Name: Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-10T17:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Öğrenin, yetişkin memeli nöronlarına cDNA intranükleer mikroenjeksiyonu ile yüksek düzeyde protein ekspresyonu sağlama yöntemini. Bu teknik, bölünme sonrası hücrelerde fonksiyonel çalışmalar için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bizim laboratuar araştırmaları NIH İntramural Araştırma Programı, Ulusal Alkol İstismarı ve Alkolizm Enstitüsü tarafından desteklenmektedir.

<html> I. enjeksiyon için hazırlanması Bu bölümde cDNA nöron çekirdeği içine enjekte önce alınması gereken hazırlık adımları açıklar. Nöronlar için izolasyon prosedürü, bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak, bireysel hücrelerine ayrı nöron var ve (bunu elde etmek için yararlı ipuçları için tartışma bakınız), 35 mm, hücre kültürü yemekleri alt yüzeyi iyice yapışmış önemlidir. Farklı nöronların çeşitli potansiyel olabilir rağmen rahatlıkla erişilebilir ve çok sayıda nöron verim, çünkü üstün servikal ganglion (SCG) veya dorsal kök gangliyon gibi periferik ganglionlar diseksiyonu için tercih edilir. SCG nöronlar kullanarak ek avantajlar hücrelerinin görece homojen bir nüfus olduğunu ve 1,2,3,4 iyi karakterize . A. hazırlanması, enjeksiyon için cDNA plazmid <ol><li> Kontaminasyon veya DNA dökümünü önlemek için, hazırlanması sırasında eldiven giyilmelidir. </li><li> Ilgi protein kodlayan DNA yapısal olarak aktif ve son derece sitomegalovirüs (CMV) organizatörü düzenleme altında PCI (Promega, Madison, WI) gibi uygun bir memeli ekspresyon vektörü, subcloned. Protein etiketli değilse, plazmid bir muhabir, örneğin kodlama EGFP (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), başarılı bir enjeksiyon ve ifade onaylamak için ortak enjekte edilir. DNA parçacık kaldırmak için bir PVDF filtresi (0.1 mikron, Millipore, Bedford, MA) ile santrifüj bir filtre ünitesi kullanarak yüksek kaliteli ayırma sütun (örneğin QIAfilter Midi-prep kiti, Qiagen, Chatsworth, CA) ve daha arıtılmış kullanılarak izole edilmiştir plazmid hazırlanması, enjeksiyon işlemi sırasında enjeksiyon pipetleri engelleyebilir. Plazmidler yaklaşık 1 mg / ml konsantrasyonda uygun bir DNA saklama tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0, örneğin TE tamponu) -20 ° C&#39;de saklanır. </li><li> Mikroenjeksiyon için hemen önce, plazmid cDNAs TE tampon ya da H 2 O. istenen nihai konsantrasyonu seyreltilir ve karıştırılır Tipik olarak, 5-10 ng / ul muhabir gen enjekte edilen hücrelerin etiketlemek için yeterli ve DNA yüksek konsantrasyonlarda az viskoz ve enjeksiyon pipetleri yapışmasına neden olabilir enjekte edilecek cDNA toplam konsantrasyonu 200 ng / ml geçmemelidir. Enjeksiyon için cDNA küçük hacimli (5-10 ul) Parafilm (kağıt desteğini altında yan) küçük bir parça temiz bir yüzey üzerine çözüm karıştırma damla tarafından hazırlanmıştır. Pipetor ile birkaç kez yukarı ve aşağı pipeting birlikte çözüm damla karıştırın ve karıştırma sırasında hava kabarcıkları almaktan kaçınması. </li><li> Microloader pipetlemeyin ucu (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY) kullanarak, özel olarak hazırlanmış bir hematokrit tüpü (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) cDNA çözüm aktarın. Hematokrit tüpleri (Malzeme Tablo) hazırlanması ile ilgili talimatlar için malzemeler bölümüne bakın. Hematokrit tüpü, tüpe 1,5 ml mikrosantrifüj cDNA enjeksiyon solüsyonu içeren yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında (20-24 ° C) tortu parçacıklara cDNA çözüm blok olabilir, 15-30 dakika süreyle sabit bir açı ya da sallanan bir kova rotor (Eppendorf) ile donatılmış bir mikrosantrifüj 10 000 g tüp Santrifüj mikroenjeksiyon pipetlemeyin. CDNA enjeksiyon çözüm enjeksiyon oturumu sırasında, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. </li></ol> B. Fabrikasyon enjeksiyon pipetleri <ol><li> Tek kullanımlık cam mikroenjeksiyon pipetleri kolay ancak pahalı (mikroenjeksiyon pipetlemeyin başına 10 $), (Femtotips örneğin, Eppendorf) piyasada mevcuttur. Enjeksiyon pipetleri programlanabilir P-97 Brown pipetlemeyin çektirmenin Flaming (Sutter Instrument Company, Novato, CA) ve filamented, ince duvarlı borosilikat camdan kılcal tüpler (Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL) kullanarak laboratuvarda imal edilebilir. Bu seçenek, daha maliyet-etkin ve mikroenjeksiyon pipetlemeyin şekil ve boyut kontrolü sağlar. </li><li> Iki aşamalı bir program dar mikroenjeksiyon pipetlemeyin ipuçları çekmek için kullanılır. Mikroenjeksiyon pipetleri açılışında bir ışık mikroskop altında incelemek için çok dar olduğundan, enjeksiyon pipetleri kalitesini program ayarları kesinleşir önce birkaç hücre enjekte edilerek doğrudan değerlendirmek gerekmektedir. Aşağıda, ısı, çekme, hız ve zaman ayarları için yaklaşık ayarlar şunlardır: (çekme 1) 600, 115, 15, 250; (çekme 2) 640, 130, 65, 200. Bu ayarlar farklı toplu cam ve ısıtma filament çektirmenin durumu değişir ve gerektiği şekilde ayarlanması gerekir. Daha fazla ayrıntı için 5&#39;e bakınız. </li><li> Enjeksiyon oturumu sırasında hasar veya sorunlar durumunda, enjekte edilecek, nöron çanak başına birkaç (2-5) enjeksiyon pipetleri çekin. Mağaza enjeksiyon, toz mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu girmesini önlemek için kapalı bir kapta pipetleri. </li></ol> II. Intranükleer mikroenjeksiyon çadır &quot;&gt; Bu bölümde ayrıntıları cDNA nöron çekirdek içine enjekte sürecinin temel bir mikroenjeksiyon set-up işlemini görselleştirmek için bir ters faz-kontrast mikroskobu (örneğin Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY), mikromanipülatör (örn. pipetlemeyin cDNA çözüm sınırdışı enjeksiyon pipetlemeyin hareket ve enjektör (örneğin Eppendorf FemtoJet Express) bir basınç kontrol etmek için Eppendorf 5171). mikromanipülatör basıncı enjektör bağlanması enjeksiyonlar sırasında son iki süreçlerin senkronizasyon sağlar. isteğe bağlı, ancak şiddetle tavsiye bağlanmış bir video izleme sistemi (CCD kamera, Cohu Inc, San Diego, CA, siyah ve beyaz video monitör, Sony Corporation, Tokyo, Japonya), bileşenler içerir. Bu sistem, enjeksiyon için mutlak bir gereklilik değildir; Ancak, siyah ve beyaz monitör, hücre çekirdeğinin gelişmiş görselleştirme için yüksek kontrast sunar ve uzun enjeksiyon oturumları sırasında daha rahat bir izleme deneyimi sunuyor. Buna ek olarak, elde tutulan bir kontrol ünitesi çalışması için yazılımı çalıştıran bir dizüstü bilgisayar yarı-yararlanılabilir (Detaylar için tartışılması bakınız) enjeksiyon işlemi otomatikleştirmek. SCG nöronlar enjekte etmek için ideal zaman 3-6 saat sonrası disosiasyon. Bu aşamada, hücreleri yemeğin altına sıkıca bağlı ve çekirdeği, tek veya birden çok nükleol (Şekil içeren karanlık bir membran ile merkezi bir yuvarlak organel olarak, faz-kontrast mikroskop altında, açıkça görülebilir, küresel 1A). <ol><li> Ayrışmış nöronlar mikroskop sahne ortasına bir tabak koyun. Odağı ayarlayın ve faz kontrast mikroskop optik optimize nöronların çekirdekleri açıkça görülebilir. </li><li> Microloader pipetlemeyin ucu kullanarak mikroenjeksiyon pipetlemeyin içine hazırlanmış cDNA çözüm pipetleyin 2 ul. Bu santrifüj sırasında yerleşen parçacık kadar karıştırın beri hematokrit tüpünün alt kısmına yakın çözüm çizim kaçının. Mikroenjeksiyon pipetleri filament ucu çözüm çizim yardım, ancak küçük hava kabarcıkları devam ederse, onları hafifçe çıkarmak için cam yan fiske olmalıdır. </li><li> Kapiller basıncı enjektör tutucu içine mikroenjeksiyon pipetlemeyin takın ve ardından mikromanipülatör sahibinin güvenli. 45 ° açıyla sahibinin sabittir. </li><li> Çanak içine mikroenjeksiyon pipetlemeyin indirin. Pipetlemeyin kültür ortamı girerken, menisküs ışığın kırılma etkiler ve nöronlar görüntü kalitesini düşürür oluşur. Bu sorunu hafifletmek için, nöronların çekirdekleri daha net bir şekilde görülebiliyor kadar faz halka taret biraz mahsup edilebilir. </li><li> Bazı basınçlı enjeksiyon sistemleri, kısa bir süre için mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucundan maksimum hava basıncı uygulayan bir &quot;temiz&quot; fonksiyonu var. Ucu tıkanmış görünüyor başlamadan önce ve enjeksiyon sırasında enkaz pipetlemeyin temizlemek için bu işlevi kullanın. Bu işlevi kullanırken effect sıvı ekranda görünmüyorsa, yeni bir enjeksiyon pipetlemeyin ile değiştirin. </li><li> Merkezi mikroenjeksiyon görüntüleme monitör pipetlemeyin ve nöron bir yanında ve nükleolus aynı odak düzlemli ucu hizalamak. Bu pozisyonda mikromanipülatör z-ekseni alt limit olarak ayarlayın. Bu pozisyon, mikroenjeksiyon pipetlemeyin enjeksiyonlar sırasında önceden derinliği. Şimdi bu noktada üzerinde yaklaşık 30 mikron ucu mikroenjeksiyon pipetlemeyin nöron üst temizler böylece yerleştirin. </li><li> Intranükleer enjeksiyonları gerçekleştirmek için aşağıdaki ayarları ile tanımlanan bir Eppendorf 5171 mikromanipülatör &quot;enjekte&quot; modunda olabilir. Enjekte fonksiyonu ayarlandığında, Impale fonksiyonu kapalı iken. Çapraz enjeksiyon yolu (x-ve z-ekseni boyunca) hücre hasarı en az üretir ve böylece eksenel mod enjeksiyonlar için kullanılmalıdır. 300 mm / sn &#39;lik bir enjeksiyon hızı yeterli ve mikroenjeksiyon pipetlemeyin z-ekseni sınırı set ulaştığında basınç birikmesini senkronize. </li><li> Basıncı enjektör çekirdeğin içine enjekte cDNA çözüm miktarını kontrol eder. &quot;Otomatik&quot; enjeksiyon modunda, DNA teslim süresi kontrollü ve bağlı mikromanipülatör tarafından başlatılan. Enjeksiyon basıncı (Pi) 100 ila 200 hectopascals (1 inç ~ 0.015 psi hPa) arasında ayarlanabilir olmalıdır yüksek enjeksiyon basınçları enjeksiyon başarı oranları veya kalitesini artırmak ve mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu boyutu veya DNA saflık diğer sorunlara işaret edebilir . Bir enjeksiyon süresi 0.3 sn (ti) ve 30 hPa, parçacıklar kapatılmasıy kültür ortamı pipetlemeyin ucu içine girişini önlemek için sabit bir pozitif basınç sağlayan bir tazminat basıncı (Adet) kullanılmalıdır. </li><li> Mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu xy eksen sahne kumanda kullanılarak mikroskop altında enjekte edilir nöron yerleştirin. T arasında ileri ve geri odaklanarak, merkezi çekirdeğin yukarıdaki pipetlemeyin ucu hizalayıno ucu ve nükleol. </li><li> Enjekte düğmesine (mikromanipülatör) basarak çekirdeği enjekte edilir. Enjeksiyon adım için, mikroenjeksiyon pipetlemeyin ve cDNA çözümün serbest hareket mikromanipülatör tarafından kontrol edilir. Göz başarılı intranükleer enjeksiyonları onaylamak için zordur, fakat nispeten düşük viskoziteli cDNA çözüm enjeksiyon (viskoz nükleer çevreye göre), genellikle faz-kontrast optik altında beyaz bir tüy gibi görünür ve enjeksiyon bir göstergesi olarak kullanılabilir çekirdeğin içine. Bazen mikroenjeksiyon pipetlemeyin nükleer membran nüfuz değildir ve sadece çekirdeğin titreşim. Aynı pozisyonda ikinci bir enjeksiyon denemesinde başarılı bir enjeksiyon çekirdeğin içine DNA yol açabilir. Hücre şişmesi genellikle kasıtsız sitoplazmik enjeksiyon göstergesidir. Ayrıca, önemli bir nükleer şişme nöronların hücre ölümü ve genellikle sonuçları kısa bir süre sonra tolere değildir, bu yüzden enjeksiyon basıncı ve süresi önerilen değerleri aşmamalıdır. </li><li> Mikroenjeksiyon pipetlemeyin altında bir sonraki nörona hizalamak için mikroskop aşamasında yeniden nöronlar enjekte devam edin. Sistematik, tabak nöron gece inkübasyon için inkübatör dönmeden önce yaklaşık 50-100 çekirdekleri enjekte çanak gezinmek. Başarıyla enjekte nöronlar muhabiri gen ekspresyonu tarafından ertesi gün tespit edilebilir. </li></ol> III. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Superior servikal ganglion (SCG) nöronlar. Faz kontrastlı görüntü nöronlar SCG 3 saat sonrası disosiasyon (A). Bu aşamada, mikroenjeksiyon pipetlemeyin ucu uyumuna yardımcı olan çekirdeğin açıkça görülebilir. Çekirdeği, bir tek (sol) veya birden fazla (sağda) karanlık nükleol nöron merkezinde görünür. Çekirdeği (B) cDNA EGFP enjeksiyonu takiben 16 saat SCG nöronlar. Sol, faz-kontrast aydınlatma altında görüntülenen nöronlar SCG. Sağ, başarılı bir enjeksiyon gösteren ve bir nöron EGFP ifade sonuçlanan aynı nöron epifluorescent görüntü. Beyaz ölçek çubuğu 20 mm. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" /> Şekil 2: aracılığıyla akımların Tüm hücre kayıtları heterologously ifade G-protein, K + (GIRK) kanalları içsel nöronlar SCG giderilmesi birleştiğinde . GIRK akımları (I GIRK) -140 bir holding potansiyeli -60 mV 40 mV 200 ms gerilim rampası (A İçerlek) endojen α 2-adrenerjik norepinefrin tarafından aşağıdaki aktivasyon (KD, 10 mcM) tarafından uyarılmış . Süperempoze izleri önce (siyah) ve KD tek başına (mavi) veya NE uygulama artı 10 mM Ba 2 + (kırmızı) sonra aynı nöron kayıtları ve gösterir. Kesikli çizgiler sıfır akım düzeyini gösterir. Ben GIRK, harici bir çözüm (mM) 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 Hepes, 10 CaCl 2, 0.8 MgCl 2, 15 glikoz, sakkaroz, 15 ve 0.0003 TTX NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlanmış kayıt için . Dahili kayıt çözümü (mM) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 Hepes, 4 MgATP, ve KOH ile pH 7.2 &#39;ye ayarlanır 0,3 Na 2 GTP, içeriyordu. (A) akım eksikliği KD uninjected SCG nöronların varlığını gerilim rampası tarafından ortaya. Gösterir, bu SCG nöronların endojen GIRK kanalları ifade yoktur. Başarılı enjeksiyon plazmid cDNA kodlama fonksiyonel bir GIRK kanal 11 KD (B, sol) maruz kaldığında gerilim rampası sırasında büyük akımlara yol açmaktadır. : G-protein kenetli reseptör agonist (NE), içe düzeltme ve varsayılan GIRK kanal blokeri, Ba 2 + (B, sağ kırmızı iz) akımları blok tarafından aktive Akımlar GIRK kanallar aracılığıyla akımların tipik özellikler var. Açık ve dolu çevreler sırasıyla, holding ve pik akım GIRK temsil eder. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li>
<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+%CE%B2%CE%B3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li>
<li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li>
<li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li>
<li>Dean, D. A. Chapter 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DA+%22Live+Cell+Imaging%3A+a+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: a Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 51-66 (2005).</li>
<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li>
<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li>
<li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RGS-insensitive+G%CE%B1+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons.%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons.</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li>
<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+gene+transfer+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li>
<li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li>
<li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4%2C+the+two+subunits+of+the+KACh+channel%2C+using+functional+homomeric+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li>
</ol>

Karşılaşılan ortak sorunları ve önerileri: Daha önce belirtildiği gibi, başarılı bir nükleer enjeksiyonlar doku kültürü plakaları yapışık hücrelere sahip bağlıdır. Enjeksiyon başlangıç ​​ertelemek hücre disosiasyon prosedürü izleyerek bir kaç saat nöronlar yemekleri alt yapışmasına yol açar. Buna ek olarak, 0.1 mg / ml &#39;lik yüksek molekül ağırlıklı poli-L-lisin (Sigma, St Louis, MO) yemekleri alt yüzeye nöronların yardımcıları yapışma kaplama yemekler. Yüksek konsantrasyonda DNA enjekte etmeye çalışırken özellikle mikroenjeksiyon pipetleri tıkanması, sık görülen bir sorun olabilir. Plazmid DNA izole etmek ve arındırmak için yüksek kaliteli ayırma kolonları kullanarak ve (spin filtreler, hematokrit tüpler iplik) belirtilen ek saflaştırma adımları gerçekleştirmeden önce enjekte parçacık kaldırmak için yardımcı olabilir. Enjeksiyonlar sırasında, basınç enjektör &quot;temiz&quot; fonksiyonu (0.2 s için yeterli) olabilir, ancak bu sorunu çözmezse, yeni bir enjeksiyon pipetlemeyin kullanılmalıdır. Mikroenjeksiyon pipetleri çoğunluğu bir enjeksiyon oturumu sırasında tıkanmış hale gelirse, daha büyük bir açılış ile mikroenjeksiyon pipetlemeyin ipuçları üretmek için damlalıklı cam çektirmenin ayarlarını değiştirerek düşünün. Nükleer enjeksiyonlar sırasında ortaya çıkan diğer bir konu, doku kültürü yemekleri alt yüzeyi eşitsizliği. Bu değişkenliği doğrudan derinlik beri enjeksiyonlar sırasında pipetlemeyin traversler sabit çekirdeğine enjeksiyon pipetlemeyin ipuçları hedefleme doğruluğunu etkiler. Bu nedenle, bu z-ekseni sınırı, aynı tabak içinde enjeksiyonların seyri sırasında ayarlanması gerekir. Bir ayarlama gerekli olduğunda belirgin olacaktır: (nükleer enjeksiyon (çekirdeği veya hücre tamamen cevapsız hiçbir beyaz tüy) dair hiçbir işaret yok, ya da enjeksiyon pipetlemeyin ucu çanak alt gelir hücre sıkıştırarak hatta) pipetlemeyin ucu çanağın dibine çöküyor. Cam klonlama silindir (OD 10 mm, Kedi No 2.090-01.010, Bellco Cam, Vineland, NJ) nöronların kaplama sırasında daha küçük, daha dar bir alanda onları kısıtlamak için kullanılan olabilir, bu nedenle hareket ettirmek için gerekli mesafeyi en aza indirmek enjeksiyonlar arasındaki enjeksiyon pipetlemeyin. Bu klonlama silindir microinjections performans önce kaldırılır. Teknik Dezavantajları: Intranükleer microinjections teknik sabır ve yüksek derecede bir operatör tarafından el becerisi gerektiren talep ediyorlar. Bu tekniği ile Yeterlik, başka bir beceri ile gibi, uygulama ile geliyor. Bu nedenle, gerçek deneyler denemeden önce muhabiri genin tek başına nükleer enjeksiyon uygulama tavsiye edilir. Daha fazla enjeksiyon işlemi yardımcı olmak için, bir bilgisayar programı ve basıncı enjektör içine mikromanipülatör adımları sağlamlaştırmak için mümkün olabilir. Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) gibi programlar (mikroenjeksiyon ayarları saklamak için 6,7,8 görmek ve yarı otomatikleştirmek enjeksiyon işlemi için programı çok fonksiyonlu denetleyicileri (ShuttlePro, Çevre Tasarım, Windham, NH) kullanılmalıdır. bakın). Intranükleer mikroenjeksiyon tekniği Bir diğer dezavantajı ise düşük başarı oranı. Teşebbüs nükleer enjeksiyonlar yaklaşık% 10-20 protein ifade neden olur. Bu etkinliği çok sayıda ifade hücreler, örneğin elektrofizyoloji, çeşitli biyokimyasal testleri için bu yeterli olmayabilir gerekmez uygulamaları için yeterli olabilir rağmen. Teknik Uygulamalar: Sakıncaları olmasına rağmen, DNA intranükleer mikroenjeksiyon heterologously nöronların proteinleri ifade etmek için son derece yararlı bir tekniktir. Yüksek düzeyde protein ekspresyonu, çünkü çekirdeğin enjeksiyonları, düzenleyen bir gen transkripsiyonu ve çekirdeğinde bulunan plazmid uzun istikrar son derece aktif CMV organizatörü sırasında salınan plazmid çok sayıda nükleer microinjections ile elde edilir. Protein-ifadesi üzerine heterolog proteinlerin yüksek düzeyde endojen protein istila etmek için gerekli olan dominant-negatif deneylerde özellikle yararlıdır. Intranükleer enjeksiyonları diğer bir avantajı çok yapıları enjekte edilir çekirdeğine cDNA yapıları tutarlı bir kısmı teslim yeteneğidir. Diğer transfeksiyon yöntemleri ile, her DNA aynı oranda tekrarlanabilir aynı çanağı içinde ve transfections arasında farklı hücrelerin içine inşa tanıtmak için zordur. Çekirdeğin içine cDNA çözüm Direkt enjeksiyonlu değişkenlik bu kaynağı ortadan kaldırır ve ifade proteinlerin oranının etkin bir şekilde titre olanak sağlar. Geleneksel transfeksiyon yöntemleri post-mitotik hücrelerin içine DNA transfeksiyon REAG ile ilişkili 9 çekirdeği ve kimyasal toksisitesi düşük esas nedeniyle sınırlı etkinliğiveliler 10. Nükleer microinjections çekirdeğindeki genetik materyalin içine mekanik getirerek bu sorunların üstesinden gelmek. Bu tekniği daha fazla dahil olmasına rağmen, fonksiyonel bir biyolojik sistem bir proteinin etkisini araştırmak için yeteneği, bu tekniğin zahmetli doğa dengeler daha fazla endojen sinyal yolları tamamlamak. Tüm hayvanlar üzerinde deney prosedürleri göre, Ulusal Sağlık Hayvan Bakım ve Kullanım Kuralları Enstitüleri ile yapıldı.

<table><tbody><tr><td>Ultrafree-MC Filtre Ünitesi</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td>Durapore PVDF filtre; 0.1 &amp;#x03BC;m gözenek boyutu</td></tr><tr><td>TE tamponu</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>351-010-131</td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>Mikro-hematokrit kapiler tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td>Heparinlenmemiş Hazırlık:&lt;br/&gt;Gecelik olarak %100 etanol içinde bekletin. Deiyonize su ile üç kez iyice yıkayın ve camları fırında kurutun (95&amp;#x00B0;C). Temizlenen hematokrit tüplerini elmas uçlu bir çizici kullanarak 3-4 cm uzunluğundaki parçalar halinde kesin ve camı tutmak için bir pens ve alev yardımıyla bir ucunu kapatın. Toz birikimini önlemek için temiz bir cam beherde saklayın ve üzerini kapatın.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>Sabit açılı veya salınımlı rotorlu</td></tr><tr><td>Microloader 20 &amp;mu;l pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon kapiler camı</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW120F-4</td><td>Filamanlı ince duvarlı, 1.2 mm dış çap, 0.9 mm iç çap, 100 mm uzunluk</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Mikropipet Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Platin-iridyum kutu filamanlı (parça no FB330B)</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD İnverted Mikroskob</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Vibrasyon izole masasına monte edilmiş 20x ve 40x faz-kontrast objektif lensler</td></tr><tr><td>Yük aktarımlı cihaz (CCD) kamera</td><td>Cohu Inc.</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>Video monitörü</td><td>Sony Corporation</td><td>PVM-122</td><td>Siyah ve Beyaz, 9&amp;#8221; ekran</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör sistemi</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon Ünitesi</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon kontrolörü</td><td>Contour Design</td><td>S-PROV2</td><td>Programlanabilir multimedya kontrolörü</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Versiyon 4.05A</td><td>S. Ikeda tarafından yazılmış, mikroenjeksiyon kontrolörünü yöneten komut programı</td></tr></tbody></table>

yetişkin grubuyla memeli nöronlar içine dna intranükleer mikroenjeksiyon

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primer nöronal hücre kültürleri ölümsüzleştirdi hücre hatları ile karşılaştırıldığında daha fazla biyolojik ilgili sistem temsil ettiği protein fonksiyonu çalışma için değerli araçlar. Ancak, birincil nöronların post-mitotik doğa, elektroporasyon veya kimyasal aracılı transfeksiyon gibi ortak prosedürlerini kullanarak etkili heterolog protein ekspresyonunu engeller. Böylece, diğer tekniklerin etkili olmayan bu bölünen hücreleri proteinleri ifade etmek için istihdam edilmesi gerekmektedir. Bu makalede, ayrışmış yetişkin sempatik nöronlar cDNA yapıları intranükleer enjeksiyonları gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar. Bu teknik, farklı tipte nöron uygulanmıştır başarıyla heterolog protein ekspresyonu neden olabilir. Mikroenjeksiyon işlemi için gerekli ekipman, hücreleri, N 2 (g) basınç dağıtım sistemi bağlı cDNA çözümü ile dolu bir cam enjeksiyon pipetlemeyin ve mikromanipülatör görselleştirmek için ters bir mikroskop içerir . Mikromanipülatör basınçlı N 2 pipetlemeyin ucundan cDNA çözüm çıkarmak için kısa bir darbe ile mikroenjeksiyon pipetlemeyin enjeksiyon hareketi koordine eder. Bu teknik, diğer birçok transfeksiyon yöntemleri ile ilişkili toksisite ve tutarlı bir oranı ifade edilmesi, birden fazla DNA yapıları sağlar değildir. Enjekte edilen hücrelerin sayısının düşük olması gibi elektrofizyolojik kayıtlar ve optik görüntüleme gibi tek bir hücre çalışmaları için uygun mikroenjeksiyon işlemi yapar, ancak hücreleri ve yüksek transfeksiyon verimliliği daha çok sayıda gerektiren biyokimyasal deneyleri için ideal olmayabilir. Intranükleer microinjections ekipman ve zaman bir yatırım gerektirmesine rağmen, yeteneği fizyolojik ilgili çevre heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeylerine ulaşmak amacıyla bu tekniğin proteinin fonksiyonunu araştırmak için çok yararlı bir araç yapar.

CDNA Doğrudan intranükleer enjeksiyonu, etkili bir post-mitotik hücrelerin transfeksiyon tekniktir. Bu yöntem, tek veya birden fazla cDNA yapıları heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlar ve tek bir hücre deneyleri çeşitli fizyolojik ilgili bir ortamda incelenmesi gereken protein fonksiyonu sağlar.

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Primer nöronal hücre kültürleri, ... ile karşılaştırıldığında biyolojik olarak daha ilgili bir sistemi temsil ettikleri için protein fonksiyonlarını incelemek adına değerli araçlardır.

Bu enjeksiyon prosedürünün ilk adımında, DNA çözeltisinin çalışma konsantrasyonu çöktürme işlemi için santrifüj edilir. Daha sonra, BO silikat cam kılcal tüplerden imal edilen partikül madde enjeksiyon pipetleri DNA çözeltisi ile doldurulur. Hücreler mikroskop tablasına yerleştirilir ve hücre çekirdeğinin görselleştirmesi optimize edilir.Pipet çekirdek ile hizalanır ve hücreye enjeksiyon yapılır. Ertesi gün her kapta birden fazla hücreye enjeksiyon uygulanır. Başarıyla enjekte edilen hücreler, bir reporter genin ekspresyonu ile tanımlanır.Merhaba, ben Ulusal Sağlık Enstitüleri bünyesindeki Ulusal Alkol Kötüye Kullanımı ve Alkolizm Enstitüsü'nde Dr. Stephen Akeda'nın laboratuvarından Van Mu. Ben de Akeda Laboratuvarı'ndan Damien Williams. Ve ben de AKEDA laboratuvarından Eugene run.Bugün size, disosiye nöronlara cDNA konstrüktlarının INTERCLEAR mikroenjeksiyon prosedürünü göstereceğiz. Bu, geleneksel olarak transfeksiyona dirençli olan post-mitotik hücrelerde, ilgilenilen proteinlerin hetero-ekspresyonu için etkili bir yöntemdir. Laboratuvarımızda bu tekniği, N kanallarının G proteini modülasyonunun altında yatan mekanizmaları incelemek için kullanıyoruz.Şimdi koyu renkli dişler elde edelim. İlk olarak, disosiye edilmiş yetişkin memeli nöronlarını, 0.1 mg/mL yüksek moleküler ağırlıklı poli-L-lizin ile kaplanmış hücre kültürü kaplarına ekleyerek başlayın. Bu işlem, nöronların kapların alt yüzeyine yapışmasına yardımcı olur.Plakaya ekilmiş nöronları daha küçük ve daha sınırlı bir alana toplamak için cam klonlama silindirleri kullanılabilir. Bu işlem, enjekte edilecek nöronlar arasındaki mesafeyi en aza indirir. Hücrelerin plak tabanına yapışması için yeterli süreyi tanımak amacıyla, intranükleer mikroenjeksiyonları gerçekleştirmeden önce plakları 37 °C'lik bir inkübatörde üç ila altı saat bekletin.Nöronlar inkübe edilirken, Sutter P 97 alevli cam çekici ve ince duvarlı borosilikat cam kapiler tüpler kullanılarak mikroenjeksiyon pipetleri hazırlanır. İlk çekim ve ikinci çekim için aşağıdaki ayarları içeren iki aşamalı bir çekim programı kullanıyoruz. Gerekli ayarlar, farklı cam partilerine ve çekicideki ısıtma filamentinin durumuna göre değişiklik gösterdiğinden, gerektiği şekilde ayarlanmalıdır.Enjeksiyon pipetlerinin hasar görmesi veya enjeksiyon oturumu sırasında sorunlar yaşanması ihtimaline karşı, her nöron kabı için en az beş enjeksiyon pipeti çekilmelidir. Çekilen enjeksiyon pipetleri, enjeksiyondan hemen önce mikroenjeksiyon pipet ucuna toz girmesini önlemek için kapalı bir kapta saklanmalıdır. Plazmid cDNA'lar çalışma konsantrasyonuna seyreltilir. Çalışma yüzeyine küçük bir parça parafilm yerleştirin ve kağıt desteğini çıkarın.CD NA stok çözeltisini ve TE tamponunu parametreye ekleyin. CD NA'yı seyreltmek için, final CDNA konsantrasyonu olarak mikrolitre başına 200 nanogramdan daha düşük bir değer ve toplam hacim olarak iki ile 10 mikrolitre arası bir miktar kullanmanızı öneririz. CD NA tarafından kodlanan protein etiketlenmemişse, örneğin EGFP kodlayan bir rapor plasmidi, deneysel CD NA ile birlikte ko-enjekte edilebilir. Başarılı enjeksiyonu ve ekspresyonu doğrulamak için, CD NNA çözeltilerini profil üzerinde pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekerek karıştırın.Mikroenjeksiyon pipetini daha sonra tıkayabilecek cDNA çözeltisindeki partiküllerin çöktürülmesi için, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Çözeltiyi transfer etmek için bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak, temizlenmiş, kesilmiş ve bir ucu alevle mühürlenmiş hazır bir hematokrit tüpüne aktarın. Ardından hematokrit tüpünü 1,5 milliliter'lik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve 15 ila 30 dakika boyunca santrifüjleyin.Oda sıcaklığında 10, 000 g'de santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, cDNA enjeksiyon çözeltisini içeren tübü kenara ayırın. Çözelti, enjeksiyon seansı boyunca bir ila iki saat oda sıcaklığında tutulabilir.Hücreler ekildikten sonra, cam klonlama silindirlerini çıkarın. Ardından, ekilen hücreleri enjeksiyon oturumundan önceki inkübasyon süresinin geri kalanı için inkübatöre geri yerleştirin. Enjeksiyona başlamak için, önce inkübatörden bir kap ekilmiş nöron alın ve bunu bir enjeksiyon düzeneğinin mikroskop tablasına yerleştirin.Düzenek; evirilmiş faz kontrast mikroskobu, bir mikro manipülatöre bağlı basınç enjektörü ve bir video izleme sisteminden oluşmaktadır. Faz kontrast altında nöronlar, koyu renkli bir membrana sahip merkezi yuvarlak bir organel olarak belirgin şekilde görülebilen bir çekirdeği olan küresel hücreler olarak görünür ve tek veya birden fazla nukleolus içerebilir. Bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak, hematokrit tüpünden hazırlanan CD NA'dan 2 µL çekin.Parçacıkların çökmüş olabileceği tüpün tabanındaki çözeltiden kaçınmaya dikkat edin. Çözeltiyi bir mikroenjeksiyon pipetine aktarın. Mikroenjeksiyon pipetindeki filament, çözeltinin uca çekilmesine yardımcı olacaktır.Ancak küçük hava kabarcıkları kalırsa, bunları gidermek için camın kenarına hafifçe vurun ve basınç enjektörünün kapiler tutucusunun 45 derecelik bir açıda sabitlendiğinden emin olun. Ardından mikroenjeksiyon pipetini kapiler tutucuya yerleştirin ve tutucuyu mikromanipülatöre sabitleyin. Sonrasında, mikromanipülatörü kullanarak mikroenjeksiyon pipetini kabın içine indirin; pipet kültür ortamına girdiğinde, numuneden geçen ışığın yolunu değiştiren ve böylece nöronların görüntü kalitesini düşüren bir menisküs oluşur.Bu sorunu gidermek için, nöronların çekirdekleri net bir şekilde görünene kadar faz ayar halkasını (phasing turret) ayarlayın. Enjeksiyonlara başlamadan önce, pipeti kalıntılardan arındırmak ve mikroenjeksiyon pipetlerinin kalitesini kontrol etmek için basınçlı enjeksiyon sisteminin temizleme (clean) fonksiyonunu kullanın.Ekran üzerinde püskürtülen çözelti görülmelidir. Bu fonksiyon kullanıldığında, optimal boyuttaki bir pipet ucundan sıvı, ince bir akış şeklinde püskürtülür. Mikroenjeksiyon pipeti tıkalıysa veya çok darsa, temizleme fonksiyonu kullanıldığında sıvı püskürtmeyecektir.Uç çok genişse veya kırılmışsa, sıvı uçtan geniş bir akış şeklinde çıkacaktır. Enjeksiyonlar sırasında uç suboptimal görünüyorsa, enjeksiyon pipetini değiştirin ve ardından mikroenjeksiyon pipetini izleme monitöründe merkezleyin. Çekirdeği odakta tutarak, pipetin ucunu bir nöronun yanına gelip odaklanana kadar indirin.Bu konumu, mikro manipülatör üzerindeki alt Z ekseni sınırı olarak ayarlayın. Bu konum, mikroenjeksiyon pipetinin enjeksiyonlar sırasında ilerleyeceği derinliktir. Ardından, ucu bu noktanın yaklaşık 30 µm üzerine konumlandırın.Böylece mikroenjeksiyon pipeti nöronların üst kısmını temizlemiş olur. Şimdi mikroenjeksiyonlar için mikro manipülatör ayarlarını programlayın. Hücre hasarını en aza indirmek için bir einor mikro manipülatörün enjeksiyon modunu (inject mode) "açık" (on) ve delme fonksiyonunu (impale function) "kapalı" (off) konumuna getirin.Mikroenjeksiyon sırasında, aksiyel modu seçerek diyagonal bir enjeksiyon yolu belirleyin. Enjeksiyon hızını saniyede 300 mikrometre olarak ayarlayın ve basınç artışını limit değerinde senkronize edin. Sonraki program.Basınç enjektörünün ayarları; enjeksiyon basıncı veya PI 100 ile 200 Hektopaskal (HPA) arasına, enjeksiyon süresi veya ti 0,3 saniyeye ve kompanzasyon basıncı veya PC 30 HPA'ya ayarlanır. Manipülatör ayarları yapıldıktan sonra intranükleer enjeksiyonlar gerçekleştirilebilir. Mikroskobun XY ekseni sahne kontrol konumu kullanılarak, mikroenjeksiyon pipeti ucunun altına ilgili nöron getirilir.Pipet ucunu, uç ile çekirdek arasındaki odaklamayı yukarı ve aşağı hareket ettirerek çekirdeğin merkezinin üzerine hizalayın. Mikromanipülatör üzerindeki enjeksiyon düğmesine basarak çekirdeğe enjeksiyonu gerçekleştirin. Nispeten düşük viskoziteli maddenin enjeksiyonu.cDNA çözeltisi, faz kontrast optiği altında görüntülendiğinde çekirdekte genellikle beyaz bir tüy şeklinde görünür. Mikroenjeksiyon pipetinin altına bir sonraki nöronu hizalamak için mikroskop tablasını yeniden konumlandırarak nöronlara enjeksiyon yapmaya devam edin.Kap içerisinde sistematik olarak ilerleyin. Çekirdeklere enjeksiyon yapmaya devam edin. Mikroenjeksiyon pipetinin kalitesini kontrol etmek için her 10 ila 15 enjeksiyonda bir daha önce açıklanan temizleme işlemini uygulayın.Pipet tıkanmışsa veya hasarlıysa, yeni bir enjeksiyon pipeti ile değiştirilir. Doku kültürü kaplarının taban yüzeyindeki düzensizlikler, enjeksiyon pipetinin hücreyi kaçırmasına veya çekirdekteki beyaz tüylü görüntünün görünmemesine neden olabilir. Bu durumlarda, mikroenjeksiyon pipet ucunu çekirdekle aynı odak düzlemine getirin ve bunu yeni x-ekseni sınırı olarak ayarlayın.Ardından nöronların enjeksiyonuna devam edin. Bazen mikroenjeksiyon pipeti nükleer membrana nüfuz etmez ve sadece çekirdeği iter. Bu durumda, aynı konumda yapılacak ikinci bir enjeksiyon denemesi, çekirdeğe başarılı bir DNA enjeksiyonu ile sonuçlanabilir.Hücrenin şişmesi genellikle istem dışı sitoplazmik enjeksiyona işaret eder. Elli ila yüz çekirdeğe enjeksiyon yapıldıktan sonra, nöronların bulunduğu kabı gece boyunca inkübasyon için inkübatöre geri yerleştirin. 16 saat sonra, başarıyla enjekte edilen nöronlar bir raporlayıcı genin ekspresyonu ile tanımlanabilir.Bu alanda, bir superior servikal ganglion veya SCG nöronuna enjeksiyon yapılmış olup, bu nöron EGFP ekspresyonu ile tanımlanabilir. Endojen G protein kenetli içe doğru doğrultucu potasyum veya grk kanallarına sahip olmayan enjekte edilmemiş SCG nöronları, voltaj rampası sırasında ölçülebilir akımlar oluşturmazlar. Buna karşılık, fonksiyonel bir grk kanalını kodlayan plazmid CD NA'nın başarılı enjeksiyonu, G protein kenetli reseptör agonisti norepinefrine maruz kalındığında, voltaj rampası sırasında büyük akımların oluşmasını sağlar.Burada ölçülen akımlar Kirk kanalları için tipiktir ve norepinefrin ile aktivasyon, içe doğru doğrultma ve putative grk kanal blokerle inhibisyon ile karakterize edilir. Baryum, nöronların çekirdeğine CD NA'nın nasıl enjekte edileceğini size az önce gösterdik. Bu tekniği uygularken dört şeyi hatırlamak önemlidir.Birincisi, enjeksiyondan önce DNA'yı çöktürmek. İkincisi, çekirdeğin net bir şekilde göründüğünden emin olmak. Üçüncüsü, kap içerisinde gezinirken Z ekseni sınırını yeniden ayarlamak.Ve dördüncü olarak, enjeksiyonlar arasında pep tip kalitesini düzenli olarak kontrol edin. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneyinizde başarılar dileriz.

intranuclear-microinjection-dna-into-dissociated-adult-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, elektroporasyon ve kültür fare ve kortikal hipokampal nöronlar aracılığıyla transfect incelemek için gerekli adımları özetliyor. Kısa vadeli kültürleri, uzun vadeli kültürler sinaptogenez ve dendritik omurga analiz çalışmaları için kullanılabilir akson akıbet ve rehberlik çalışmaları için kullanılıyor olabilir.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Burada floresan ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir...

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

Kaynak: Denaxa, M., el al., Kemogenetik Olarak Tasarlanmış Kortikal İnternöron Progenitörlerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Nakli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ilgilenilen geni taşıyan bir plazmit vektörünün embriyonik bir beyin dilimindeki internöron progenitörlerine enjekte edilmesi ve ardından plazmit girişi ve gen ekspresyonu için elektroporasyon prosedürünü göstermektedir. Bu modifiye edilmiş progenitörler daha sonra beyin bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir.

Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki çok önemli bir adımdır. Protokol Burada açıklanan DNA / küçük firkete RNA (ShRNA) nucleofection ve kemirgen doğum sonrası rostral göçmen akımından izole nöroblast ile 3D göç deneyi kullanılarak neuroblast göç aday düzenleyicilerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir.

Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em&gt; In vitro</em

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Bu protokol, beyinde AAV tabanlı bir viral sistem ve hücre tanımlaması ve daha fazla analiz için izin veren bir FLEX synapsin odaklı GFP muhabiri kullanarak doğrudan yeniden programlanmış internöronlar içinde vivo üretmeye yönelik hedefler.

In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

Burada, erken doğum sonrası farelerin korteksine nakledilen kortikal internöron atalarının aktivitesini manipüle etmek için kemogenetik araçları kullanmak üzere tasarlanmış bir protokol sıyoruz.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Bu protokol, beyin dilimlerinde tek nöral kök hücre ve nöroniçine mikroenjeksiyon için robotik bir platform kullanımını göstermektedir. Bu teknik çok yönlüdür ve yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip dokudaki hücreleri izleme yöntemi sunar.

Robotik Mikroenjeksiyon Kullanarak Beyin Dilimlerinde Tek Nöral Kök Hücre ve Nöronların Manipülasyonu

Mevcut protokol, gen düzenleme ve ilaç dağıtımı için yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için adım adım talimatları özetlemektedir.

Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu

Subaraknoid virüs infüzyonu kullanan adeno ilişkili virüsün yaygın olarak verilmesi için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Bu yöntem sadece fare neokortikal nöronlarının yüzeysel katmanlarda yaygın olarak transdüksiyonunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda seçici olmayan bir promotör kullanıldığında bile beşinci katman piramidal nöronlarında transgenin seçici ekspresyonu ile sonuçlanır.

AAV2'nin Subaraknoid Enjeksiyonu ile Fare Neokortikal Nöronlarının Yaygın Transdüksiyonu

Öğrenin, yetişkin memeli nöronlarına cDNA intranükleer mikroenjeksiyonu ile yüksek düzeyde protein ekspresyonu sağlama yöntemini. Bu teknik, bölünme sonrası hücrelerde fonksiyonel çalışmalar için değerlidir.

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Daha fazla video keşfet