Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Bio flux sistemi, kontrollü saf akış altında canlı hücre testlerini çalıştırmak için otomatik bir cihaz ve mikroakışkan bir cihazdır. Bu sistem, mikron ölçekli akış hücresi cihazlarını SBS standart Kuyu plakalarına entegre etmek için kuyu plakası mikroakışkan teknolojisini kullanır. BioFlex, yüksek verim ve azaltılmış kan hacimleri ile trombosit adezyonu ve agregasyon çalışmaları yapmak için kullanılabilir.

Floresan boya ile etiketlenmiş tam kan kuyucuklara eklenir ve daha sonra kanallardan akar. Kontrollü saf akış altında, ilaç bileşiklerinin ve diğer değişken parametrelerin varlığında trombosit yapışmasını ve agregasyonunu ölçen yüksek çözünürlüklü mikroskopi verileri üretilir. Merhaba, ben Flexion Biosciences'taki RD laboratuvarından Mike Schwartz.

Bugün size trombosit adezyon testlerinde mikroakışkan akış hücrelerinin kullanımı için bir prosedür göstereceğiz. Bu protokolü laboratuvarımızda çeşitli vasküler biyoloji testleri için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Sığır eti, akış hücresi deneyini çalıştırmadan önce, bio flux plakasının mikroakışkan kanalları, bu deneyde kullanılacak olan kollajen ile ilgilenen bir protein kaplaması ile hazırlanmalıdır. Biyo akı plakasının 24 deneysel kanalının her biri, bu plaka için bir giriş kuyusuna ve bir çıkış kuyusuna bağlanır. Giriş kuyusu, kanalı besleyen sol kuyudur ve çıkış kuyusu sağdadır, kollajeni bir stoğu mililitre başına 200 mikrogramlık bir konsantrasyona seyreltin.

0.02 molar asetik asitte, kullanılan her kanal için 20 mikrolitreye ihtiyaç duyulacaktır. Bu deney 11 kanal gerektirdiğinden, 200 mikrolitre kollajen kaplama yapın. Bir kanal, mikro pipet ucu ile yumuşak yineleme ile kaplanmamış olarak karıştırılmış olarak kalır.

Sıvıyı kuyunun iç zımbasına dağıtmak için bir mikro pipet kullanarak her bir kanala 20 mikrolitre kaplama ekleyin. Burada gösterildiği gibi ilgilenilen mikroakışkan kanalın sarı boya ile beslenmesi, trombosit yapışması ve agregasyonu için negatif bir kontrol olarak kollajen içermeyen bir kanal içerir. Kollajen kaplama ilgili tüm kanallara eklendikten sonra, arayüzü plakaya takın.

bio flux 1000 arayüzünü kullanıyorsanız, her iki mandalı da sahneye sıkıştırabilirsiniz. Bio flux 200 arayüzünün ilk parmağını kullanıyorsanız, dört vidayı sıkın. Ve her şey ayarlandıktan sonra, tamamen sıkmak için tork sürücüsünü kullanın.

Tork sürücüsü maksimuma ulaştığında tıklayacaktır. Bio flux yazılımındaki manuel modu kullanarak, prizden santimetre kare başına 2D hızında ilgilenilen kanallara perfüzyon uygulayın. Giriş kuyusunu bulmak için mikroskopta düşük güçlü bir objektif kullanın ve karşı iç zımbanın sıvıyla dolduğunu gözlemleyin.

Önce küçük bir sıvı görmeli, birkaç dakika sonra iç zımbayı yavaşça doldurmalı ve giriş iç zımbası dolduğunda, yazılımda durdurma düğmesine basarak tüm kanallarda bolluğu durdurmalısınız. Plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bu kuluçka süresi boyunca, bir saatlik kuluçka süresinin sonunda tam kanı hazırlamaya başlayabilirsiniz.

Kan hazırlandıktan sonra, arayüzü çıkarın ve çıkışa bir mililitre PBS artı kalsiyum ve magnezyum iyonları ekleyin. Çıkıştan bolluğu santimetre kare başına iki dinde iyi bir şekilde başlatın ve 10 dakika boyunca bolluğa devam edin. 10 dakika sonra bolluğu durdurun Arayüzü çıkardıktan sonra, fazla PBS'yi hem giriş hem de çıkış kuyularından çıkarın.

İç zımbayı dolduran sıvıyı asla çıkarmayın. Kanalları tıkamak için, her çıkışa bir mililitre engelleme solüsyonu ekleyin. Kullanılacak kuyu, çıkıştan kuyudan iki santimetre karede perfüstür ve perfüzyona 10 dakika devam eder.

10 dakika sonra bolluğu durdurun ve arayüzü çıkarın. Kanallar artık hazırdır ve plaka kollajen ile kaplanırken gün boyunca kullanılabilir. Bir saatlik bir inkübasyon sırasında, oruç tutan bir bireyden alınan taze insan kanı, görüntüleme ve plakaya akması için hazırlanmalıdır.

Kan, sodyum sitrat, antikoagülan içine çekilmeli ve toplandıktan sonraki üç saat içinde kullanılmalıdır. İlk olarak, hacim başına bir ila 1000 hacim seyreltmede kana DMSO'da dört milimolar bir kalsiyum M stoğu ekleyin. Dört mikromolar kalsiyum elde etmek için hafifçe ters çevirme ile karıştırılır.

Daha sonra, bir mililitre kalsiyum etiketli kanı on bir nokta beş mililitre mikro tüpe dağıtın. İstenilen seyreltmede her tüpe GP iki B üç a inhibitör antikoru ekleyin. Nazik inversiyon ile karıştırılmış bir antikor negatif kontrolü ve ilgisiz bir antikor pozitif kontrolü eklediğinizden emin olun.

Akış hücresi deneyini çalıştırmadan önce tüpleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, her 10 dakikada bir hafifçe ters çevirerek karıştırın. Kollajen için bio flux kontrol modülünde otomatik bir protokol kurulmalıdır. Bir. Kanı çıkıştan 10 dakika boyunca on dokuz santimetre karede çalıştırmak için bir protokol oluşturun.

Peki, BioFlex 1000 iş istasyonu kullanılarak, fitz dalga boyunda ve hızlandırılmış ayarda istenen aşama konumlarının elde edilmesini içeren veri toplama parametreleri ayarlanmalıdır. Bu protokol için tipik bir görüntü elde etme planı, toplam 10 dakikalık bir süre boyunca her 30 saniyede bir 10 x objektif kullanılarak yakalanacak kanal başına bir görüş alanı içerecektir. Ek görüş alanları ve alternatif TimeLapse ayarları da mümkündür.

Otomatik protokol ve veri toplama parametreleri ayarlandıktan sonra, BioFlex plakasına geri dönün ve iç zımbalar dışında kanalın her iki tarafındaki sıvıyı çıkarın. Hızlı çalışmaya özen göstererek, her koşuldan 500 mikrolitre kanı her kanalın çıkış kuyularına yerleştirin. Çıkış kuyucuklarının kanı iletmek için kullanıldığına dikkat edin, çünkü bu, görüntüleme bölgesine giden en kısa yoldur ve kanın kollajen kaplamaya daha hızlı bir reaksiyon göstermesini sağlayacaktır.

Ek olarak, antikor içermeyen kontrol kanını, kollajen ile kaplı ve sadece tıkalı bir kanala yerleştirin. Plakayı BioFlex 1000 iş istasyonu mikroskobuna yerleştirin ve cl'yi arayüzde sıkıştırın. Başlangıç noktası olarak tanımlanan ilk kalibrasyon noktasını bularak aşama listesi kalibrasyonunu gerçekleştirin.

Ardından ikinci kalibrasyon noktasını bulun ve işaretleyin. Bu kalibrasyonu uygun aşama listesine uygulayın. Bu, plakadaki tüm görüntüleme konumlarının otomatik olarak bulunabilmesini sağlar.

Sahneyi, BioFlex montaj yazılımında pozlama süresi ve kazanç gibi kan seti uyumları e görüntü yakalama parametrelerini içeren kanallardan birine taşıyın. İstediğiniz düğmeye tıklayarak uygun iş akışını başlatın. Bu, akış protokolünü ve görüntü alımını aynı anda başlatacaktır.

Deneyin sonunda, plakayı BIOFLU 1000 iş istasyonundan çıkarın ve kurumsal yönergelere göre atın. Bio flux sisteminin kollajen kaplı mikroakışkan kanallarının kullanılması. Tedavi edilmeyen kontrol kan örneği ile zamanla agresif trombüs oluşumu gözlenir.

Buna karşılık, kaplamasız kanal ile trombüs oluşumu gözlenmez. Yakın zamanda gerçekleştirilen bir deneyde, kontrol koşulları altında agregaların ortalama boyutu 2000 mikrometre kare idi. GP iki B üç A, burada gösterildiği gibi kollajene yapışma ile aktive edildiğinde trombosit etkileşimlerinin ve agregasyon stabilizasyonunun güçlü bir aracıdır, anti GB iki B üç a antikoru ile inkübe edildikten sonra, saf maruziyetten bir saat önce, trombüs boyutunda bir azalma ve trombüs oluşum sıklığında bir azalma gözlenir.

Doza bağlı bir yanıt tipik olarak on dokuz santimetre karede gözlenebilir ve bu özel inhibitör için IC 50 değeri 17 nanomolar idi. Bu donör için antikor kontrolüne kıyasla maksimum inhibisyon 10 dine santimetre karede% 11 idi. Santimetre kare başına 200 D'ye veya 5.000 ters saniyeye kadar tam kan deneyleri yapmak için 48 kuyulu yüksek bir kesme plakası da mevcuttur.

Fizyolojik olarak ilgili vasküler biyoloji deneyleri yapmak için mikroakışkan akış kanallarını nasıl kullanacağınızı size gösterdik. Bu protokolü yaparken, kolajeni doğru tamponda seyreltmeyi unutmamak önemlidir. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için her zaman doğru pipetleme tekniğini kullanın ve her zaman laboratuvarınızın biyogüvenlik düzenlemelerine uyun.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.