6.5 DPC Fare Embriyolar diseksiyonu

Benim adım Kelly Shea; Neilsen Laboratuvarı'nda laboratuvar yöneticisiyim ve aynı zamanda araştırma teknisyeniyim. Birçok kişi farklı doku tabakalarını nasıl ayırt edeceğini bilmediği için bu işlem oldukça zordur. Bu nedenle yapmanız gereken, esasen alttaki embriyoyu açığa çıkarmak için tüm doku tabakalarını geri soymaktır; embriyo bu aşamada henüz fazla vaskülarize olmamıştır. Bu yüzden oldukça şeffaftır ve ayırt edilmesi zordur.

Küt uçlu pens ve makas alın. İlk olarak hayvanı tam orta hat boyunca sıkıştırın ve ilk kesiği yapın. Ardından, bu noktadan itibaren deriyi çekerek ayırın ve hayvanın abdomenini açığa çıkarın.

Pens ile yukarı çekeceğiniz ince bir periton tabakası vardır; ardından burayı makasla keserek geriye doğru katlayabilirsiniz. Hayvanın orta hattı boyunca kesim yaparak, ortada birleşmiş olan her iki uterus kornusunu birbirinden ayırmanız gerekir. Tam taban kısmından kesebilirsiniz.

Bununla birlikte muhtemelen çok miktarda yağ da gelecektir. Hayvanın uterus boynuzunun tamamını alın. Doğrudan PBS içine yerleştirin.

İşte boynuzun içi burası. Bunlar implantasyon bölgeleri; 1, 2, 3, 4, 5. Yapmanız gereken tek şey bunları birbirinden ayırmaktır.

Temel olarak tam buradan, implantasyon bölgelerinin arasından kesebilirsiniz. Embriyoyu yan tarafından tutup temel olarak ikiye ayırabilirsiniz. Bu noktada, altında daha süngersi bir doku olan deum'u açığa çıkarmış oluyorsunuz.

Bu nedenle embriyo tam ortada, tam burada olmalıdır. Burası deciduous'un apeksidir. Apeks yukarı bakacak şekilde yönlendirmeniz gerekir.

Yapmanız gereken, apeksin yaklaşık beşte biri kadar aşağıdan kesmektir. Embriyo tam olarak şuradaki orta kısımda yer almalıdır. Ben burada örneği yan çevirip, bir pensle kavrayıp diğerini ise onu aşağıda tutmak için kullanarak uç kısmını kesiyorum ve ardından ayırıyorum.

Kapak çıkarıldıktan sonra, embriyoyu kenarı üzerine dikin. Görebileceğiniz üzere, kapağı çıkardığınız yerde tam bir açıklık bulunmaktadır. Penseti oraya yerleştirmeniz yeterlidir. Evet.

Bu aşamada embriyo, deum içinde oldukça gevşek bir şekilde durur. Deumu bir kez açtığınızda, tabanının altına ulaşabildiğiniz sürece onu nispeten kolayca dışarı çıkarabilirsiniz. Oldukça küçüktür.

Embriyoya hala bağlı olan bazı dokular da bulunmaktadır. Embriyonun tam apeksinde yer alan ekto plasental koni mevcuttur. Ayrıca hala bağlı olan diğer bazı dokular da bulunmaktadır.

Bu nedenle, pipeti alıp onları çekiyorum. Bu aşamada, embriyoları tespit etmek istersiniz. Bunun için elimde PFA içeren bir kap var.

Aday genleri incelemek istedik. Temel olarak, bir embriyo içerisinde nükleik asit üretimini görselleştirmek için tüm vücut RNA in situ teknikleri kullanıyoruz. Çok ilgilendiğimiz bu spesifik genler, varsayılan germ hücresi öncül belirteçlerini kodlamaktadır; ayrıca, germ hücrelerinin varsayılan germ hücresi öncüllerinden germ hücrelerine gelişmesine ve olgunlaşmasına yardımcı olan, fare embriyosunda belirli bir zaman noktasında eksprese oldukları öngörülmektedir.

İlk olarak üzerinde durduğumuz ve 6,5 günlük bu embriyolarda aslında ilk olarak bütün mount in situ hibridizasyon uyguladığımız faktörlerden biri, kemik morfojenetik protein 4 olan BMP four'dur. Bu protein, TGF-beta süper ailesinin bir üyesidir. Germ hücrelerinin olgunlaşmasında oldukça önemli bir rol oynar ve kesinlikle gereklidir.

Ayrıca germ hücrelerinin embriyo boyunca yer değiştirmesi ve embriyonun primitif çizgisine yakın konumlarda yerleşmesi gereklidir. BMP four, hem sinyal iletiminde hem de germ hücrelerinin primitif çizgide yerleşebilmesi için geçmeleri gereken olgunlaşma sürecinde kritik bir rol oynar. Bu nedenle, birincisi, ne aradığınızdan emin olmanız, yapının ne kadar küçük olduğunu ve hangi ölçekte çalıştığınızı bilmeniz ve ayrıca oturup çok dikkatli bir planlama yapmanız gerekir.

Teknikle ilgili olarak, özellikle ne tür bir diseksiyon mikroskobu kullanacağınız önemlidir. Teknik zorluklardan biri, embriyoya zarar vermemek için çok fazla manipülasyon ve oldukça sabit el hareketleri gerektirmesidir. Bu nedenle, manipülasyon yapabileceğiniz geniş bir alan sunan bir diseksiyon mikroskobu tercih etmelisiniz; ayrıca, diseksiyon sırasında gerekenden daha fazla manipülasyon yapmamak için deney için ihtiyacınız olan her şeyin hazır olduğundan emin olun.

Bunun dışında, neyle çalıştığınızı tam olarak kestirebilmek için işlemi çok yavaş yapmanız ve münferit doku katmanlarını çok yavaşça soymanız gerektiğini düşünüyorum. Ayrıca embriyonun nerede konumlandığını bildiğinizden emin olun.