Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

Bu video, drosophila embriyonik arabasında TEM olarak da bilinen transmisyon elektron mikroskobunun nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Kalp, hücre göçünü, hücre hücresi adezyonunu ve hücre şekli değişikliklerini incelemek için değerli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, kalp lümen şeklinin yanı sıra hücre zarları, hücre hücresi bağlantıları ve bazal zar gibi ultra yapısal bileşenlerin görselleştirilmesine izin verir.

Bu işleme başlamak için, drosophila embriyolarının transmisyon elektron mikroskobu için uygun bir fiksasyon solüsyonu hazırlanır. Daha sonra, sıfır ila 20 saatlik bir kaplanmış embriyo koleksiyonu fiksasyon çözeltisine yerleştirilir. Bittiğinde, embriyolar fiksasyon solüsyonundan çıkarılır ve çift taraflı banda takılıyken kullanışlıdır.

Tampon içeren bir Petri kabında, deiyonize embriyolar tampon içinde yüzer ve bir pipet ile geri kazanılır. Daha sonra embriyolar son olarak eklenir ve bir dehidrasyon gradyanına tabi tutulur. Reçine ile sızdıktan sonra, hizalandıkları bir gömme kalıba aktarılırlar.

Elde edilen blok bir elmas bıçakla kesilir. Kesitler bakır ızgaralar üzerinde toplanır, boyanır ve incelenir. Merhaba, ben Robert Wood Johnson Tıp Fakültesi New Jersey Tıp ve Diş Hekimliği Üniversitesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'nde Sunita Kramer'in laboratuvarından Nadine Lop

Adım Raj Patel. Ben de PON patolojisinden elektron mikroskobuyum. Bugün size transmisyon elektron mikroskobu için oph embriyolarının hazırlanması ve görüntülenmesi için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarımızda Drosophila kalp morfogenezini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Başlayın.

Drosophila embriyolarını işlemeden önce, embriyo fiksasyonunun Heptan geçirgenlik yöntemi için taze olarak fiksatif çözelti hazırlayın. Bir çeker ocakta, Cate tamponunda %12,5 glutaraldehit içeren yeni yapılmış bir çözeltiden iki mililitre pipetle bir cam parıldama şişesine pipetleyin. Sekiz mililitre ADA heptan ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın.

Ardından bir dakika bekleyin. İki fazın ayrılmasına izin vermek, üst fazı, fiksatif çözelti olan glutaraldehit ile doyurulmuş ADA heptan içerir. Üst fazı temiz bir şişeye pipetleyin ve bir kenara koyun Sıfır ila 20 saatlik embriyoları toplamak için, çıkarılabilir bir ağ eki olan küçük bir sepet olan bir embriyo toplama odası kullanın.

Embriyoları içeren üzüm suyu tabağını çıkararak başlayın ve ölü sinekleri çıkarın. Sonra su ve boya fırçası kullanarak. Üzüm suyu tabağındaki embriyoları gevşetin, su içeren bir kare şişe kullanarak embriyoları embriyo toplama odasına aktarın.

Üzüm suyu tabağındaki fazla mayanın embriyolarını durulayın. Embriyoları %50'lik bir ağartma solüsyonunda iki ila üç dakika bekleterek veya embriyolar yüzeye çıkana kadar dış corion zarını çıkarın. Damıtılmış su ile iyice durulayın ve embriyoları bir kağıt havlu üzerine koyun.

Forseps kullanarak, şimdi kaplanmış embriyolarla kaplanması gereken ağ ekini alın. Ek parçayı sabitleyiciye yerleştirin ve embriyoların ağdan düşmesine izin verin. Orbital bir rocker üzerinde karıştırırken embriyoların dört santigrat derecede bir buçuk saat sabitlenmesine izin verin.

Kuluçka bittikten sonra, embriyoları mümkün olduğunca az fiksatif alarak çift taraflı bantla kaplı bir Petri kabına yerleştirin. Embriyoları tek bir tabakaya yaymak için tabağı sallayın ve ardından heptanın buharlaşmasına izin vermek için kimyasal kaputun içine yerleştirin. Embriyolar kuruduktan sonra, embriyoları %0.1 ara el de vize içeren bir tampon ile örtün.

Geç evre 16 embriyo, künt tungsten iğnesi ile diseksiyon mikroskobu altında. Mera pipeti ile ize edilmiş, yüzdürülmüş ve kurtarılabilen embriyolar embriyoları 1.5 mililitrelik mikro füge tüpüne aktarır. Embriyoları 0.1 molar kate tamponunda durulayın ve ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca% 1 Osmiyum tetroksit içinde düzeltin.

Kuluçka işleminden sonra embriyoları Cate tamponu ile durulayın. Bir kez daha, embriyoları bir derece etanol ve aseton serisinde kurutun. 10 dakika boyunca %50 etanol ile başlayın, ardından 10 dakika boyunca %70 Etanol ile başlayın, ardından 10 dakika boyunca %90 aseton içinde kurutun ve son olarak her biri 10 dakikalık %100 aseton adımlarına kadar kurutun.

Asetonu çıkarın. Bire bir ein sprey reçinesi ve aseton karışımı ekleyerek sızma işlemine başlayın. Numunenin üç dakika boyunca vakum, basınç ve mikrodalga altında olduğundan emin olun.

Vakum basıncını beş dakika daha koruyun. Reçine aseton karışımını %100 reçine ile değiştirin ve vakum basıncı altında tekrar mikrodalgada pişirin. Reçineyi ve mikrodalgayı basınç altında değiştirin.

Toplam üç sızma adımı için son bir kez. Embriyoları mikro fuge tüpünden silikon gömme kalıba aktarın. Embriyoları, embriyonun arka ucu kalıbın konik kenarı ile aynı hizaya gelecek şekilde bir sıra halinde hizalayın.

Pastırma gece boyunca 70 santigrat derece fırındır. Ardından, bölümlere ayırmak için ortaya çıkan bloğu çıkarın. Embriyolara bir mikrometre kesiti kesmek için bir mikrotom kullanın.

Blok kesit alındıktan ve embriyoya ulaşıldıktan sonra, görselleştirmeden önce kalbi görselleştirmek için uygun derinliğe ulaşılıp ulaşılmadığını belirlemek için tek bir bölümü bir cam slayt üzerine taşımak için bir döngü kullanın. Bölümü sıcak bir plaka üzerinde kısa bir süre ısıtın ve önce slayta bir damla ekleyerek bölümü metilen mavisi ile boyayın. Ve sonra kısaca ısıtma.

Yine deiyonize su ile durulayın ve kesiti mikroskop altında istenen kesit derinliğinde inceleyin. Kalp lümeni, alan kısıtlamalarını karşılamak için bir ışık mikroskobu ile tanınabilir olmalıdır. Bloğu, embriyonik kalbi gösteren enine kesite en fazla beş embriyo içerecek şekilde yeniden kırpın.

Mikrotom kullanarak 90 nanometre kesitler kesin. Bakır bir ızgara üzerinde birden fazla bölüm alın. Izgarayı %3 asetat ile 10 dakika boyayın, ardından damıtılmış suyla üç kez durulayın.

Şimdi karbondioksit içermeyen bir ortam oluşturmak için ızgarayı sodyum hidroksit peletleri içeren bir odada iki buçuk dakika kurşun sitrat ile boyayın. İnkübasyondan sonra, damıtılmış su ile üç kez durulayın. Kesitleri 80 kilovoltta elektron mikroskobu ile inceleyin ve CCD kamera ile fotoğraf çekin.

Kesit derinliği ve evrelemenin uygun şekilde yapılıp yapılmadığını belirlemek için, hücre zarlarının sağlam olup olmadığını belirlemek, kalp lümenini hücre dışı matris varlığı açısından incelemek ve Christie ve mitokondri varlığını aramak için dorsal orta hattın iki kardiyo patlaması arasında olgun bir kalp lümeninin oluştuğu açık olmalıdır. Bu yüzden size drosophila embriyonik kalbinin ultra yapısını nasıl belirleyeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken.

Drosophila embriyolarını düzgün bir şekilde sahnelemeyi ve reçinenin bileşenlerini doğru bir şekilde ölçmeyi ve bunları iyi bir şekilde karıştırmayı hatırlamak önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler ve denemenizde iyi şanslar.