Name: Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-21T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Öğrenin, Drosophila embriyolarını TEM için nasıl hazırlayacağınızı. Bu yöntem, embriyonik kalp tüpü ve hücresel yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SGK kalp tüpü oluşumu üzerinde yaptığımız çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe (Ödül ID 0.744.165) tarafından desteklenen

<ol><li> Taze 50mm Cacodylate tampon% 12.5 Glutaraldehyde (pH7.4), 20 ml&#39;lik cam sintilasyon flakon içeren bir fiksatif çözüm 2ml hazırlamak. N-heptan 8 ml eklenir ve şiddetle çalkalanır. Iki aşamada ayrı bir izin verin. Üst faz, yer, n-heptan glutaraldehid ile doymuş içeren, temiz bir sintilasyon şişenin içine çıkarın ve bir kenara koyun. Bu sabitleştirici bir çözüm olacaktır. </li><li> Çıkarılabilir bir süzgeçin küçük bir sepet, bir embriyo toplama odası, 0-20 saat embriyolar toplayın. 2-3 dakika süreyle% 50 oranında çamaşır suyu çözeltisi embriyolar iliklerine dış koryon zarı Kaldır veya embriyolar çamaşır suyu yüzeyinde yüzen kadar. , Bir kağıt havlu üzerine ddH20 ve leke embriyolar ile iyice durulayın. </li><li> Forseps kullanarak, embriyolar mesh düşmesine izin fiksatif çözüm içine dechorionated embriyolar ve yer ile kaplıdır süzgeçin pick up. Embriyolar 4 1,5 saat düzeltmek için ° C bir Nutator karıştırma sırasında izin ver. </li><li> Çift taraflı bant ile kaplı bir Petri kabı hazırlayın. Yeniden süspanse kullanarak fiksatif embriyolar çıkarın ve yapıştırıcı bant çözme fiksatif heptan önlemek için Petri dish.Transfer bantlanmış yüzey fiksatif çözüm asgari bir miktarı embriyoları üzerine koyun. Embriyo tek bir katman yapmak için Petri kabı çalkalayın. Heptan buharlaşır kadar kaput Petri kabı yerleştirin. Embriyoların karşılamak için yeterli PBS +% 0.1 Tween20 ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, künt bir tungsten iğne ile El-devitellinize geç dönem 16 embriyolar. 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüpünün içine tamamen yeniden süspanse embriyolar kurtarın. 5-7 Bu mikrofuge&#39;de tüp içinde yürütülmektedir. </li><li> 0.1M Cacodylate tamponu, pH 7.4 embriyoların durulayın ve sonra 0.1M Cacodylate Tampon pH 7.4, oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 1&#39;lik osmiyum tetroksit içeren bir çözüm sonrası düzeltmek. 0.1M Cacodylate tamponu, pH 7.4 olan embriyolar durulayın. </li><li> Etanol ve aseton kademeli dizi embriyolar dehydrate. 10 dakika boyunca% 70 etanol ile 10 dakika boyunca% 50 etanol ile embriyolar dehydrate. Sonra 10 dakika ve 10 dakika her iki% 100 aseton adımları için% 90 aseton kurutmak. </li><li> Aseton çıkarın ve sonra 1:1 EPON Spurr reçine ekleyerek infiltrasyon işlemine başlamak: aseton karışımı embriyoların. Mikrodalga, vakum basıncı altında örnek tutarken Pelco Biowave Pro mikrodalga kullanarak üç dakika için. Mikrodalga sona erdikten sonra ek bir beş dakika için örnek vakum basınç uygulayın. Exchange 01:01 reçine,% 100 EPON Spurr reçine ve mikrodalga ile tekrar vakum basınç altında aseton karışımı. Vakum basıncı altında Exchange% 100 EPON-Spurr reçine son bir kez, ve mikrodalga. </li><li> Tamamen yeniden süspanse kullanarak, embriyolar, bir silikon gömme kalıp mikrofuge&#39;de tüp aktarılır. Embriyonun arka ucundaki kalıp konik kenarı ile hizalar böyle bir satır içine embriyolar hizalayın. 70 ° C fırında gecede pişirin. </li><li> Örnek çıkarın ve kesit için hazırlamak. </li><li> Diamond Histolojik Bıçak ve Richert Ultracut E Mikrotom kullanarak 1 mikrona kadar bölümleri kesme başlayın. Ilk embriyo bölümüne ulaşıldığında dikkat edin. Bu açıdan bakıldığında, numune içine 100μm kesti. Bir döngü kullanarak bir bölümü çıkarın ve bir bardak slayt üzerine yerleştiriniz. Kısaca, sıcak bir plaka üzerinde bölümünde ısı. Bir damla metilen mavisi kullanarak bölüm Leke. Kalp lümen ışık mikroskobu altında tanımlamak. </li><li> Diamond Ultra 45 ° Bıçak ve Richert Ultracut E Mikrotom kullanarak 90nm kesitler. Pick up bakır ızgara üzerinde birden çok bölüm. </li><li> Izgaralar, on dakika boyunca% 50 etanol doymuş% 3 uranil asetat ile boyanmış ve daha sonra çift distile su içinde üç kez durulanır. Sonra, ızgaraları NaOH pelletleri içeren bir CO 2 serbest bir ortam oluşturmak için bir oda 2.5 dakika boyunca kurşun sitrat (10ml çift distile su ve 100ml 10M NaOH çözünmüş 0.04gms) ile boyandı . Izgaraları çift distile su içinde üç kez durulanır. </li><li> Bölüm 80Kv JEOL 1200EX bir elektron mikroskobu ile incelenmesi ve AMT bir dijital kamera ile fotoğraflandı. </li></ol>

<ol><li>Tepass, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Cellular+Junctions+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , (2000).</li>
<li>Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+by+Slit+and+Roundabout+prevents+Shotgun%2FE-cadherin-mediated+cell+adhesion+during+Drosophila+heart+tube+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation.</a> J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).</li>
</ol>

Drosophila embriyonik kalp tüp morfolojilerinden embriyonik gelişim sırasında hücre yapışması ve hücre şekil değişiklikleri çalışmak için değerli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bu yapı eğitimi karşılaşılan zorluklardan biri de kalp tüp lümeni bütün montaj embriyolar görselleştirmek için zor olmasıdır. Bu video daha önce açıklanan prosedürleri 1-2 adapte ortaya tekniği, verimli ve güvenilir bir kalp tüpü ve lümen oluşumu 3 için önemli bir sayıda genotipleri analiz başarılı olduğunu kanıtladı.

elektron mikroskobu için embriyo hazırlık drosophila embriyonik kalp tüpü

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Morfolojilerinden<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyonik kalp tüpü, embriyonik gelişim sırasında hücre göçü, hücre-hücre yapışması ve hücre şekil değişiklikleri eğitim için değerli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bu yapı eğitimi karşılaşılan zorluklardan biri, kalp tüp lümeni yanı sıra kalp tüpü oluşumu için çok önemli olan membran özellikleri, tüm montaj embriyolar görselleştirmek için zor olan kalp tüp küçük boyutu nedeniyle embriyo göreli ve intra-lumenal alan. Transmisyon elektron mikroskobu kullanımı, bu yapıların yüksek büyütme sağlar ve kolayca lümenin boyutunu ve şeklini ortaya koymaktadır kesit, embriyoların incelenmesi avantaj sağlar. Bu video, güvenilir sabitleme için süreç ayrıntılarıyla, gömme ve geç dönem kesit<em&gt; Drosophila</em&gt; Hücre-hücre kavşaklar ve bazal membran dahil olmak üzere kalp tüp lümeni yanı sıra önemli hücresel yapılar görselleştirmek için embriyolar.

Biz fiksasyon, gömme, kesit, bir süreç tarif etmek, ve geç dönem görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyonik kalp tüpü trasmission Elektron Mikroskopi embriyolar. Bu teknik kalp tüp lümeni yanı sıra kalp lümen hatları bazal membran, görselleştirme sağlar.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

Drosophila embriyonik kalp tüpünün morfojenezi; hücre göçü, hücre-hücre adhezyonu ve hücre... incelemek için değerli bir model sistem haline gelmiştir.

Bu video, drosophila embriyonik kalbi üzerinde TEM olarak da bilinen geçirimli elektron mikroskobisinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Kalp; hücre göçü, hücre-hücre adezyonu ve hücre şekli değişikliklerini incelemek için değerli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, kalp lümen şeklinin yanı sıra hücre membranları, hücre-hücre bağlantıları ve bazal membran gibi ultrastrüktürel bileşenlerin görselleştirilmesine olanak tanır.Bu prosedüre başlamak için, drosophila embriyolarının transmisyon elektron mikroskobisi için uygun bir tespit çözeltisi hazırlanır. Ardından, 0 ila 20 saatlik toplama süresine sahip kaplanmış embriyolar tespit çözeltisinin içine yerleştirilir. İşlem tamamlandığında, embriyolar tespit çözeltisinden çıkarılır ve çift taraflı bantla sabitlenmiş haldeyken kolayca işlenebilir hale getirilir.Deiyonize tampon içeren bir Petri kabında, embriyolar tampon içerisinde yüzer ve bir pipet yardımıyla geri kazanılır. Ardından embriyolar fiksasyon işlemine tabi tutulur ve bir dehidrasyon gradyanından geçirilir. Reçine ile infiltre edildikten sonra, hizalandıkları bir gömme kalıba aktarılırlar.Elde edilen blok elmas bıçakla kesilir. Kesitler bakır ızgaralar üzerine alınır, boyanır ve incelenir. Merhaba, ben New Jersey Tıp ve Dişhekimliği Üniversitesi Robert Wood Johnson Tıp Fakültesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'ndeki Sunita Kramer laboratuvarından Nadine Lop.Ben Raj Patel. Ben de PON patolojisinden elektron mikroskobistiyim. Bugün size, transmisyon elektron mikroskopisi için oph embriyolarının hazırlanması ve görüntülenmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz.Laboratuvarımızda Drosophila kalp morfojenezini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse hadi başlayalım. Hadi başlayalım.Drosophila embriyolarını işlemeden önce, embriyo fiksasyonunun Heptan permeasyon yöntemi için taze fiksatif çözelti hazırlayın. Bir çeker ocak içerisinde, Cate tamponunda %12,5 glutaraldehit içeren taze hazırlanmış bir çözeltiden iki mililitreyi bir cam sintilasyon şişesine pipetleyin. Sekiz mililitre ADA heptan ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın.Ardından bir dakika bekleyin. İki fazın ayrılmasına izin verildiğinde, üst faz glutaraldehit ile doyurulmuş ADA heptan içeren tespit çözeltisini barındırır. Üst fazı temiz bir viyale pipetle aktarın ve kenara ayırın. 0 ila 20 saatlik embriyoları toplamak için, çıkarılabilir bir ağ insertine sahip küçük bir sepet olan embriyo toplama odası kullanın.Embriyoların bulunduğu üzüm suyu plağını çıkararak işe başlayın ve ölü sinekleri temizleyin. Ardından, su ve bir resim fırçası kullanarak embriyoları üzüm suyu plağından gevşetin ve su içeren bir sıkma şişe yardımıyla embriyoları embriyo toplama haznesine aktarın.Üzümsü meyve suyu plağındaki embriyoları, üzerlerinde kalan fazla mayadan arındırmak için durulayın. Embriyoları %50'lik çamaşır suyu çözeltisinde iki ila üç dakika boyunca veya embriyolar yüzeye çıkana kadar bekleterek dış korion membranını çıkarın. Distile su ile iyice durulayın ve embriyoları bir kağıt havlu üzerinde kurutun.Pens yardımıyla, artık kaplanmış embriyolarla örtülü olması gereken ağ insertini alın. Embriyoların ağdan düşmesini sağlayarak inserti tespit çözeltisine yerleştirin. Embriyoların, bir orbital sarsıcıda karıştırılırken dört derece Celsius sıcaklıkta bir buçuk saat boyunca tespit edilmesini sağlayın.İnkübasyon tamamlandığında, embriyoları mümkün olduğunca az tespit edici madde ile birlikte çift taraflı bantla kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin. Embriyoları tek bir tabaka halinde yaymak için kabı sallayın ve ardından heptanın buharlaşması için kimyasal çeker ocağa yerleştirin. Embriyolar kuruduktan sonra, embriyoları %0,1 tween içeren tampon çözelti ile kaplayın.Geç evre 16 hücreli embriyolar, bir diseksiyon mikroskobu altında küt uçlu bir tungsten iğne ile işleme alınır. Fixe edilmiş olan ve yüzen embriyolar, bir pastör pipeti ile toplanabilir; embriyolar 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır. Embriyolar 0,1 molar CA₂+ tamponu ile durulanır ve ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca %1 Osmiyum tetroksit ile post-fixe edilir.İnkübasyonun ardından, embriyoları Cate tamponu ile durulayın. Embriyoları tekrar dereceli bir etanol ve aseton serisi ileye dehidre edin. 10 dakika boyunca %50 etanol ile başlayın, ardından 10 dakika %70 etanol ile devam edin, daha sonra 10 dakika %90 aseton ile dehidre edin ve son olarak her biri 10 dakikalık adımlarla %100 aseton işlemine geçin.Asetonu uzaklaştırın. Ein sprey reçinesi ve asetonun bire bir karışımını ekleyerek infiltrasyon işlemine başlayın. Numunenin vakum basıncı altında olduğundan emin olun ve üç dakika boyunca mikrodalgaya tabi tutun.Vakum basıncını beş dakika daha koruyun. Reçine aseton karışımını %100 reçine ile değiştirin ve vakum basıncı altında tekrar mikrodalgaya tabi tutun. Reçineyi değiştirin ve basınç altında mikrodalgaya tabi tutun.Toplam üç infiltrasyon adımı için son bir kez daha uygulayın. Embriyoları mikro santrifüj tüpünden silikon gömme kalıbına aktarın. Embriyoları, posterior uçları kalıbın konik kenarıyla hizalanacak şekilde bir sıra haline getirin.Pastırma gece boyunca 70 °C fırında bekletilir. Ardından, kesitleme işlemi için elde edilen blok çıkarılır. Embriyolardan bir mikrometre kalınlığında kesitler almak için mikrotom kullanılır.Blok boyunca kesitler alındıktan ve embriyoya ulaşıldıktan sonra, görüntüleme öncesinde kalp için uygun derinliğe ulaşılıp ulaşılmadığını belirlemek amacıyla bir halka (loop) kullanarak tek bir kesiti lam üzerine taşıyın. Kesiti bir ısıtıcı tabla üzerinde kısa süre ısıtın ve önce lama bir damla ekleyip ardından kısa süreli ısıtma uygulayarak kesiti metilen mavisi ile boyayın.Tekrar deiyonize su ile durulayın ve kesiti, istenen kesim derinliğinde bir mikroskop altında inceleyin. Alan kısıtlamalarını karşılamak adına, kalp lümeni bir ışık mikroskobu ile tanınabilir olmalıdır. Bloğu, embriyonik kalbi gösteren en fazla beş embriyonun enine kesitini içerecek şekilde yeniden kırpın.Mikrotom kullanarak 90 nanometre kalınlığında kesitler alın. Bakır ızgara üzerine birden fazla kesit yerleştirin. Izgarayı 10 dakika boyunca %3 alüminyum asetat ile boyayın, ardından distile su ile üç kez durulayın.Şimdi, karbondioksitten arındırılmış bir ortam oluşturmak için sodyum hidroksit peletleri içeren bir kapta, ızgarayı iki buçuk dakika boyunca kurşun sitrat ile boyayın. İnkübasyonun ardından, distile su ile üç kez durulayın. Kesitleri 80 kilovolt'ta elektron mikroskobu ile inceleyin ve bir CCD kamera ile fotoğraflayın.Kesim derinliğinin ve evrelemenin uygun şekilde gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğini belirlemek için, dorsal orta hattaki iki kardioblast arasında olgun bir kalp lümeninin oluşmuş olduğu açıkça görülmelidir; hücre membranlarının sağlam olup olmadığını belirlemek için kalp lümenini hücre dışı matris varlığı açısından inceleyin ve kristaların ve mitokondrilerin varlığını araştırın. Böylece size Drosophila embriyonik kalbin ultrastrüktürünün nasıl belirleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken.Drosophila embriyolarının uygun şekilde evrelendirildiğini hatırlamak ve reçine bileşenlerini doğru şekilde ölçüp iyice karıştırmak önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

preparation-embryos-for-electron-microscopy-drosophila-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu teknik immünohistokimya veya elektrofizyolojik kayıt için Drosophila embriyonik neuromusculature ortaya çıkarır. Nöromüsküler gelişiminde erken olayları okuyan veya yumurtadan değil mutantlar elektrofizyoloji yapmak için yararlıdır.

Hasat ve hazırlanması Drosophila</emElektrofizyolojik Kayıt ve Diğer İşlemler> Embriyolar

Larva ve yetişkin kalpte görüntülenmesi için gerekli...

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Bu video, sineğin yetişkin kalbini veya başka bir şekilde Drosophila sırt damarı olarak adlandırılıyor. Özellikli protokol, canlı kalp hazırlıkları için bir diseksiyon prosedürünü göstermektedir.

Drosophila kalbinin hazırlanması: yetişkin sineklerde kalp fizyolojisini incelemek için bir teknik

Kaynak: Jeong, S. Drosophila'da embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modelinin görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2017)Bu video, Drosophila embriyolarında aksonal projeksiyonların görselleştirilmesini göstermektedir. Motor nöronların immünoetiketlenmesi, nöronal yapıları ortaya çıkarmak için hassas diseksiyon ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu toplu olarak ayrıntılı nöronal mimariyi ortaya çıkararak aksonal projeksiyon paternlerini vurgular.

Drosophila'da Embriyonik Motor Nöronların Aksonal Projeksiyon Modellerinin Görselleştirilmesi

Bozulmamış embriyonik ve doğum sonrası kalplerin derinliklerindeki floresan protein etiketli hücreleri hacimsel olarak görüntülemek için bir protokol tanımlıyoruz. Tüm montaj boyama ile birlikte doku temizleme yöntemlerini kullanarak, embriyonik veya doğum sonrası bir kalbin içindeki tek floresan protein etiketli hücreler net ve doğru bir şekilde görüntülenebilir.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Biz bütün Dağı epifluorescent mikroskobu ventrikül belirli MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler disseke fare embriyosu üzerinde kullanarak fare kalp geliştirme incelemek için protokolleri mevcut. Bu yöntem her aşamasında emek yoğun histochemical yöntemleri olmadan fare kalp geliştirme sırasında ventrikül oluşumu doğrudan görselleştirmek için bize izin verir.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Klasik olarak, fare embriyonik kapak primordiyumunun endokardiyumu transversal, koronal veya sagital kesitler kullanılarak analiz edilmiştir. Valvulojenik bölgelerde endokardın en yüzlü, iki boyutlu görüntülenmesi için yeni yaklaşımımız, kapak gelişimi sırasında endokardın düzlemsel polarite ve hücre yeniden düzenleme analizine izin verir.

En Yüz Fare Embriyolarında Düzlemsel Morfogenez Analizi için Endokardiyal Minderin Hazırlanması

Kardiyak progenitör hücrelerin 3D + zaman görüntülemesini sağlayan fare embriyo kültürü ve görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu video araç seti, başarılı canlı görüntüleme için gereken temel becerileri ele alır, aksi takdirde yalnızca metin yayınlarından elde edilmesi zordur.

Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, Drosophila embriyolarını TEM için nasıl hazırlayacağınızı. Bu yöntem, embriyonik kalp tüpü ve hücresel yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

Daha fazla video keşfet