Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

Bu video, drosophila embriyonik kalbi üzerinde TEM olarak da bilinen geçirimli elektron mikroskobisinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Kalp; hücre göçü, hücre-hücre adezyonu ve hücre şekli değişikliklerini incelemek için değerli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, kalp lümen şeklinin yanı sıra hücre membranları, hücre-hücre bağlantıları ve bazal membran gibi ultrastrüktürel bileşenlerin görselleştirilmesine olanak tanır.

Bu prosedüre başlamak için, drosophila embriyolarının transmisyon elektron mikroskobisi için uygun bir tespit çözeltisi hazırlanır. Ardından, 0 ila 20 saatlik toplama süresine sahip kaplanmış embriyolar tespit çözeltisinin içine yerleştirilir. İşlem tamamlandığında, embriyolar tespit çözeltisinden çıkarılır ve çift taraflı bantla sabitlenmiş haldeyken kolayca işlenebilir hale getirilir.

Deiyonize tampon içeren bir Petri kabında, embriyolar tampon içerisinde yüzer ve bir pipet yardımıyla geri kazanılır. Ardından embriyolar fiksasyon işlemine tabi tutulur ve bir dehidrasyon gradyanından geçirilir. Reçine ile infiltre edildikten sonra, hizalandıkları bir gömme kalıba aktarılırlar.

Elde edilen blok elmas bıçakla kesilir. Kesitler bakır ızgaralar üzerine alınır, boyanır ve incelenir. Merhaba, ben New Jersey Tıp ve Dişhekimliği Üniversitesi Robert Wood Johnson Tıp Fakültesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'ndeki Sunita Kramer laboratuvarından Nadine Lop.

Ben Raj Patel. Ben de PON patolojisinden elektron mikroskobistiyim. Bugün size, transmisyon elektron mikroskopisi için oph embriyolarının hazırlanması ve görüntülenmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda Drosophila kalp morfojenezini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse hadi başlayalım. Hadi başlayalım.

Drosophila embriyolarını işlemeden önce, embriyo fiksasyonunun Heptan permeasyon yöntemi için taze fiksatif çözelti hazırlayın. Bir çeker ocak içerisinde, Cate tamponunda %12,5 glutaraldehit içeren taze hazırlanmış bir çözeltiden iki mililitreyi bir cam sintilasyon şişesine pipetleyin. Sekiz mililitre ADA heptan ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın.

Ardından bir dakika bekleyin. İki fazın ayrılmasına izin verildiğinde, üst faz glutaraldehit ile doyurulmuş ADA heptan içeren tespit çözeltisini barındırır. Üst fazı temiz bir viyale pipetle aktarın ve kenara ayırın. 0 ila 20 saatlik embriyoları toplamak için, çıkarılabilir bir ağ insertine sahip küçük bir sepet olan embriyo toplama odası kullanın.

Embriyoların bulunduğu üzüm suyu plağını çıkararak işe başlayın ve ölü sinekleri temizleyin. Ardından, su ve bir resim fırçası kullanarak embriyoları üzüm suyu plağından gevşetin ve su içeren bir sıkma şişe yardımıyla embriyoları embriyo toplama haznesine aktarın.

Üzümsü meyve suyu plağındaki embriyoları, üzerlerinde kalan fazla mayadan arındırmak için durulayın. Embriyoları %50'lik çamaşır suyu çözeltisinde iki ila üç dakika boyunca veya embriyolar yüzeye çıkana kadar bekleterek dış korion membranını çıkarın. Distile su ile iyice durulayın ve embriyoları bir kağıt havlu üzerinde kurutun.

Pens yardımıyla, artık kaplanmış embriyolarla örtülü olması gereken ağ insertini alın. Embriyoların ağdan düşmesini sağlayarak inserti tespit çözeltisine yerleştirin. Embriyoların, bir orbital sarsıcıda karıştırılırken dört derece Celsius sıcaklıkta bir buçuk saat boyunca tespit edilmesini sağlayın.

İnkübasyon tamamlandığında, embriyoları mümkün olduğunca az tespit edici madde ile birlikte çift taraflı bantla kaplanmış bir Petri kabına yerleştirin. Embriyoları tek bir tabaka halinde yaymak için kabı sallayın ve ardından heptanın buharlaşması için kimyasal çeker ocağa yerleştirin. Embriyolar kuruduktan sonra, embriyoları %0,1 tween içeren tampon çözelti ile kaplayın.

Geç evre 16 hücreli embriyolar, bir diseksiyon mikroskobu altında küt uçlu bir tungsten iğne ile işleme alınır. Fixe edilmiş olan ve yüzen embriyolar, bir pastör pipeti ile toplanabilir; embriyolar 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır. Embriyolar 0,1 molar CA₂+ tamponu ile durulanır ve ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca %1 Osmiyum tetroksit ile post-fixe edilir.

İnkübasyonun ardından, embriyoları Cate tamponu ile durulayın. Embriyoları tekrar dereceli bir etanol ve aseton serisi ileye dehidre edin. 10 dakika boyunca %50 etanol ile başlayın, ardından 10 dakika %70 etanol ile devam edin, daha sonra 10 dakika %90 aseton ile dehidre edin ve son olarak her biri 10 dakikalık adımlarla %100 aseton işlemine geçin.

Asetonu uzaklaştırın. Ein sprey reçinesi ve asetonun bire bir karışımını ekleyerek infiltrasyon işlemine başlayın. Numunenin vakum basıncı altında olduğundan emin olun ve üç dakika boyunca mikrodalgaya tabi tutun.

Vakum basıncını beş dakika daha koruyun. Reçine aseton karışımını %100 reçine ile değiştirin ve vakum basıncı altında tekrar mikrodalgaya tabi tutun. Reçineyi değiştirin ve basınç altında mikrodalgaya tabi tutun.

Toplam üç infiltrasyon adımı için son bir kez daha uygulayın. Embriyoları mikro santrifüj tüpünden silikon gömme kalıbına aktarın. Embriyoları, posterior uçları kalıbın konik kenarıyla hizalanacak şekilde bir sıra haline getirin.

Pastırma gece boyunca 70 °C fırında bekletilir. Ardından, kesitleme işlemi için elde edilen blok çıkarılır. Embriyolardan bir mikrometre kalınlığında kesitler almak için mikrotom kullanılır.

Blok boyunca kesitler alındıktan ve embriyoya ulaşıldıktan sonra, görüntüleme öncesinde kalp için uygun derinliğe ulaşılıp ulaşılmadığını belirlemek amacıyla bir halka (loop) kullanarak tek bir kesiti lam üzerine taşıyın. Kesiti bir ısıtıcı tabla üzerinde kısa süre ısıtın ve önce lama bir damla ekleyip ardından kısa süreli ısıtma uygulayarak kesiti metilen mavisi ile boyayın.

Tekrar deiyonize su ile durulayın ve kesiti, istenen kesim derinliğinde bir mikroskop altında inceleyin. Alan kısıtlamalarını karşılamak adına, kalp lümeni bir ışık mikroskobu ile tanınabilir olmalıdır. Bloğu, embriyonik kalbi gösteren en fazla beş embriyonun enine kesitini içerecek şekilde yeniden kırpın.

Mikrotom kullanarak 90 nanometre kalınlığında kesitler alın. Bakır ızgara üzerine birden fazla kesit yerleştirin. Izgarayı 10 dakika boyunca %3 alüminyum asetat ile boyayın, ardından distile su ile üç kez durulayın.

Şimdi, karbondioksitten arındırılmış bir ortam oluşturmak için sodyum hidroksit peletleri içeren bir kapta, ızgarayı iki buçuk dakika boyunca kurşun sitrat ile boyayın. İnkübasyonun ardından, distile su ile üç kez durulayın. Kesitleri 80 kilovolt'ta elektron mikroskobu ile inceleyin ve bir CCD kamera ile fotoğraflayın.

Kesim derinliğinin ve evrelemenin uygun şekilde gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğini belirlemek için, dorsal orta hattaki iki kardioblast arasında olgun bir kalp lümeninin oluşmuş olduğu açıkça görülmelidir; hücre membranlarının sağlam olup olmadığını belirlemek için kalp lümenini hücre dışı matris varlığı açısından inceleyin ve kristaların ve mitokondrilerin varlığını araştırın. Böylece size Drosophila embriyonik kalbin ultrastrüktürünün nasıl belirleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken.

Drosophila embriyolarının uygun şekilde evrelendirildiğini hatırlamak ve reçine bileşenlerini doğru şekilde ölçüp iyice karıştırmak önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.