Name: İzolasyon ve Arıtma Drosophila Periferik Nöronlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Öğrenin Drosophila periferik nöronlarını manyetik boncuk sıralama ile izole etme ve arıtma yöntemini. CD8-GFP füzyon proteini kullanılarak yüksek saflıkta nöron popülasyonları elde edilir ve RNA analizi için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr teşekkür ederim. Yuh-Nung Jan ve Wes Grueber Bu çalışmada kullanılan uçucu stokları sağlamak için. Yazarlar Thomas F. ve bu araştırma desteği için Kate Miller Jeffress Memorial Trust (DNC) ve George Mason Üniversitesi Provost Ofisi (EPRI) kabul etmiş sayılırsınız.

Drosophila Periferik Nöronlar Manyetik Boncuk Sıralama Genel Yorumlar (Protokol tamamlanması için toplam Zamanlama: 2.5-3 saat) Temiz, RNAse ortamda sürdürülmesi için standart laboratuvar prosedürleri RNA bozulmasını önlemek için her zaman dikkat edilmelidir. Drosophila larva manikür disseke ve hücre disosiasyon tampon yerleştirilir, periferik nöronlar manikür ayırmak için son hücreleri biri. Biz bu özelliği, sömürülen ve bu protokol da izole nöronların önce yağ, kas ve manikür non-spesifik hücrelerin en kaldırmak için tasarlanmış. Uygulama ile, yaklaşık 2,5 saat içinde tüm protokolü başarıyla tamamlanmış olabilir. Antikor kaplı boncuklar hazırlanması, deney başlamadan önce tamamlanması gerekir. 1. Cilt Hücreler Manyetik Boncuk Hazırlanması: Bu adım, deney başlamadan önce tamamlanması gerekir. Hazırlanan boncuk gerekli ° C kadar 4 hazırlanan ve saklanan olabilir. <ol><li> 500 ul taze PBS resuspending ve güçlü bir manyetik alan her zaman bu peletleme 100 ul Dynabeads M-280 Streptavidin kaplı boncuklar PBS içinde üç kez yıkayın. </li><li> Sonunda sulandırılmamış biotinlenmiş sıçan anti-fare-CD8a antikor (antikor konsantrasyonu 100 mg / ml) 100 ul doğrudan boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Sedimantasyon önlemek için zaman zaman hafif bir vorteks ile buz karışımı 1 saat inkübe edin. [Dynabeads M-280 1 ul 0,05-0,10 mg biotinlenmiş antikor bağlayabilirsiniz. </li><li> Boncuk-antikor karışımı fazla antikor kaldırmak için adım 1.1 &#39;de açıklanan üç kez yıkayın. Manyetik boncuk şimdi antikor ile kaplı ve kullanıma hazır. 4 1X PBS 100 ul boncuk-antikor karışımı Mağaza ° C kullanana kadar. </li></ol> 2. (10-15 dakika): Larva Seçme ve Yıkama <ol><li> Pick 30-50 yaşı uyumlu üçüncü instar larvaları ve 1X Fosfat 1-1,2 ml 1.6 ml mikrofuge&#39;de tüp koyun Tamponlu Salin (PBS). (3-5 dakika) </li><li> Her 1 saniye ve maksimum ayarda vorteks üç kez tüp kapatın. </li><li> Bir yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak süpernatantı tamamen atın. (2.1) yıkama ve süpernatant gözle görülür herhangi bir gıda parçacıkları ve enkaz netleşene kadar vorteks (2.2) 3-4 kez adımları tekrarlayın. </li><li> Kısaca, 1 ml% 70 etanol ile yıkayın tekrarlayın ve supernatant atın. </li><li> Larvaların 1 ml ddH2O ile iki kez yıkayın ve supernatant atın. </li><li> Kısaca RNaz-away 1 ml yıkama ile bir kez daha tekrarlayın ve supernatant atın. </li><li> DdH2O 1 ml larva RNaz-away tümüyle kaldırılmasını sağlamak için üç kez yıkayın. </li></ol> 3. Diseksiyon: (10-12 dakika) <ol><li> Sylgard kaplı 35mm Petri plaka merkezinde yerleştirin larvaları 10-12. Onları birbirinden biraz uzakta yerleştirin. [Kritik Adım: Herhangi bir larva atın uygun gelişimsel aşamada görünmüyor] </li><li> Tüm larvalar için bir çift ince diseksiyon makas kullanarak larvalarının ön ucu kesilerek açılır. </li><li> Donuk Dumont No: 5 forseps invert larvaları iç-dış bir çift kullanma. Larva manikür içinde arka sonuna kadar tüm yol, bir forsepsle yerleştirin. Kütikül (Şekil 1a) (Sylgard yüzeyi kütikül kolaylaştırmak için aşağı doğru bastırarak deneyin) arka sonuna kapmak için forseps ipuçlarını bir araya Pinch. Forseps ikinci çifti kullanarak, larva manikür içeriden dışarı doğru itin. [Kritik Adım: hücre izolasyonu deney başlamadan önce bu yöntemi bir kaç kez pratik deneyin. Tüm yumuşak dokular için çözüm kolay disosiasyon maruz kaldığı sağlamak için tamamen ters larva elde etmeye çalışın.] </li><li> 3-4 larva diseksiyon sonra taze, buz gibi soğuk PBS (buz tüpü), 1.6 ml mikrofuge&#39;de tüp hemen aktarabilirsiniz. </li><li> Gerekli tüm larvaları toplanana kadar (bu protokolde 30-40 larvaları), 3.1 ve 3.4 için gerekli adımları tekrarlayın. [Kritik Adım:% 10-20 diseksiyon ve çözülmesi sırasında kaybı ve planı buna göre önceden kestirin.] </li></ol> 4. Gevşek yapışık non-spesifik hücreler Temizleme: (2-3 dakika) [Bu adım gibi yağ organları ve merkezi sinir sistemi gibi gevşek yapışık non-spesifik dokuların temizleyerek yardımcı olur.] <ol><li> Ters larva tırnak etlerini içeren 1.6 ml mikrofuge&#39;de tüpü alın ve taze buz PBS yaklaşık 700-800 ul süpernatantı değiştirin. </li><li> Pulse-girdap mikrofuge&#39;de tüp tam hızda 5 kez (puls başına 3 saniye). </li><li> Süpernatantı atın ve yaklaşık 700-800 ul taze, buz gibi soğuk PBS ile değiştirin. </li><li> Adımları 4.2 ve 4.3 &#39;üç kez tekrarlayın. </li><li> Restaze, buz gibi soğuk PBS 400 ul larva tırnak etlerini uspend </li></ol> 5. Tek bir hücre süspansiyonu doku Dissociating: (18-20 dakika) [Kritik Adım: Aşırı disosiasyon kötü hücre verim ve düşük hücre canlılığı yol açan hücre yüzey belirteci kaybına neden olabilir. Larva doku ya mekanik disosiasyon (sonikasyon douncing), enzimatik disosiasyon (tripsin, kollajenaz, vb.) Ya da her ikisinin kombinasyonu ile ayrılamaz. Bu larva dokuları ayırmak zor olduğu için, hem mekanik hem de enzimatik disosiasyon bir kombinasyonu en iyi sonuçları vermiştir bulundu.] <ol><li> PBS 400 ul askıya larva manikür 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch ünite / flakon) 1.5 ul ekleyin. </li><li> Maksimum ayarı (Bu çözüm manikür gevşek yapışık hücrelere kaldırmanız gerekir), her 1 saniye vorteksleyin çözüm 2-3 kez. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (22-25 ° C) çözüm inkübe edin. [Kritik Adım: İnkübasyon süresi son hücre sıralama verimliliği büyük ölçüde etkiler . Önerilen inkübasyon süresi doku gevşetme için yeterli olmalıdır. 15 dakika aşmayın.] </li><li> Pulse-vorteks tüp 20-30 kez tam hızda puls başına 2 saniye için maksimum ayarları. Bu çözüm içine kas ve diğer doku bültenleri. Küçük bir örnek, her adımda bir floresan stereo-mikroskop altında çözüm olmadığını kontrol edin. (Tecrübesi ile, bir mikrofuge&#39;de tüp floresan etkin bir stereo mikroskop altında doğrudan gözlemleyerek ayrışma düzeyini belirlemek mümkün olmalıdır) </li><li> Taze, buz gibi soğuk PBS ile larva, tırnak etlerini 2-3 kez yıkayın ve nihayet taze, buz gibi soğuk PBS içeren% 1 BSA 500 ul onları tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Larva manikür, 2 ml Kontes doku değirmeni ve büyük mesafe havaneli, ön kat doku değirmeni ve PBS solüsyonunda% 1 BSA BSA çözüm atmak durulama kısa bir sonra havaneli cam yüzeyine yapışmasını önlemek için. Daha sonra, bir yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, BSA ile kaplanmış doku değirmeni adım 5.5 &#39;ten tırnak etlerini aktarmak. [Kritik Adım: Pre-cool, hücre hasarı / lizis önlemek için birkaç dakika buz koyarak doku taşlama / havaneli] . </li><li> Köpüklenmemesine (yaklaşık 20-30 vuruş) kaçınarak, yavaş ve istikrarlı bir vuruş ile doku Dounce. [Kritik Adım: Dounce, yavaş yavaş ve sürekli aksi takdirde olmuş akyuvarlar] </li><li> Hücre disosiasyon düzeylerini değerlendirmek için, temiz bir Kimwipe doku doku değirmeni dış duvar silin ve floresan stereo-mikroskop altında inceleyin. Nöronlar manikür müstakil olması gerekir ve çözüm görülebilir. Bu zor olduğu tespit edilirse, alternatif çözüm küçük bir örnek pipet, ve floresan stereo-mikroskop altında gözlemlemek. Hücre disosiasyon iyi bir göstergesi larva manikür nöronların yokluğunda. Biri hala manikür bağlı nöron gözlemler ya da eksik ayrışmış hücreleri gözlemler hücreleri tek bir hücre süspansiyonu elde kadar Ancak, daha Dounce. </li><li> 5 kez yangın cilalı Pasteur pipeti ile çözüm Karışım bir yangın cilalanmış Pasteur pipeti ile 10 kez standart ucu çapı yaklaşık% 25 daralmış, standart ucu çapı yaklaşık% 50 daralmış. [Kritik Adım: Forceful öğütme hücrelere zarar verebilir. Adımlar arasındaki hücreleri Monitör, prosedür ve buna göre ayarlamak]. </li><li> 30 mikron hücre filtresi aracılığıyla çözüm Filtre ve 1.6 ml mikrofuge&#39;de tüp hücre süzüntü toplamak. Ortaya çıkan çözüm, tek bir hücre süspansiyonu oluşur ve manyetik hücre sıralama için hazır olmalıdır. </li></ol> 6. Boncuk Manyetik Hücre Sıralama: (45 - 75 dakika, antikor kuluçka süresi bağımlı) <ol><li> Antikor kaplı manyetik bilye 15 ul ul hücre süspansiyonu 500 (adım 5.10) ekleyin. Kalan antikor konjuge manyetik boncuk sonraki hücre izolasyonların için gerekli kadar saklanabilir. </li><li> 30-60 dakika buz üzerinde zaman zaman el-karıştırma hücrelerin antikor kaplı manyetik bilye ile inkübe edin. [Kritik Adım: Kuluçka daha yüksek bir sıcaklık veya daha uzun süre non-spesifik antikor bağlanma neden olabilir.] </li><li> 2 dakika boyunca güçlü bir manyetik alan mikrofuge&#39;de tüp yerleştirin. Bağlanmamış boncuklar ile birlikte tüm olumlu seçili hücrelerin tüp tarafında ayrı olacaktır. </li><li> Yavaş yavaş, hücre pelletini rahatsız değil emin olun, süpernatantı pipetle. </li><li> Taze, buz gibi soğuk PBS hücrelerin kalan non-spesifik hücreleri çıkarmak için 3-4 kez yıkayın. </li><li> Taze, buz gibi soğuk PBS 30 ul hücrelerin yeniden süspanse edin. </li><li> Yaklaşık saflık ve hücre verim için, hücre süspansiyon 5 ul pipetcilalı yüzey üzerinde bir hemasitometre ension ve floresan stereo-mikroskop altında görünür floresan hücreleri saymak. Ayrıca floresan olmayan hücreleri ve kirleri herhangi bir işaret miktarını kontrol. Tipik bir örnek son derece floresan hücreler için zenginleştirilmiş olacaktır. </li></ol> 7. Manyetik Boncuk sıralama Hücreler RNA İzolasyonu: (60 - 75 dakika) <ol><li> Sonra, bir manyetik alan, pelet hücreleri sayma süpernatantı atmak ve ekstraksiyon tamponu 20 ul PicoPure ™ RNA İzolasyon Kiti (Moleküler Cihazlar) ekleyin. Hücre sayısı bağlı olarak bir ekstraksiyon tamponu daha yüksek bir hacim eklemek gerekebilir. </li><li> Vorteks tüp maksimum hızda ekstraksiyon tamponu ile hücre pelletini karıştırma sağlamak için. </li><li> Tüp 42 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> RNA sütun arıtma (bkz: adım 7.5) önce manyetik boncuk kaldırılmasını sağlamak için, tüp kısaca pelet için 2 dakika manyetik boncuklar için 2.000 (x) g santrifüj edilir. Sonra pelet korumak için güçlü bir manyetik alan tüp yerleştirilir ve süpernatant, yeni bir mikrofuge&#39;de tüpe aktarılır. </li><li> Özü ve sütun PicoPure RNA ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre RNA arındırmak. DNAz tedavi isteğe bağlıdır ve analiz ihtiyacına göre RNA saflaştırılması sırasında sütun üzerinde yapılabilir. Son olarak, kullanıma hazır olana kadar küçük bir hacim -80 elüsyon tampon ve mağaza ° C (11-30 ul) bağlı toplam RNA elute. İsterseniz 1 ul kısım bir Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.) Total RNA kalitesini değerlendirmek için kullanılan olabilir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Manyetik boncuk sıralama Drosophila da nöronların (Şekil 1) izole etmek için kullanılır oldu. Bu da izole nöronların (Şekil 2a) arınmış RNA bir Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Analiz edildiğinde keskin 5.8S, 18S ve 28S ribozomal RNA doruklarına varlığını gösterdiği gibi mükemmel kalitede olduğu tespit edilmiştir ( Şekil 2b). 30-40 üçüncü instar larvaları ile başlayarak kullanarak ortalama PPK GAL4 sürücüsünü kullanarak 300-500 sınıf IV da nöron ve 1500-2000 da nöronların (Sınıf I, II, III ve IV) izole yeteneğine sahip pan - da nöron spesifik GAL4 21-7 sürücü. Izole hücrelerinin nöronal özel zenginleştirme değerlendirmek için iki nöronal gen-spesifik belirteçler (elav ve futsch) kullanarak kantitatif ters transkripsiyon PCR (QRT PCR) uyguladık. Bu analizler protokolü (Şekil 3) kullanılarak akış ile karşılaştırıldığında da nöronlar için son derece özel bir zenginleştirme gösteren işaretleyici genler hem de önemli bir kat zenginleşme ortaya çıkardı. Son olarak, pan-da nöron ve sınıf IV da nöronların izole RNA transkripsiyonel ifade profil Agilent Drosophila melanogaster tüm genom oligo mikroarray&#39;ler (4 x 44K) (Şekil 4) gerçekleştirmek için kullanılır oldu. Bu analizleri önceden uncharacterized molekülleri ve potansiyel olarak da nöron gelişiminde önemli işlevsel roller oynar varsayılan sinyal iletim yolları geniş bir yelpazenin yanı sıra çok sayıda da nöron dendrit morfolojilerinden önceden karıştığı düzenleyiciler belirledi. Daha önce uncharacterized bu moleküllerin potansiyel rolü (lar) da nöron gelişimi ve özellikle dendrit morfolojilerinden arabuluculuk değerlendirmek için tasarlanmış çalışmalar, halen devam etmektedir. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Şekil 1: da nöron spesifik GAL4 taşıyan Drosophila da nöronların manyetik boncuk sıralama şematik (a) Yaş uyumlu üçüncü instar larvaları, UAS-mCD8-GFP muhabiri transgen tersine larva manikür, iç-dış açığa çıkarmak için disseke disosiasyon tampon PNS ve buz gibi soğuk PBS içinde saklanır. (b) Enzimatik ayrılma larva manikür içeren çözüm Liberase Blendzyme 3 ekleyerek gerçekleştirilir (c) larva dokular vorteks, öğütme bir kombinasyonu ile daha ayrışmış ve douncing gibi yağ organları, bağırsak ve MSS (d, e) hücreler daha sonra 30 mikron hücre filtresi süzülür non-spesifik etiketli dokuların kaldırmak için. Çözüm epitel, kas ve nöronlar da dahil olmak üzere farklı hücre tipleri, tek bir hücre süspansiyonu içerir. (F) Anti-fare CD8a-antikor kaplı Dynabeads M-280 hücre süspansiyonu eklenir ve 30-60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. ( g) Manyetik boncuklar da nöronların bir fare CD8 tagged GFP füzyon proteini (h, i) güçlü bir manyetik alan çözüm koyarak manyetik boncuk kaplı hücreler ayrılır ifade bağlanır. Süpernatant atılır ve hücreleri (j) h, herhangi bir kalıntı non-spesifik hücreleri çıkarmak için üç defa yıkanır.ighly da nöron toplulukları saflaştırılmış. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Şekil 2: (a) olumlu seçilen hücre disosiasyon ve manyetik boncuk sıralama ile izole GFP floresan sınıf IV da nöronların Temsilcisi görüntü. Nöronların çıkan nüfusu oldukça az ya da hiç kirlenmesine neden olan hücre kirleri sınıf IV da nöronlar için zenginleştirilmiş olarak tespit edilmiştir. (B) manyetik boncuk sıralaması da nöronların izole edilen total RNA bir Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Elektroferogram 5.8S, 18S, ve 28S rRNA varlığı ile mükemmel bir total RNA kalitesini gösteriyor. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Şekil 3: izole da nöronların (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) ve akış yoluyla fraksiyonu üç nüsha olarak yapıldı nöronal belirteç gen ekspresyonu QRT-PCR analizi. Iki nöron-spesifik bir işaretleyici genler (elav ve futsch) ekspresyon düzeyleri QRT-PCR ile değerlendirildi. Bu analizlerden elde edilen değerler endojen kontrol (rp49) normalize edildi ve fraksiyonu akış gözlenen göreli seviyeleri ΔΔCτ yöntemi 6 kullanılarak hesaplandı. Hem elav ve futsch fraksiyonu yoluyla akışı ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde izole da nöron nüfus zenginleştirildi. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Şekil 4: mikroarray etiketli görüntü dosyası Temsilcisi sınıf IV da nöron spesifik Cy3. Burada gösterilen manyetik boncuk sıralayarak arındırılmış sınıf-IV da nöronların izole Cy3-labeld toplam RNA ile melezleşmiştir bir Agilent Drosophila melanogaster tüm genom oligo mikroarray (4 x 44K). Lütfen Şekil 4 büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

Burada sunulan protokol, bir manyetik boncuk hücre sıralama stratejisi kullanarak Drosophila üçüncü instar larva manikür iç yüzeyine sıkıca yapışır periferik nöronların izolasyon ve saflaştırılması için optimize edilmiştir. Bu protokolün Drosophila da nöronların, uygulamalar, özellikle larva veya pupa aşamalarında gelişme manikür bağlı diğer hücre türleri izolasyon izole etmek için bu protokolü kullanılır olsa da (örneğin epitel, kas, diğer çevre nöronlar) tarafından adapte edilebilir hücre tipi ya da ilgi türleri e...

Ekipman <ul><li> (10) alternatif ™ -2 DynaMag Neodimyum blok mıknatıslar (K &amp; J Manyetik, Inc, Kedi # B444B), (Invitrogen, Kedi # 123-21D) kullanılıyor olabilir. </li><li> Kontes büyük bir boşluk havaneli Cam Doku Öğütücü, 2 ml çalışma kapasitesi, (Kat. # 885.300-0002) </li><li> Hücre filtreler, örneğin MACS Ön-Ayırma Filtre (Miltenyi Biotec, Kedi # 130-041-407) </li><li> 35 mm petri-yemekleri Sylgard (Dow Corning Corporation, Kedi # 3.097.358-1004) ile kaplı </li><li> Diseksiyon araçları: Dumont No 5 forseps iki çift (Güzel Bilim Araçlar, Kedi # 11.251-20.) </li><li> Vannas bahar mikro diseksiyon makas (Güzel Bilimi Araçları, Kedi # 15.000-08) </li><li> Tek ipuçları Pipetler (P-1000, P-100, P-10) </li><li> Standart hemasitometre hücreleri saymak ve tahmini saflık </li><li> Standart çap yangın parlak ipuçları Pasteur pipetler, standart çap ~% 50 daralmış ve öğütme için standart çap ~% 25 daraldı </li><li> Masa üstü mikro santrifüj (1-16,000 (x) g) </li><li> Girdap </li><li> Floresan stereo-mikroskop (Leica MZ16FA bu protokolü kullanılmıştır) </li></ul>

İzolasyon ve arıtma drosophila</emmanyetik boncuk sıralama> periferik nöronlar

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

<em&gt; Drosophila</em&gt; Periferik sinir sistemi (PNS), fonksiyonel ve moleküler düzeyde nöronal gelişim ve dendrit morfolojilerinden karmaşık süreçleri araştırmak için güçlü bir model. Bu analizlerde yardımcı olmak için, dendritik arborization (da) dendrit morfolojilerinden çalışmak için yaygın olarak kullanılan nöron adı verilen bir alt sınıfıdır PNS nöronların izolasyonu için bir strateji geliştirmiştir<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Bu nöronlar sert chitinous larva manikür altında konuma ulaşmak için çok zor saf bir nüfus olarak izole etmek için son derece düşük bir olay nedeniyle zor ve. Yeni geliştirilen yöntem, bu zorlukları aşar ve antikor kaplı manyetik boncuklar kullanarak hızlı ve belirli bir hücre zenginleştirme dayanmaktadır. Manyetik boncuk sıralama çalışmaları için, bir fare CD8 etiketli GFP füzyon proteini (ifade yaş eşleştirilmiş üçüncü instar larvaları kullanmış<em&gt; UAS-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sınıfı IV dendritik arborization ya kontrol altında nöron spesifik (da)<em&gt; Pickpocket (PPK)-GAL4</em&gt; Driver<sup&gt; 4</sup&gt; Ya da pan-da nöron-spesifik GAL4 kontrolü<sup&gt; 21-7</sup&gt; Driver<sup&gt; 5</sup&gt;. Bu protokol, birkaç parametre değişen, larva manikür iç duvara bağlı PNS hücreleri izole etmek için optimize edilmiş olsa da, aynı protokolü larva veya pupa aşamasında manikür bağlı birçok farklı hücre türleri izole etmek için kullanılır. geliştirme (örneğin epitel, kas, oenocytes vb), veya GAL4 özel sürücü ifade desen bağlı olarak larva organların diğer hücre türleri. Bu yöntem ile izole RNA yüksek kalitede ve kolayca mikroarray gen ekspresyon profili çalışmaları gibi downstream genomik analizler için kullanılabilir. Bu yaklaşım, izole çalışmaları gerçekleştirmek için yeni ve güçlü bir araç sunar<em&gt; Drosophila</emBöylece dendrit morfolojilerinden altında yatan moleküler mekanizmaları, yeni bakış açıları sunan dendritik arborization (da) nöronlar.

Bu video makalede, izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem mevcut<em&gt; Drosophila</em&gt; Hızlı bir manyetik boncuk destekli hücre sıralama stratejisi kullanarak periferik nöronlar. Izole hücrelerinden elde edilen RNA kolayca mikroarray analizleri de dahil olmak üzere alt uygulamalar için kullanılabilir.

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

Drosophila periferal sinir sistemi (PSS), nöronal gelişim ve dendritlerin karmaşık süreçlerini incelemek için güçlü bir modeldir...

DA nöronlarını izole etmek için nöron spesifik CD8 GFP füzyon reporter transgenine sahip Drosophila larvaları kullanılır. Larvalar, kütiküllerinin tersyüz edilerek periferik sinir sisteminin açığa çıkarılmasıyla diseke edilir. Tersyüz edilen larvalar, önce enzimatik dissosyasyona, ardından vorteksleme ve pipetleme yoluyla mekanik dissosyasyona tabi tutulur.Ardından, öncelikle epitelial kas ve nöronlar içeren tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreler filtrelenir. Hücre süspansiyonuna, CD sekiz etiketli GFP füzyon proteinini eksprese eden nöronlara bağlanan antikor kaplı manyetik boncuklar eklenir. Son olarak, çözelti güçlü bir manyetik alana yerleştirilerek manyetik boncuk kaplı nöronlar izole edilir ve böylece yüksek saflıkta nöron popülasyonları elde edilir.Merhaba, ben George Mason Üniversitesi'ndeki Krasno İleri Araştırmalar Enstitüsü Moleküler ve Mikrobiyoloji Bölümü'nden Dan Cox. Merhaba, ben Dr. Dan Cox'un laboratuvarından Ish AER. Bugün size manyetik boncuk ayıklama yöntemiyle DLO periferik nöronlarının izolasyonu ve saflaştırılması için bir prosedür göstereceğiz.Sınıfa özgü ve sağ morfogenezi düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, yaşları uygun 30 ila 50 adet üçüncü evre larva seçin ve bunları 1 ile 1,2 mL 1X PBS içeren 1,6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.Tüpün kapağını kapatın ve maksimum ayarda, her biri bir saniye sürecek şekilde üç kez vorteksleyin. Ağzı ateşle cilalanmış bir pipet kullanarak süpernatantı tamamen uzaklaştırın. Bir mililitre PBS ekleyin ve süpernatant, gıda partikülleri ile kalıntılardan görünür şekilde temizlenene kadar yıkama ve vorteksleme adımlarını üç kez tekrarlayın.Yıkama işlemini bir mililitre %70 ethanol ile kısaca tekrarlayın. Ardından larvaları bir mililitre çift distile su ile iki kez yıkayın. Son olarak, RNase Away kalıntılarını tamamen uzaklaştırmak için yıkama işlemini bir mililitre RNase Away ile bir kez ve bir mililitre çift distile su ile üç kez daha tekrarlayın; larvalar artık disseksiyon için hazırdır.Sill koruyuculu 35 milimetrelik bir Petri plağının merkezine 10 ila 12 larva yerleştirin. Larvaları birbirlerinden hafifçe uzak konumlarda tutun ve uygun gelişim aşamasında görünmeyen larvaları atın. Ardından, ince bir diseksiyon makası ve küt uçlu bir dumont kullanarak larvaların ön ucunu kesin.Beş numara, penset. Larvaları tersyüz edin. Bir penseti larval kütikülün içine, posterior uca kadar yerleştirerek başlayın.Kütikülün posterior ucunu kavramak için forsepslerin uçlarını birbirine bastırın. Kütikülü syl guard yüzeyine doğru bastırmak bu işlemi kolaylaştırır. İkinci bir forseps çifti kullanarak larval kütikülü tersyüz ederek dışarı itin.Hücrelerin kolayca ayrışması için yumuşak dokuların tamamının çözeltiye maruz kalmasını sağlayacak şekilde larvaların tamamen ters çevrildiğinden emin olun. Hücre ayrıştırma işlemine geçmeden önce bu işlemi birkaç kez deneyin. Üç ila dört larvayı dissekt ettikten sonra, larvaları hemen bir mikrosantrifüj tüpü içindeki taze, buz gibi soğuk PBS'ye aktarın.Spesifik olmayan hücreleri uzaklaştırma işlemine geçmeden önce, gerekli olan 30 ila 40 larva toplanana kadar işlemi tekrarlayın. Tüm larvalar diseke edildiği için, diseksiyon ve ilişkilendirme sırasında %10 ila %20 oranında kayıp beklenmelidir. Yağ cisimcikleri ve merkezi sinir sistemi hücreleri gibi gevşekçe yapışmış spesifik olmayan dokuları temizleyin.Ters çevrilmiş larval kütikülleri içeren tüpteki supernatantı 700 ila 800 microliter taze buz gibi soğuk PBS ile değiştirerek işlemi gerçekleştirin. Son olarak, mikrosantrifüj tüpünü tam hızda, her bir vuruş üç saniye sürecek şekilde beş kez pulse vortexleyin.Ardından süpernatantı atın ve yerine yaklaşık 700 ila 800 µL taze buz gibi soğuk PBS ekleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın ve son olarak larva kütiküllerini 400 µL taze buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.Dendritik arborizasyonu veya da larval nöronları izole etmek amacıyla hücreleri disosiye etme aşamasına geçmeden önce soğuk PBS kullanın. Enzimatik ve mekanik disosiyasyonun bir kombinasyonunu uygulayın. Hücre yüzey markerlarının kaybına yol açarak düşük hücre verimi ve düşük hücre viyabilitesine neden olabilecek aşırı disosiyasyona karşı dikkatli olun.400 µL PBS içinde süspande edilmiş larval kütiküllere, şişe başına 28 ünite içeren 1x liase zyme three'den 1,5 µL ekleyerek disosiyasyonu başlatın. Kütiküllere gevşekçe yapışmış hücreleri çözeltiye geçirmek için çözeltiyi maksimum ayarda, her biri bir saniye sürecek şekilde iki ila üç kez vorteksleyin.Ardından çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi, nihai hücre ayıklama verimliliğini büyük ölçüde etkilediğinden, inkübasyon aşamasının sonunda 15 dakikayı geçmeyin.Tüpü, her bir darbede iki saniye boyunca tam hızda 20 ila 30 kez vorteksleyin. Bu işlem, kasların ve diğer spesifik olmayan dokuların çözeltiye geçmesini sağlamalıdır. Periferik nöronların kütiküle hala bağlı olup olmadığını belirlemek için örneği periyodik olarak floresan destekli bir stereo mikroskop altında inceleyin.Disosyasyon seviyesini belirlemek için, floresan özellikli bir stereo mikroskop altında mikro santrifüj tüpünü doğrudan gözlemleyerek solüsyondan küçük bir örnek inceleyin. Periferik nöronlar kütikülden ayrılarak solüsyona geçene kadar, disosyasyonun her adımında vortekslemeyi durdurarak bunu yapmaya devam edin. Larva kütiküllerini, her biri 1 mL taze buz soğukluğunda PBS kullanılarak iki ila üç kez kısa süreli yıkamadan geçirin.Ve son olarak, resüsitasyon. Hücreleri %1 BSA içeren 500 µL taze buz gibi soğuk PBS içinde süspande edin. Hücrelerin mekanik disosiyasyonuna devam etmek için %1 BSA içeren PBS çözeltisiyle birlikte iki mililitrelik bir doku öğütücü ve geniş boşluklu havan eli kullanın. Kısa bir durulamadan sonra, BSA çözeltisini dökün.Bu işlem, larva kütiküllerinin cam yüzeylere yapışmasını önleyecektir. Ardından, hücre hasarını veya lizisini önlemek için doku öğütücüyü ve havanı birkaç dakika buz üzerinde bekleterek ön soğutma yapın. Daha sonra kütikülleri doku öğütücüye aktarmak için ateşle cilalanmış bir pipet kullanın.Şimdi, yaklaşık 20 ila 30 darbe boyunca, köpürmeyi önleyerek yavaş ve istikrarlı darbelerle dokuyu aşağı indirin. Yavaş ve istikrarlı bir şekilde indirdiğinizden emin olun. Aksi takdirde hücreler parçalanabilir.Hücre ayrışma düzeylerini değerlendirmek için, doku öğütücünün duvarını temiz bir Kim wipe mendille silin ve floresan stereo mikroskop altında inceleyin. Nöronlar kütikülden ayrılmış olmalı ve çözeltinin içinde görülmelidir. Larva kütikülünde nöronların bulunmaması, hücre ayrışmasının başarılı olduğunun iyi bir göstergesidir.Ancak, hala kütiküle yapışmış nöronlar gözlemleniyorsa veya tamamen ayrışmış hücrelerde çökelmeler görülüyorsa, hücreler tek hücre süspansiyonu haline gelene kadar işleme devam edin. Ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti kullanarak mekanik ayrıştırmaya devam edin. Çözeltiyi beş kez, ardından standart uç çapının yaklaşık %50'sine daraltılmış bir ateşle parlatılmış Pasteur pipeti ile 10 kez pipetleyin.Standart uç çapının yaklaşık %25'ine kadar daraltın. Sert rotasyonun hücrelere zarar verebileceğini unutmayın. Adımlar arasında hücreleri izleyin ve prosedürü buna göre ayarlayın.İşlemi, çözeltiyi 30 mikrometrelik bir hücre filtresinden süzerek tamamlayın ve hücre filtratını 1,6 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne toplayın. Elde edilen çözelti, tek hücre süspansiyonundan oluşmalıdır ve artık manyetik hücre ayırımı için hazırdır. Anti CD eight antikoru ile kaplanmış manyetik boncuklar.Eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlandı ve DA nöronları, antikor tarafından hedeflenen bir CD8 GFP füzyon proteini eksprese etmektedir. 500 µL hücre süspansiyonuna 15 µL antikor kaplı manyetik boncuk ekleyerek hücre ayırma işlemine başlayın. Hücreleri antikor kaplı manyetik boncuklarla birlikte, ara ara elle karıştırarak 30 ila 60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin; daha yüksek sıcaklıkta veya daha uzun süreli inkübasyon, spesifik olmayan antikor bağlanmasına neden olabilir.Ardından, mikro santrifüj tüpünü iki dakika boyunca güçlü bir manyetik alana yerleştirin. Pozitif olarak seçilen tüm hücreler, bağlanmamış boncuklarla birlikte tüpün kenarına yapışacaktır; hücre peletini rahatsız etmeden süpernatanı yavaşça aspire edin ve hücreleri taze, buz gibi soğuk PBS ile üç ila dört kez yıkayın. Bu adım, geriye kalan tüm spesifik olmayan hücreleri uzaklaştırır.Son olarak, hücrelerin saflığını ve verimini tahmin etmek için hücreleri 30 µL taze buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonundan beş µL'yi bir hemositometrenin cilalanmış yüzeyine pipetleyin ve floresan stereo mikroskop altında tüm görünür floresan hücreleri sayın. Ayrıca, floresan olmayan hücrelerin miktarını ve herhangi bir safsızlık belirtisini kontrol edin.Genellikle, numune floresan hücreler açısından yüksek derecede zenginleşmiş olacaktır. Son olarak, boncuklara bağlı hücrelerden RNA izole etmek için pico pure RNA izolasyon kiti kullanın. Ayıklanan hücrelere ekstraksiyon tamponu ekleyin, ancak kolon saflaştırma adımından önce boncukları bir mıknatıs yardımıyla uzaklaştırın; toplam RNA kalitesini Agilent Bioanalyzer 2100 ile değerlendirmek için ekstrakte edilen RNA'dan 1 µL kullanın.İzole edilen DA nöronlarından saflaştırılan RNA, Agilent 2100 Bioanalyzer ile analiz edildiğinde belirgin 5.8 s ve 28 s ribozomal RNA piklerinin görülmesiyle belirtildiği üzere mükemmel kalitededir; star larvalarında 30 ila 43. günlerde başlayarak, PPK gal four sürücüsünü kullanarak ortalama 300 ila 500 sınıf dört DA nöronu ve sınıf 1, 2, 3 ve 4'ten toplam 1500 ila 2000 DA nöronu izole edebildik. Panda nöron spesifik bir gal four sürücüsü kullanılarak, nöronal spesifik markerlar olan L 11 fch ile yapılan kantitatif R-T-P-C-R, her ikisinde de anlamlı bir kat artışı ortaya koyarak, sunduğumuz protokolün flow-through yöntemine kıyasla DA nöronları için oldukça spesifik bir zenginleştirme sağladığını göstermiştir. Son olarak, hem panda nöronlarından hem de sınıf dört DA nöronlarından izole edilen RNA, Agilent Drosophila Melanogaster tüm genom oligo mikro dizileri üzerinde transkripsiyonel ekspresyon profillemesi yapmak için kullanılmış ve DA nöron morfojenezinde rol oynayan birçok faktör tanımlanmıştır.Larval gelişimin üçüncü instar evresinden manyetik boncuk ayıklama yoluyla drosophila periferal nöronlarının nasıl izole edileceğini ve saflaştırılacağını gösterdik. Bu prosedürü uygularken, enzimatik ve mekanik disosiyasyon adımlarını dengelemek önemlidir. Aşırı enzimatik disosiyasyon, CD sekiz hücre yüzey belirteçlerinin degrade olmasına yol açarak hücre ayıklamanın yetersiz kalmasına veya başarısız olmasına neden olabilir.İzole edilen nöronlardan saflaştırılan RNA'nın bütünlüğünü korumak için prosedür boyunca RNA'sız koşulların sürdürülmesi de önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

isolation-purification-drosophila-peripheral-neurons-magnetic-bead

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video makalede izole etmek için bir yöntem mevcut tek veya birden...

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

Bu aktif tam uzunlukta kinesin izole bir...

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Bu video, manyetik ayırma kullanılarak bir fare yavrusundan elde edilen bir nöral hücre süspansiyonundan birincil oligodendrosit hücrelerini izole etmek için bir yöntemi göstermektedir. Teknik, oligodendrosit antijenlerine özgü antikorlarla kaplanmış manyetik boncuklar kullanır ve bu hücrelerin seçici izolasyonunu sağlar.

Murin Primer Oligodendrositlerinin İmmünomanyetik Boncuklar Kullanılarak İzole Edilmesi

Bu video, manyetik hücre sıralama kullanarak fare beyinlerindeki demiyelinizan lezyonlardan mikroglial hücrelerin çıkarılması için bir protokolü göstermektedir. Protokol, mikroglial hücreler içeren lezyonlu beyin dokusunun diseksiyonunu, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için dokunun spesifik enzimlerle tedavi edilmesini ve mikroglial hücreleri izole etmek için mikroglial reseptöre özgü manyetik boncukların kullanılmasını içerir.

Manyetik Aktif Hücre Sıralaması Kullanılarak Fare Beyni Demiyelinizan Lezyonlarından Mikroglia'nın İzole Edilmesi

Drosophila dokusu sık sık hücre tipleri heterojen bir karışım içerir. Belirli bir doku, spesifik hücre tiplerinde gen ekspresyonunu incelemek için, çekirdekler, genetik olarak etiketlendi ve daha sonra bir afinite dayalı bir yaklaşım kullanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdek bu gen ekspresyon analizi ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için kullanılabilir.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Ribozom Afinite Saflaştırması (TRAP) çevirisi, mRNA'nın hücre tipine özgü translasyonunu yakalayabilir. Burada, Drosophila embriyolarının nadir hücre popülasyonlarında mRNA'nın izolasyonuna adanmış ilk TRAP protokolünü rapor ediyoruz.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Organa özgü duyusal nöronların tanımlanması zordur. Hızlı Mavi izleme, hücre sıralaması için hava yollarını innerve eden nodoz nöronlarını tanımlamak için kullanılır. Sıralanmış nodoz nöronları, dizileme için yüksek kaliteli ribonükleik asidi (RNA) çıkarmak için kullanılır. Bu protokol kullanılarak, hava yoluna özgü nöronların gen ekspresyonu belirlenir.

Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Burada, verimli bir şekilde hücreleri mevcut Drosophila görsel sistemi aktif floresans hücreye (FACS) sıralama içinde düşük bereket, izole bir hücre ayrılma protokol mevcut.

Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu  

Öğrenin Drosophila periferik nöronlarını manyetik boncuk sıralama ile izole etme ve arıtma yöntemini. CD8-GFP füzyon proteini kullanılarak yüksek saflıkta nöron popülasyonları elde edilir ve RNA analizi için uygundur.

İzolasyon ve Arıtma Drosophila Periferik Nöronlar

Daha fazla video keşfet