Name: İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-26T16:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Öğrenin, çok fotonlu floresan kurtarma yöntemiyle difüzyon katsayılarını nasıl ölçeceğinizi. Bu teknik, floresan boya moleküllerinin serbest difüzyonunu incelemek için kullanılır ve biyolojik sistemlerde moleküler dinamikleri anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Umut Scholar Ödülü Savunma Era Bölümü (No W81XWH-05-0396) ve Edward B. Brown III Biyomedikal Bilimler Ödülü Pew Scholar tarafından finanse edildi.

1. Optik hizalayın. MP-sıkı bağlamak deney için önemli ekipman şunlardır: mod-kilitli bir lazer kaynağı, Pockel Hücre (ışın modülasyon), nabız jeneratör, renk değişikliği, objektif lens, floresan emisyon filtresi, kapılı photomultiplier tüp, ve bir veri kayıt sistemi (foton sayacı ve çok kanallı ölçekleyici). 2. Güvenli monitör yetkilerini belirler. <ol><li> Örnek içinde floresan üretmek için düşük, ama makul, güç lazer zayıflatır. </li><li> Örnek içinde odaklanın. </li><li> Beklenen floresan kurtarma daha çok uzun bir zaman ölçeği üzerinde entegre bir foton sayacı ayarlayın. Mikroskop yazılım odak hacmi (bu bir nokta tarama ile elde edilir) numune içinde sabit tutulan makul bir sayıda foton sayımı verileri kaydeder. </li><li> Gücünü artırmak ve foton sayımı verileri başka bir dizi çekmek. Foton sayılarında artış gücünü artırmak açısından önemli ölçüde azaltmak için görünene kadar tekrarlayın. </li><li> Arsa log (güç) bir fonksiyonu olarak log (foton sayısı). Monitör sırasında beyazlatma iki yamacında bir sapma gösterir. Monitörün güç olarak bu cut off bir güç seçin, ancak makul bir sinyal gürültü oranı sağlar. </li></ol> 3. Pulse jeneratör ve çok kanallı ölçekleyici giriş parametreleri belirleyin. <ol><li> Belirleyin geri-of-the-zarf edebiyat ve / veya Stokes-Einstein denklemi, difüzyon denklemi dayalı difüzyon katsayısı ve iyileşme süresi tahminleri. </li><li> Darbe jeneratörü ve ölçekleyici gerekli parametre değerleri ayarlayın. <ol class="lalpha"><li> Darbe jeneratörü, önceden çamaşır suyu ve ağartıcı kez ayarlayın. Başparmak kuralları iyi bir ön-beyazlatıcı beklenen yarısında iyileşme süresi daha 1-2 kat daha büyük olması gerektiğini ve çamaşır suyu beklenen yarısında iyileşme süresi onda biri olmalıdır. </li><li> Ölçekleyici, yaklaşık bir yarım çamaşır suyu süresi bin genişliği ve kayıt başına kutularının sayısını ayarlamak seçtiğiniz bin genişliği ve kayıt başına kutuları ürün beklenen tam iyileşme artı ön yaklaşık eşit veya daha büyük olduğu gibi -Çamaşır suyu ve ağartıcı kez. </li><li> Darbe jeneratörü dönün ve sadece bin genişliği kez kayıt başına kutuların sayısı ürünü ters daha küçük bir değere eşit pre-bleach/bleach/monitor dizisi frekansını ayarlamak. * </li><li> Son olarak, kayıtların sayısını ayarlamak / seçtiğiniz monitör güçte sinyal yoğunluğuna göre ölçekleyici tarama. * Darbe jeneratör tam bir pre-bleach/bleach/monitor dizisi (1/frequency) için zaman ölçekleyici veri toplama süresi (bin genişlik x kutuları / kayıt) daha fazla olduğu çok önemlidir. Bu kriterleri yerine değilse, birden fazla ağartıcı tetikler ölçekleyici tek bir kayıt içinde görünebilir. </li></ol></li><li> Monitörün güç, önceden belirlenmiş kabul edilebilir bir seviyeye ayarlayın. Monitör beyazlatma test sırasında belirlenen beyazlatma kesim üzerinde 200 mW veya çamaşır suyu gücünü ayarlayın. Bu güçler PC kristal boyunca farklı gerilim olarak ayarlanır, her ikisi de. </li><li> Mikroskop Seal, ışıkları kapatmak PMT açmak, mikroskop yazılımı üzerinde bir nokta tarama başlamak, sonra darbe jeneratörü ve ölçekleyici başlar. </li><li> 1) ön-bleach floresan, 2) floresan hemen post-çamaşır suyu, ve 3) veri setinin sonunda floresan: eğrisinin çizilmesi ve üç önemli nokta işaretleme çıkan kurtarma eğrisi analiz edin. Floresans değerleri öncesi ve hemen sonrası yarı-iyileşme süresi daha iyi tahmin etmek için çamaşır suyu. Kullanın. </li><li> Yarı-iyileşme süresi, bu tahmin, önceden çamaşır suyu, çamaşır suyu için yeni değerlerini belirlemek için daha önce belirtilen başparmak kuralları ve bin genişliği süreleri kullanın. Ayrıca, tam iyileşme elde etmek için gerekli süreyi daha iyi tahmin etmek için veri kümesinin sonunda öncesi ağartıcı floresan ve floresan kullanın. Genel bir kural olarak, veri, verilerin ikinci yarısı için rapor edilmesi tam iyileşme sağlar bir süre için alınmalıdır. </li><li> Eğrisi güçlü bir çamaşır suyu ve pürüzsüz bir iyileşme sergiliyor kadar darbe jeneratörü ve ölçekleyici parametrelerini ayarlayın, yeni bir eğri parametreleri almak ve ince ayar devam. Mümkünse, çamaşır suyu süresi göz önünde bulundurun ve başparmak kural altına düşürülmelidir. Çok sığ, ya da çok derin, çamaşır suyu elde edilir, çamaşır suyu gücü de ayarlanabilir. </li></ol> 4. Test uyarım doygunluk. <ol><li> Önceden belirlenmiş uygun monitör ve çamaşır suyu güçler, MP-sıkı bağlamak eğrilerini kullanarak, bir dizi alır. Uygun matematiksel formu ve doğrusal olmayan en küçük kareler uydurma algoritması (bkz. aşağıdaki "Veri Analizi") kullanarak, ön ağartıcı floresan normalize her kurtarma, analiz edin. Çamaşır suyu derinliği parametre monte değeri kaydedin.</li><li> MP-sıkı bağlamak eğrileri birbirini izleyen seriler alma ve analiz çamaşır suyu güç değerlerini artırarak devam edin. </li><li> Arsa log (güç) bir fonksiyonu olarak log (çamaşır suyu derinliği parametresi). Herhangi bir sapma, bir yamaç iki uyarma doygunluk gösterir. Güçlü bir çamaşır suyu verimi çamaşır suyu güç seçin, ancak doygunluk neden olmaz. </li></ol> 5. MP-sıkı bağlamak eğrileri çekmeye devam edin. <ol><li> Yukarıdaki gibi, bütün parametreler düzgün koyacaktır, eğriler çekmeye devam edin. </li></ol> 6. Veri Analizi. <ol><li> Floresan veri öncesi, çamaşır suyu ve ağartıcı veri, bu veri seti ve ayarlamak kaldırın t = 0 hemen sonrası-ağartıcı floresan değeri ile karşılık gelir. </li><li> -Bleach öncesi ortalama floresan açısından ortaya çıkan floresan kurtarma Normale. </li><li> Uygun bir matematiksel model ve MATLAB lsqcurvefit fonksiyonu olarak doğrusal olmayan, en küçük kareler uydurma algoritması kullanılarak normalize eğrisi sığdır. Burada sunulan model, difüzyon ve konvektif akışı hem de etkilemiş floresan kurtarma hesapları: <img src="/files/ftp_upload/1636/1636eq.jpg" alt="Denklem" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Denklem"> F o ön ağartıcı ortalama floresan nerede çamaşır suyu derinliği parametresi, β, τ D karakteristik uzadıya iyileşme süresi, R eksenel radyal (w r) genişlikleri karesine oranı (w z) iki foton odak hacmi, τ vx = w r / v x, τ Vy = w r / v y τ vz = w, z / v z ve v 2 = v x 2 + v y 2 + v, z 2- konvektif akış hızı. Görüntü düzlemi ile sınırlı akışı için, τ vz → ∞ ve 1 / τ vx + 1 / τ Vy 1 / τ vr ile değiştirilebilir. Konvektif akışının olmaması, pay hem de üsteller 1 gidip ifade sadece iki uydurma parametreleri, β ve τ D büyük ölçüde azaltılmış oluyor . Difüzyon katsayısı D = w r 2 / 8τ D olarak kolayca hesaplanır. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar. <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Temsilcisi çamaşır suyu ve FITC-BSA için kurtarma eğrisi. Iyi bir iyileşme eğrisi verilerin ikinci yarısında tam bir iyileşme floresan ile, güçlü bir çamaşır suyu ve pürüzsüz bir iyileşme sergiliyor. <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 FITC-BSA Normalize kurtarma eğrisi (kırmızı) ve en küçük kareler ilgili uyum (siyah). Bu uyum, literatür ile tutarlı, difüzyon katsayısı, 52.9 um2 / s verir.

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 60, 73-76 (1990).</li>
<li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).</li>
</ol>

Photobleaching sonra çok foton floresan kurtarma gücü 3D çözünürlük ile kalın örnekleri prob yeteneği yatıyor. 1990 yılında gelişme bu yana, MP-sıkı bağlamak hücre gövdeleri, ex vivo kalın bir doku dilimleri ve in vivo doku ve interstisyumda difüzyon katsayısı (ya da analog ulaşım parametreleri) belirlemek için kullanılır olmuştur. Bu makalede, biz, deneysel parametreler ayar verileri alma ve kurtarma eğrileri analiz, MP-sıkı bağlamak gibi deney, ışın yolu hizalamak için uygun bir prosedür çal...

<table><tbody><tr><td>Ti:safir lazer</td><td>Newport Corp.</td><td>Mai Tai</td><td></td></tr><tr><td>Pockels Hücresi</td><td>Conoptics</td><td>350-80</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Tarama Mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Kısa geçiren dikroik ayna</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>670 DCSX-2P</td><td></td></tr><tr><td>Fotomultiplier tüp</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Foton sayacı</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 400</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı ölçekleyici/ortalayıcı</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 430</td><td></td></tr><tr><td>Darbe Jeneratörü</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG 535</td><td></td></tr><tr><td>FITC-BSA</td><td>Invitrogen</td><td>--</td><td></td></tr></tbody></table>

İki foton floresan kurtarma üzerinden photobleaching sonra difüzyon katsayıları Ölçüm

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Photobleaching sonra çok floresan kurtarma makromoleküllerin difüzyon katsayısı (ya da analog ulaşım parametreleri) ölçmek için kullanılan bir mikroskopi tekniği ve hem de uygulanabilir<em&gt; In vitro</em&gt; Ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyolojik sistemleri. Photobleaching sonra çok floresan kurtarma sonra ışın azaltıcı ve izleme photobleached moleküllerin yerine ilgi diffüz bölge dışından hala floresan moleküller olarak floresan yoğun bir lazer flaş kullanmadan floresan örnek bir bölge içinde ilgi photobleaching tarafından yapılır . Biz Pockel Hücre (lazer modülatör) ve örnek lazer tarama kutusu ve objektif lens ile optik yol boyunca lazer ışını hizalayarak gösteri başlayacak. Basitlik için, floresan boya, sulu bir örnek kullanabilirsiniz. Daha sonra uygun deneysel dahil olmak üzere bizim örnek parametreleri, monitör ve ağartma güçler, çamaşır suyu süresi, bin genişlikleri (foton sayma), ve floresan iyileşme süresi belirleyecek. Sonra, kurtarma eğrileri, büyük ölçüde gelişmiş akış için (National Instruments, Austin, Teksas) LabVIEW ile otomatik hale getirilebilir bir süreç ayırdığınız için prosedür anlatacağız. Son olarak, difüzyon katsayısı MATLAB (Mathworks, Natick, MA) gibi yazılımlar kullanarak kolayca programlanabilir en küçük kareler uydurma algoritması kullanılarak uygun bir matematiksel model kurtarma veri sıkıştırılmak suretiyle belirlenir.

Bu yazıda, photobleaching sonra çok foton floresan kurtarma kullanarak difüzyon katsayıları ölçmek için prosedür anlatacağız. Biz örnek optik yol boyunca lazer hizalayarak ve uygun deneysel parametrelerin belirlenmesi ile başlayacak, daha sonra devam üreten ve nihayet uydurma floresan kurtarma eğrileri.

İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm

Fotobezme sonrası çoklu floresan geri kazanımı, difüzyon katsayısını (veya benzer taşıma parametrelerini) ölçmek için kullanılan bir mikroskopi tekniğidir...

Çok fotonlu floresans kaybı sonrası geri kazanım prosedürü, serbestçe difüze olan floresan boya molekülleri içeren bir örnekle kolayca gösterilebilir. İlk olarak, lazerin odak hacmi içerisindeki D moleküllerinden bir referans floresans seviyesi oluşturmak için örneğe düşük yoğunluklu bir lazer ışını gönderilir.Ardından, odak hacmi içindeki boya moleküllerinin bir kısmını fotobezleme (photobleaching) amacıyla kısa süreli, yüksek yoğunluklu bir lazer flaşı gönderilir. Son olarak, lazer ışını önceki düşük yoğunluk seviyesine indirilir ve fotobezlenmiş moleküller dışarı doğru difüze olurken yerlerini odak hacminin dışından gelen hâlâ floresan özellik gösteren moleküllerin almasıyla floresans izlenir. Elde edilen zamana bağlı floresans eğrisi, difüzyon katsayısını belirlemek için analiz edilir.Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'ndeki Edward Brown Laboratuvarı'ndan Kelly Sullivan. Bugün sizlere çok fotonlu fotobleyking sonrası floresans geri kazanımının nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda hem in vitro hem de in vivo biyolojik sistemlerdeki difüzyonu incelemek için bu tekniği kullanıyoruz.Haydi başlayalım. Başlamak için istenen laze

measuring-diffusion-coefficients-via-two-photon-fluorescence-recovery

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, hücre-hücre temaslarında hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi tespit etmek için floresan dalgalanma spektroskopisinin kullanımını göstermektedir. Bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgilenilen transmembran yapışma reseptörünü eksprese ederek ve spektral olarak ayrılmış iki floresan etiketi barındıran iki farklı hücre popülasyonunu karıştırarak, farklı renkli floresan ile iki komşu hücrenin reseptörleri arasındaki trans-etkileşim, floresan yoğunluğundaki dalgalanmalardaki...

Hücre Temaslarında Protein Etkileşimini İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar.

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Bir damlacık tek tabakasını düz bir monotabaka üzerine birleştirerek sıvı-akışkan arayüzünde yüzey aktif bir türün yanal difüzyonunu ölçmek için yeni bir teknik sunuyoruz.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılarak primer immün hücrelerin zarlarında protein difüzyonunu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yazıda, floresan etiketleme için antikorların kullanımı gösterilmektedir.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Öğrenin, çok fotonlu floresan kurtarma yöntemiyle difüzyon katsayılarını nasıl ölçeceğinizi. Bu teknik, floresan boya moleküllerinin serbest difüzyonunu incelemek için kullanılır ve biyolojik sistemlerde moleküler dinamikleri anlamanıza yardımcı olur.

İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm

Daha fazla video keşfet