İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm
26 Şubat 2010
Bu yazıda, photobleaching sonra çok foton floresan kurtarma kullanarak difüzyon katsayıları ölçmek için prosedür anlatacağız. Biz örnek optik yol boyunca lazer hizalayarak ve uygun deneysel parametrelerin belirlenmesi ile başlayacak, daha sonra devam üreten ve nihayet uydurma floresan kurtarma eğrileri.
Çoklu foton floresansı. Foto ağartma işleminden sonra iyileşme, serbestçe yayılan bir floresan boya molekülleri numunesi ile kolayca gösterilir. İlk olarak, lazerin odak hacmi içindeki D moleküllerinden bir referans floresan seviyesi oluşturmak için numuneye düşük yoğunluklu bir lazer ışını gönderilir.
Daha sonra, odak hacmi içindeki boya moleküllerinin bir kısmının foto-ağartılmasında kısa bir yüksek yoğunluklu lazer flaşı gönderilir. Son olarak, lazer ışını önceki düşük yoğunluk seviyesine zayıflatılır ve floresan, foto ağartılmış moleküller dışa doğru yayılırken ve odak hacminin dışından hareketsiz floresan moleküller ile değiştirilirken izlenir. Zaman eğrisinin bir fonksiyonu olarak elde edilen floresan, difüzyon katsayısını elde etmek için analiz edilir.
Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'ndeki Edward Brown Laboratuvarı'ndan Kelly Sullivan. Bugün size foto ağartma işleminden sonra çoklu foton floresan geri kazanımını nasıl gerçekleştireceğinizi göstereceğiz. Bu tekniği laboratuvarımızda hem in vitro hem de in vivo biyolojik sistemlerde difüzyonu incelemek için kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Başlamak için istenen lazer dalga boyunu ayarlayın ve uygun filtreyi fotoğraf çarpan tüpünün veya PMT'nin önüne yerleştirin. PCAL hücresine zarar vermemek için lazer gücünü 200 miliwatt veya daha azına ayarlayın.
Pcal hücresinin yukarı akışında dört şeklinde yönlendirilmiş iki ayna vardır. Bu aynalar, lazer ışınını pcal hücresi boyunca hizalamak için gerekli ve yeterlidir. pcal hücresi önyargı denetleyicisindeki voltaj ofsetini sıfıra ayarlayın, lazer hücresinden geçen lazer yolunu, lazer ön ve arka camlarda ortalanacak şekilde ayarlayın.
Ön camdaki kirişi ortalamak için şekil dörtte yukarı akıştaki aynayı ve kirişi arka pencerede ortalamak için şekil dörtte aşağı akıştaki aynayı kullanın. Şimdi pcal hücre kristalindeki voltajı maksimum değere ayarlayın. Uygun değer dalga boylarına bağlıdır ve pcal hücre kullanım kılavuzunda bulunabilir.
Şekil dördüncüdeki aynaları, pcal hücresinden gelen çıkış gücü maksimize edilene kadar pcal hücresinin yukarı akışında ayarlayın. Şimdi kristal üzerindeki voltajı sıfıra getirin ve pcal hücresinden gelen çıkış gücünü en aza indirmek için önyargı denetleyicisindeki voltaj ofsetini ayarlayın. PCAL hücresindeki lazer gücü olayını deney için gereken değere geri döndürün.
Şimdi mikroskoba geçerek, standartlaştırılmış bir floresan numuneye iyi bir görsel odaklanma elde edin. Burada sabit floresan polen taneleri kullanıyoruz. Odaklandıktan sonra, mikroskobu kapatın, pcal hücre kristali üzerindeki voltajı değiştirerek lazer gücünü numuneyi görüntülemek için uygun bir seviyeye ayarlayın.
Son olarak, ışıkları kapatın ve PMT'yi açın. Standartlaştırılmış numunenin tekrar görüntü taramasını başlatın ve numunenin keskin bir görüntüsü elde edilene kadar pcal hücresinin aşağı akışındaki aynaları ayarlayın. Şimdi, örneklem içinde güvenli monitörün halk odağını güçlendirdiğini belirlemeye bakalım.
Bu videonun amacı doğrultusunda, bir cam slaytta bir çöküntü içinde tutulan ve bir kapak kızağı ile kapatılan bir sulu boya örneği kullanacağız. Numune içinde floresan üretmek için lazeri düşük ancak makul bir güce zayıflatın. Mikroskobu kapatın, çıktıyı PMT'den foton sayacına yönlendirin.
Işıkları kapatın, PMT'yi açın ve mikroskop yazılımında bir nokta taraması başlatın. Foton sayacını, beklenen floresan geri kazanım süresinden çok daha uzun bir zaman ölçeğinde entegre olacak şekilde ayarlayın ve makul sayıda veri noktası kaydedin. Gücü artırın ve başka bir dizi foton sayımı verisi alın.
Foton sayımlarındaki artış önemli ölçüde azalana kadar gücü artırmaya devam edin. Güç artışı grafiği ile ilgili olarak, foton günlüğü, güç günlüğünün bir fonksiyonu olarak sayılır. İki eğimden herhangi bir sapma ağartmayı gösterir.
Monitör sırasında, bu sınırın altında olan makul bir monitör gücü seçin. Şimdi çok kanallı ölçekleyiciye ve darbe üretecine giriş parametrelerini belirleyelim. Nabız üreteci üzerinde.
Ön öğrenme süresini, beklenen yarı toparlanma süresinden bir ila iki kat daha büyük olacak ve ağartma süresini, ölçekleyicide beklenen yarı toparlanma süresinin 10'da biri olacak şekilde ayarlayın. Bölme genişliğini ağartma süresinin yaklaşık yarısına ayarlayın ve kayıt başına bölme sayısını, seçtiğiniz bölme genişliğinin ve kayıt başına bölme sayısının çarpımı, beklediğiniz tam kurtarma süresinden daha büyük olacak şekilde ayarlayın. Ayrıca, preble ve bleach süreleri darbe üretecine geri döner ve preble ve bleach dizisinin frekansını, kutu genişliğinin çarpımının tersinden ve kayıt başına biniş sayısının çarpımından biraz daha küçük bir değere eşit olarak ayarlayın.
Son olarak, seçtiğiniz monitör gücündeki sinyal yoğunluğuna bağlı olarak ölçekleyicide tarama başına kayıt sayısını ayarlayın. Şimdi monitör gücünü güvenli bir seviyeye ayarlayın ve ağartma gücünü, monitör ağartma testi sırasında belirlenen ağartma sınırının yaklaşık 200 miliwatt üzerine ayarlayın. Bu güçlerin her ikisi de al hücre kristal contası boyunca farklı voltajlar olarak ayarlanır, mikroskop ışıkları kapatır.
PMT'yi açın. Görüntüleme yazılımında bir nokta taraması başlatın. Ardından darbe üretecini ve ölçekleyiciyi çalıştırın.
Ortaya çıkan toparlanma eğrisini analiz etmek için üç önemli noktayı işaretleyin. Preble floresan, ağartıcıdan hemen sonra floresan ve veri setinin sonundaki floresan. Yarı iyileşme süresini daha iyi tahmin etmek için çamaşır suyu öncesi ve hemen sonrası floresan değerlerini kullanın.
Şimdi, preble ağartıcı değerlerini güncellemek ve genişlik sürelerine başlamak için önceki adımlarda özetlenen kuralları kullanın. Yeni bir eğri alın ve ortaya çıkan eğri güçlü bir ağartıcı ve pürüzsüz bir toparlanma sergileyene kadar parametreleri değiştirmeye devam edin. Ağartma derinliği parametresinin günlüğünü güç günlüğünün bir fonksiyonu olarak çizerek uyarma doygunluğunu kontrol edin.
İki eğimden herhangi bir sapma, uyarma doygunluğunu gösterir. Güçlü bir ağartıcı veren ancak doygunluğa neden olmayan bir ağartma gücü seçin. Son olarak, uygun parametreler belirlendikten sonra, ilgilendiğiniz numunenin foto ağartma veya MP FP eğrilerinden sonra çoklu foton floresan geri kazanımı almaya devam edin.
Şimdi, her iki ham MP frap verisinin temsili sonuçlarını, teel takılmış normalleştirilmiş bir MP F sarma eğrisinde, difüzyon katsayısında, ham MP F frap verilerinin, güçlü bir ağartıcı ve pürüzsüz toparlanmanın temsili sonuçlarını göstereceğiz. Verilerin ikinci yarısı için tam kurtarma raporlanırken, verilere sığdırmak için. Önce geri kazanımı ortalama preble floresansına normalleştiriyoruz ve ardından doğrusal olmayan kiralık kareler uyumu gerçekleştiriyoruz.
Uygun modele göre. Her iki veri seti de sulu floresein ve verim difüzyon katsayılarında alınmıştır. Literatürle tutarlı olarak, foto ağartma deneyinden sonra çoklu foton floresan geri kazanımının nasıl gerçekleştirileceğini size gösterdik.
Bu prosedürü gerçekleştirirken, deneysel parametrelerinize, özellikle ağartma süresine ve ağartma ve izleme güçlerine protokolde tanımlanan güvenli sınırlara dikkat etmeniz ve ayarlamanız önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fotobleaching sonrası çok fotonlu floresan geri kazanımını kullanarak difüzyon katsayılarının ölçülmes prosedürünü açıklar. Süreç, lazerin optik yolun boyunca numuneye hizalanmasını ve floresan geri kazanım eğrilerinin uydurulmasını içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Floresan mikroskopi
- Difüzyon ölçümü
- Fotobleaching teknikleri
Arka Plan
- Fotobleaching sonrası çok fotonlu floresan geri kazanımı, moleküler difüzyonu incelemek için kullanılan bir tekniktir.
- Yöntem, numunede floresan moleküllerin dinamikleri hakkında bilgiler sağlar.
- Difüzyon katsayılarını anlamak, çeşitli biyolojik uygulamalar için önemlidir.
- Prosedür, floresan boya moleküllerinin serbestçe difüzyon gösteren numunelerine uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Difüzyon katsayılarını ölçme prosedürünü göstermek.
- Alandaki araştırmacılar için ayrıntılı bir metodoloji sağlamak.
- Biyolojik sistemlerdeki moleküler dinamikleri anlamayı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Düşük yoğunluklu lazer ışını, referans bir floresan seviyesi oluşturur.
- Yüksek yoğunluklu lazer flaşı, boya moleküllerinin bir bölümünü fotobleaching yapar.
- Foto-bleached moleküller difüzyon gösterir ve yerlerini aldıkça floresans izlenir.
- Floresan geri kazanım eğrileri analiz edilerek difüzyon katsayıları elde edilir.
Ana Sonuçlar
- Prosedür, floresan moleküllerin difüzyon katsayılarını etkili bir şekilde ölçer.
- Floresan geri kazanım eğrileri, moleküler dinamikler hakkında nicel veriler sağlar.
- Yöntem tekrarlanabilirdir ve çeşitli numunelere uygulanabilir.
- Sonuçlar, biyolojik bağlamlarda moleküler etkileşimlerin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sonuçlar
- Fotobleaching sonrası çok fotonlu floresan geri kazanımı, difüzyon katsayılarını ölçmek için değerli bir tekniktir.
- Özetlenmiş metodoloji, araştırmacılar tarafından moleküler dinamikleri incelemek için kullanılabilir.
- Bu tekniğin daha fazla uygulanması, biyolojik süreçler hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Measuring diffusion coefficients via two-photon fluorescence recovery after photobleaching provides quantitative insights into molecular dynamics in biological systems, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The technique enables reproducible, label-free assessment of macromolecular transport, informing assay development and predictive confidence in lead identification workflows. Its applicability to both in vitro and in vivo systems enhances translational continuity and reduces biological uncertainty in preclinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying diffusion behavior of macromolecules in disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct measurement of molecular mobility in native or engineered environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing diffusion-based metrics that correlate with target engagement and binding kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline diffusion parameters.
- Reproducibility: Delivers quantitative, fluorescence-based readouts that support assay standardization across runs and laboratories.
- Scalability: Integrates with automation platforms like LabVIEW for enhanced throughput in lead screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to in vivo biological systems, enabling assessment of diffusion in tissue-like environments.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing consistent biophysical readouts across model systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying molecular transport properties that influence drug distribution and target access.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, providing biophysical data that informs molecular design and optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how macromolecular diffusion changes under experimental conditions, clarifying pathway and target behavior.
- Screening: Enables assay readiness through standardized fluorescence recovery measurements that ensure consistent compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative diffusion coefficients via least-squares fitting of recovery curves, enabling objective comparison of molecular variants.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing diffusion measurements in both in vitro and in vivo systems, supporting extrapolation across scales.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable biophysical platform for assessing molecular dynamics across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around molecular mobility and interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined laser parameters, bleach protocols, and automated data acquisition.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets based on diffusion-derived biophysical profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets with favorable molecular transport characteristics for downstream development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy, photobleaching techniques, and fluorescence quantification.
- Depends on instrumentation including pulsed lasers, Pockels cells, photon counters, and compatible scanning systems.
- Necessitates standardization of laser power, bleach duration, and bin width settings across users and sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from aqueous dye models to complex biological samples like cells or tissue.
- Limited by the need for fluorescent labeling or intrinsic fluorescence, which may require optimization for low-abundance targets.
