VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Burada embriyo toplama prosedürünü görüyoruz. Sinekleri viallerden beş bölmeli bir toplama odasının tüplerine aktarın. Ardından odanın üzerine bir grape agri plate yerleştirin ve sineklerin birkaç saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin.

Embriyolar uygun aşamaya geldiğinde, bir fırça yardımıyla onları üzüm plakasından çift taraflı banda aktarın. Şimdi embriyoları konik yapılarından çıkararak yuvarlayın ve ventral yüzeyleri alt tarafa gelecek şekilde bir agar blok üzerine sırayla dizin. Ortada, üzerinde dikdörtgen şeklinde balmumu ve bir parça çift taraflı bant bulunan bir lam görüyoruz. Çift taraflı bandın bir ucunu, üzerinde dizili embriyoların bulunduğu bloğun üzerine ters çevirin ve embriyoları lama aktarmak için onlara değdirin.

Bu aşamada embriyolar hemen sırt üstü konuma geleceklerdir. Embriyoları kaplayacak şekilde, lam üzerindeki balmumu dikdörtgenle çevrili alana PBS ekleyin. Üstteki görsel lamın yan görünümünü, alttaki görsel ise üst görünümünü göstermektedir.

Cam bir disseksiyon iğnesiyle viel membranı boyunca bir kesik açın. Embriyoların beyin bölgesine dokunarak onları yukarı kaldırın ve cam üzerindeki sıralara taşıyın. Ardından, her bir embriyoyu filet yapmak için dissekt edin.

Prosedürün sonunda, yan yana dizilmiş filet embriyolarının bulunduğu bir lam elde etmiş olacaksınız. Artık fiksasyon için hazırdır. Merhaba, ben Caltech biyoloji bölümündeki Kaizen laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı olan Peter Lee.

Merhaba, ben Ashley Wright; Kaizen Laboratuvarı'nda Caltech'te lisansüstü öğrencisiyim. Ben Kaizen, Caltech'te profesörüm ve araştırma grubum meyve sineklerinde sinir sisteminin gelişimi üzerine çalışıyor. Bugün size canlı opal embriyolarının diseksiyonu için bir prosedür göstereceğiz.

Bu yöntemleri yetim reseptör ligandlarını aramak için kullandık. Bunu, reseptör füzyon proteinleri ile embriyoların canlı boyanması yoluyla, hücre yüzey proteinlerini aşırı ifade eden hat koleksiyonlarını tarayarak gerçekleştiriyoruz. Ayrıca laboratuvarda bu prosedürü embriyonik fenotipleri incelemek ve genetik taramalar yürütmek için de kullanıyoruz.

Yönlendirme fenotipleri üzerindeki motor eylemler için bir eksiklik taraması gerçekleştirdim. Hadi başlayalım. Peter size bunun nasıl yapıldığını gösterecek.

Başlamak için, bir spatula kullanarak, embriyo toplama odasının her bir fıçısına karşılık gelecek şekilde, bir üzüm agri yumurta toplama plağına bir miktar maya pastası yerleştirin. Ardından, sinekleri uyutmak için sinek tüplerine karbondioksit gazı enjekte edin. Birkaç yüz sineği doğrudan toplama odasına aktarın.

Ardından hazneyi yumurta toplama plakasıyla kapatın ve aşağı doğru bastırın. 20 inç uzunluğunda bir etiketleme bandı şeridi kullanarak, agar plakasının ortasından başlayarak hazneyi ve plakayı birbirine sabitleyin. Bant, yumurta toplama plakasının üzerine binecektir. Sinekler uyandıktan sonra, yatay konumda oda sıcaklığında karanlıkta iki veya üç saat inkübe edin; inkübasyonun ardından sinekleri aşağıya doğru vurun ve toplama plakasını değiştirin.

Çıkarılan plakanın her bir sektöründe 100'den az embriyo mevcutsa, yeterli sayıda embriyo toplayana kadar iki saatlik toplama işlemlerine devam edin. Toplanan embriyolar, beraberindeki yazılı protokolde belirtilen özelliklere göre birleştirilebilir.

Embriyoları yaşlandırmak için, bir Petri kabı kapağına 90 milimetrelik daire şeklinde ıslatılmış bir filtre kağıdı parçası yerleştirin ve embriyoların bulunduğu toplama plağını bunun üzerine ters şekilde koyun. Plağı istenen süre boyunca ve istenen sıcaklıkta inkübe edin; bir lam üzerine çift taraflı yapışkan bant yerleştirerek embriyo evrelemesi ve ayıklaması için bir lam hazırlayın. Ardından, lamın üzerine dikdörtgen bir üzüm agar bloğu yerleştirin.

Yumurta toplama kabı, 10 ila 15 embriyodan oluşan beş ila 10 sırayı alabilecek kadar büyük olmalıdır. Embriyolar istenen aşamaya ulaştığında, embriyoları inkübatörden çıkarın. Yaşlandırılmış embriyoları toplama plakasından çift taraflı yapışkan banda aktarın.

Islak bir boya fırçası kullanarak embriyoları bant üzerine eşit şekilde yayın. Bir GFP diseksiyon mikroskobu altında, genotipi belirten uygun GFP ekspresyonu için SOAR embriyolarını inceleyin. Bu deneyde genotipleme, balancer curly arm, GFP ekspresyonu göstermeyen embriyolar seçilerek gerçekleştirilir.

Embriyo genotipleme kullanılan balansöre göre değişiklik göstereceğinden, bu adımın gerçekleştirilmesi hakkında daha fazla bilgi için lütfen ekteki yazılı protokole bakınız. Ardından, küt uçlu bir diseksiyon iğnesi kullanarak embriyoları çift taraflı yapışkan bant üzerinde nazikçe yuvarlayarak sabitleyin. 16. evrede bağırsak üç bant şeklinde bölünmüştür.

Bunun ardından, bağırsak kuyruğa yakın bölgelerde diyagonal bantlar geliştirmeye başlar, sonra kıvrılır ve embriyo daha belirgin hale gelir. Sonra, her bir embriyoyu korionun veya diğer embriyoların üzerinde yuvarlamak için diseksiyon iğnesini kullanın. Bantla temastan kaçınarak embriyoyu kaldırın ve üzüm agarı bloğuna aktarın.

Kaplanmış embriyoları, dorsal tarafları agar slabına gelecek ve posterior uçları aşağıya bakacak şekilde slab üzerinde hizalayın. Ardından lamı, ıslak filtre kağıdı içeren bir Petri kabına yerleştirin ve embriyoları istenen yaşa ulaşana kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Diseksiyon için, küçük dikdörtgen bir çift taraflı yapışkan bant parçası keserek canlı diseksiyon lamı hazırlayın. Bandı, bir balmumu kalemi kullanarak super frost plus lamın bir ucuna yakın bir yere yerleştirin.

Bandın etrafına, lam genişliğinde ve 30 ila 40 milimetre uzunluğunda bir dikdörtgen çizin. Balmumu ile bant arasında yaklaşık üç milimetre boşluk olmalıdır. Ardından, lamı ters çevirip hizalanmış embriyoların üzerine nazikçe indirerek bandın onlarla temas etmesini sağlayın ve embriyoları büyük plaka slabından bandın üzerine aktarın.

Embriyolar, posterior uçları aşağı gelecek şekilde yönlendirilmelidir. Aktarımdan sonra embriyolar lam üzerinde dorsal yüzleri yukarı bakacak şekilde konumlanacaktır; hemen ardından, enjeksiyon iğnesi gibi bir iğne çekici ile hazırlanmış bir cam diseksiyon iğnesi kullanarak, balmumu dikdörtgenini doldurmak için embriyoların üzerine bir miktar XPBS ekleyin. Embriyonun posterior ucundan başlayarak dorsal orta hattı boyunca kesin.

Şimdi embriyonun ön ucuna dokunarak onu yukarı kaldırın. Alttan başlayarak, embriyoyu tampon çözelti içinde tutarak bant şeridinin sağına aktarın. Embriyoları disseke etmeye ve aktarmaya devam ederek, lam üzerinde agri slab'daki her bir satıra karşılık gelen düzenli bir embriyo sırası oluşturun.

Diseksiyon iğnesini kullanarak, vücut duvarı kapakçıklarını lamın üzerine nazikçe bastırın. Yüzeydeki materyallerin gerilmesini veya yerinden çıkmasını önleyin. İğne, yalnızca vücut duvarının dorsal kenarlarındaki anterior ve posterior köşelerle temas etmelidir.

Motor aksonlar bu kadar uzağa uzanmadığı için. Dorsal bölgede, tüm embriyolar transfer edilip lama sabitlendikten sonra kırılacağı için lamın iğnelerine dokunmaktan kaçının. Beyin bölgesinden dört bağırsak kısmını keserek ve tüm bağırsağı embriyodan uzaklaştırarak her bir embriyodaki bağırsağı çıkarın.

Arka bağırsağı lam üzerine yerleştirin. Tüm diseksiyon işlemleri tamamlandığında, iki adet past pipeti kullanarak oda sıcaklığındaki %5 formaldehyde çözeltisini aynı anda balmumu dikdörtgeninin bir köşesine verin ve çözeltiyi karşı köşeden uzaklaştırın. Sabitleyici çözeltiyi, toplamda yaklaşık altı mililitre hacim kullanarak üç kez değiştirin.

Embriyoları fiksatif çözelti içerisinde 45 dakika boyunca inkübe edin. Menisküsün embriyolarla temas etmemesi çok önemlidir, aksi takdirde embriyolar zarar görecektir. Fiksatif çözeltinin çoğunu uzaklaştırmak için bir pastör pipeti kullanın.

İki pastör pipeti yöntemi kullanılarak PB ile 3 kez yıkayın. Ardından embriyoları permeabilize etmek için PBT ile üç kez yıkayın. Bu adım aynı zamanda embriyoların menisküse karşı hassasiyetini azaltır.

Son yıkamadan sonra, lamı eğerek PBT'yi dikkatlice uzaklaştırın ve fazla solüsyonu almak için balmumu ile çevrelenmiş alanın köşesine kısa süreliğine bir Kim wipe dokundurun. Önceden doldurulmuş bir pipetle hemen 200 µL bloklama solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika boyunca bloklama yapın. Ardından, bloklama solüsyonunu bir Kim wipe yardımıyla silerek uzaklaştırın.

Ardından, bloklama solüsyonunda seyreltilmiş 200 µL istenen primer antikoru hemen ekleyin. Lamı nemlendirilmiş bir plakaya yerleştirin ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Bu deneyde, motor aksonları etiketlemek için monoklonal antikor 1D4 kullanılmıştır.

Ertesi gün, kapları dört derece Celsius'tan çıkarın ve embriyoları sallama platformu üzerinde PBT ile her yıkama için en az 15 dakika boyunca üç kez yıkayın. Tüm yıkama adımlarında, sallama işlemi sırasında lamın tamamen suya gömülmesi için yeterli PBT olduğundan emin olun. Embriyolar yıkandıktan sonra, lamı daha önce yapıldığı gibi bloke edin.

Bloklamadan hemen sonra, 200 µL sekonder antikor ve bloklama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin; burada kas liflerini etiketlemek için Rodamin Phin ile birlikte Alexa 488 Go anti-Sle sekonder antikor kullanılmıştır. Ardından, sallama platformunda her yıkama için en az 15 dakika olacak şekilde PBT ile üç kez yıkayın.

Kalıntı deterjanı temizlemek için slaytları farklı bir tepsiye aktarın. Ardından PBS ile beşer dakikadan iki kez yıkayın. Slaytı PBS'den çıkarın, kuyucukta kalan PBS'nin çoğunu bir kimyasal temizleme beziyle (chem wipe) alın ve hemen 500 µL %70 gliserol ekleyin.

Gliserolün embriyo ile aynı kırılma indisine sahip olması nedeniyle, bu adımın gerçekleştirilmesi boyanmayı daha görünür kılacaktır; embriyoları oda sıcaklığında iki saat veya 4 °C'de gece boyunca berraklaştırın. Ardından, gliserolü bir kim wipe ile temizleyin. Gliserolün neredeyse tamamının uzaklaştırılması embriyoların düzleşmesine neden olurken, daha az gliserolün uzaklaştırılması daha üç boyutlu bir yapı ile sonuçlanacaktır.

Gliserol uzaklaştırıldıktan sonra, bir numaralı bir lamella yerleştirin. Embriyolar görüntüleme için hazırdır; diseke edilmiş ve boyanmış embriyolar immünofloresan mikroskopi ile görselleştirilebilir. Burada, diseke edilmiş bir embriyo, motor akson etiketleme antikoru 1D4 ile boyanmıştır.

Bu görüntü, HRP immünohistokimyasının immünofloresans kullanılarak görselleştirme için uygulandığı, daha yaygın olarak görülen görüntülere benzerlik göstermektedir. Motor akson dallarının detaylarının daha net görüldüğü, daha yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesi mümkündür. Aktine bağlanan rho domine işaretli phin ile yapılan eş boyama, kasların eş zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır.

Bu, HRP boyaması ile elde edilebilenden daha net bir kas tabakalanması ve organizasyon görüntüsü sağlar. Burada, 1D dört veya motor aksonlar yeşil renkte, Fein veya kas ise kırmızı renkte gösterilmiştir. Canlı Drosophila embriyolarının mutant hat koleksiyonlarından nasıl diseke edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürleri uygularken, lio, armadillo, GFP, dengeli stoklar gibi kolay hatlarla başlamak ve her seferinde sadece birkaç hat üzerinde çalışmak önemlidir.

Diseksiyonlar konusunda daha uzmanlaştıkça ve hızlandıkça, günde 10 hatta kadar işlem yapabilirsiniz; bu da yaklaşık 20 günlük bir süre içinde 200 civarında mutant hattından oluşan bir koleksiyonu taramanıza olanak tanır. Dolayısıyla, tüm adımları uygulama konusunda uzmanlaştığınızda bu gerçekten çok verimli bir prosedürdür. İşte bu kadar, izlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.