iki mililitrelik bir doku öğütücü ve geniş boşluklu havan eli kullanın. Kısa bir durulamadan sonra, BSA çözeltisini dökün.

Bu işlem, larva kütiküllerinin cam yüzeylere yapışmasını önleyecektir. Ardından, hücre hasarını veya lizisini önlemek için doku öğütücüyü ve havanı birkaç dakika buz üzerinde bekleterek ön soğutma yapın. Daha sonra kütikülleri doku öğütücüye aktarmak için ateşle cilalanmış bir pipet kullanın.

Şimdi, yaklaşık 20 ila 30 darbe boyunca, köpürmeyi önleyerek yavaş ve istikrarlı darbelerle dokuyu aşağı indirin. Yavaş ve istikrarlı bir şekilde indirdiğinizden emin olun. Aksi takdirde hücreler parçalanabilir.

Hücre ayrışma düzeylerini değerlendirmek için, doku öğütücünün duvarını temiz bir Kim wipe mendille silin ve floresan stereo mikroskop altında inceleyin. Nöronlar kütikülden ayrılmış olmalı ve çözeltinin içinde görülmelidir. Larva kütikülünde nöronların bulunmaması, hücre ayrışmasının başarılı olduğunun iyi bir göstergesidir.

Ancak, hala kütiküle yapışmış nöronlar gözlemleniyorsa veya tamamen ayrışmış hücrelerde çökelmeler görülüyorsa, hücreler tek hücre süspansiyonu haline gelene kadar işleme devam edin. Ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti kullanarak mekanik ayrıştırmaya devam edin. Çözeltiyi beş kez, ardından standart uç çapının yaklaşık %50'sine daraltılmış bir ateşle parlatılmış Pasteur pipeti ile 10 kez pipetleyin.

Standart uç çapının yaklaşık %25'ine kadar daraltın. Sert rotasyonun hücrelere zarar verebileceğini unutmayın. Adımlar arasında hücreleri izleyin ve prosedürü buna göre ayarlayın.

İşlemi, çözeltiyi 30 mikrometrelik bir hücre filtresinden süzerek tamamlayın ve hücre filtratını 1,6 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne toplayın. Elde edilen çözelti, tek hücre süspansiyonundan oluşmalıdır ve artık manyetik hücre ayırımı için hazırdır. Anti CD eight antikoru ile kaplanmış manyetik boncuklar.

Eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlandı ve DA nöronları, antikor tarafından hedeflenen bir CD8 GFP füzyon proteini eksprese etmektedir. 500 µL hücre süspansiyonuna 15 µL antikor kaplı manyetik boncuk ekleyerek hücre ayırma işlemine başlayın. Hücreleri antikor kaplı manyetik boncuklarla birlikte, ara ara elle karıştırarak 30 ila 60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin; daha yüksek sıcaklıkta veya daha uzun süreli inkübasyon, spesifik olmayan antikor bağlanmasına neden olabilir.

Ardından, mikro santrifüj tüpünü iki dakika boyunca güçlü bir manyetik alana yerleştirin. Pozitif olarak seçilen tüm hücreler, bağlanmamış boncuklarla birlikte tüpün kenarına yapışacaktır; hücre peletini rahatsız etmeden süpernatanı yavaşça aspire edin ve hücreleri taze, buz gibi soğuk PBS ile üç ila dört kez yıkayın. Bu adım, geriye kalan tüm spesifik olmayan hücreleri uzaklaştırır.

Son olarak, hücrelerin saflığını ve verimini tahmin etmek için hücreleri 30 µL taze buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonundan beş µL'yi bir hemositometrenin cilalanmış yüzeyine pipetleyin ve floresan stereo mikroskop altında tüm görünür floresan hücreleri sayın. Ayrıca, floresan olmayan hücrelerin miktarını ve herhangi bir safsızlık belirtisini kontrol edin.

Genellikle, numune floresan hücreler açısından yüksek derecede zenginleşmiş olacaktır. Son olarak, boncuklara bağlı hücrelerden RNA izole etmek için pico pure RNA izolasyon kiti kullanın. Ayıklanan hücrelere ekstraksiyon tamponu ekleyin, ancak kolon saflaştırma adımından önce boncukları bir mıknatıs yardımıyla uzaklaştırın; toplam RNA kalitesini Agilent Bioanalyzer 2100 ile değerlendirmek için ekstrakte edilen RNA'dan 1 µL kullanın.

İzole edilen DA nöronlarından saflaştırılan RNA, Agilent 2100 Bioanalyzer ile analiz edildiğinde belirgin 5.8 s ve 28 s ribozomal RNA piklerinin görülmesiyle belirtildiği üzere mükemmel kalitededir; star larvalarında 30 ila 43. günlerde başlayarak, PPK gal four sürücüsünü kullanarak ortalama 300 ila 500 sınıf dört DA nöronu ve sınıf 1, 2, 3 ve 4'ten toplam 1500 ila 2000 DA nöronu izole edebildik. Panda nöron spesifik bir gal four sürücüsü kullanılarak, nöronal spesifik markerlar olan L 11 fch ile yapılan kantitatif R-T-P-C-R, her ikisinde de anlamlı bir kat artışı ortaya koyarak, sunduğumuz protokolün flow-through yöntemine kıyasla DA nöronları için oldukça spesifik bir zenginleştirme sağladığını göstermiştir. Son olarak, hem panda nöronlarından hem de sınıf dört DA nöronlarından izole edilen RNA, Agilent Drosophila Melanogaster tüm genom oligo mikro dizileri üzerinde transkripsiyonel ekspresyon profillemesi yapmak için kullanılmış ve DA nöron morfojenezinde rol oynayan birçok faktör tanımlanmıştır.

Larval gelişimin üçüncü instar evresinden manyetik boncuk ayıklama yoluyla drosophila periferal nöronlarının nasıl izole edileceğini ve saflaştırılacağını gösterdik. Bu prosedürü uygularken, enzimatik ve mekanik disosiyasyon adımlarını dengelemek önemlidir. Aşırı enzimatik disosiyasyon, CD sekiz hücre yüzey belirteçlerinin degrade olmasına yol açarak hücre ayıklamanın yetersiz kalmasına veya başarısız olmasına neden olabilir.

İzole edilen nöronlardan saflaştırılan RNA'nın bütünlüğünü korumak için prosedür boyunca RNA'sız koşulların sürdürülmesi de önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.