Göz hayali Disk Görselleştirme Yardım Roman RFP Reporter Drosophila

Yeni transgenik IRFP Reporter Drosophila hattı, I imajinal diskindeki belirli hücrelerde kırmızı floresan protein veya RFP eksprese eder. Bu transgenik hat, gelişmekte olan gözdeki belirli hücre tiplerinin tanımlanmasına, diseksiyonuna ve etiketlenmesine yardımcı olabilir. Göz imajinal diskini diseke etmek için, gezgin üçüncü instar larvaları bir spatula kullanılarak vialin yan tarafından çıkarılır.

Larvalar daha sonra bir sill guard tabağındaki PBS damlasına yerleştirilir. Göz disklerinin bağlı olduğu ağız kısımları, cımbız kullanılarak larvanın geri kalanından ayrılır; ardından göz diskleri, ağız kısımlarından ve beyinden diseke edilecekleri bir lama aktarılır. Merhaba, ben King's College London Wolfson Yaşa Bağlı Hastalıklar Merkezi'ndeki Joseph Bateman laboratuvarından Amna Cole.

Bugün size Drosophila'dan imaginal göz disklerinin nasıl diseke edileceğine dair bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda nörogenezle ilgili genleri incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Göz imaginal disklerinin diseksiyonuna başlamak için, Sylgard kaplı bir Petri kabına bir damla PBS damlatın. Diseksiyon mikroskobu altında, Sylgard kaplama, diseksiyon sırasında cımbızların zarar görmesini önlemeye yardımcı olacaktır. Ardından, bir spatula kullanarak, üçüncü instar evresindeki bir larva alın ve bunu PBS damlasının içine yerleştirin. Her iki elinizde cımbız tutarak, bir cımbız setiyle larvayı posteriora doğru yaklaşık üçte iki mesafeden kavrayın. Şimdi, diğer cımbız setini kullanarak larvanın anterior ucundaki koyu renkli ağız kısımlarını tutun.

Cımbızları birbirinden uzaklaştırarak lavayı nazikçe ikiye ayırın. Ağız parçaları, göz-beyin kompleksi ile birlikte vücudun geri kalanından ayrılmalıdır. Ardından, bir lam üzerine bir damla PBS damlatın ve ağız parçalarından tutarak diskleri PBS damlasına aktarın.

Yalnızca göz imaginal diskleri RFP eksprese ettiği için, disklerin kontrastını artırmak amacıyla, küresel optik lobların üzerinde yer alan kırmızı floresan dokular olarak kolayca tanımlanabilmeleri için stereo mikroskobu floresans moduna getirin. Fiber optik soğuk ışık kaynağını lama eğik bir açıyla yönlendirin. Göz imaginal diskleri, posteriorda optik sap aracılığıyla optik loblara, anteriorda ise anten diskinden gelen sap aracılığıyla ağız kısımlarına bağlıdır.

Göz imajinal disklerini ayırmak için, parçaları bir cımbızla tutun ve diğer cımbızı kullanarak göz imajinal disklerini larval beyinden ayırın. Ardından, göz imajinal disklerini ağız parçalarından ayırın. Ağız parçaları göz imajinal disklerinden ayrıldıktan sonra, bunları lamdan uzaklaştırın.

Göz imaginal diskleri artık lam üzerinde düz durmalı ve beyin dokusu da dahil olmak üzere her türlü yabancı dokudan arındırılmış olmalıdır. Kalan imaginal disklerin diseksiyonuna devam edin. Tüm göz imaginal diskleri diseke edildikten sonra, lamı hafifçe eğerek fazla PBS'yi kurulamak için küçük bir kağıt havlu parçası kullanın.

Şimdi bir damla vector shield montaj medyumu ekleyin ve üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin. Diskler artık epi-floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntülenmeye hazırdır. Görüntüleme daha sonra yapılacaksa, lamı 4 °C'de saklayın.

RFP en az bir yıl boyunca görünür kalacaktır; Z Serisi görüntüler alınırken, 20x veya 40x objektif kullanılarak bir konfokal veya Zeiss aome mikroskobunda 1 µm aralıklarla çekim yapılmalıdır; ardından mikroskop yazılımı kullanılarak projeksiyon görüntüleri oluşturulabilir. IRFP eksprese eden sineklerden imajinal diskler diseke edilmiş ve Phin ile boyanmıştır. Görüntüleme daha sonra bir Zeiss aome mikroskobunda, 20x objektif kullanılarak 1 µm aralıklarla gerçekleştirilmiştir. Göz diskinin RFP eksprese eden hücreleri kırmızı renkte gösterilmiştir.

Morfogenetik oluk, foid ve boyama ile görselleştirilmiştir ve yeşil renkte gösterilmiştir. Göz diskinin dorsal ventral kutupları kavisli olup katlanma eğilimindedir. Bu kesitler nihai projeksiyon görüntüsünden çıkarılabilir.

Disk tek katmanlı bir epitel olmasına rağmen, çekirdeklerin değişken konumları nedeniyle diskin genel bir görüntüsünü elde etmek için Z Serisi projeksiyonu gereklidir. IRFP raporlayıcısı nükleer lokalizasyonlu olduğundan, burada görülen patern RFP'nin nükleer ekspresyonunu temsil etmektedir. Size drosophila'dan vajinal göz disklerinin nasıl diseke edileceğine dair prosedürü göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken ince uçlu bir cımbız kullanmanız en iyisidir ve bu aşamada kahve tüketimine ara vermeniz muhtemelen faydalı olacaktır. İzlediğiniz için teşekkür eder, tüm deneylerinizde başarılar dileriz.