VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Burada embriyo toplama prosedürünü görüyoruz. Sinekleri şişelerden beş namlulu bir toplama odasının tüplerine aktarın. Daha sonra haznenin üstüne bir üzüm tarım tabağı koyun ve sineklerin birkaç saat yumurta bırakmasına izin verin.

Embriyolar doğru aşamada olduğunda, onları üzüm balığından bir boya fırçası ile çift yapışkanlı bant haline getirin. Şimdi embriyoları konlarından çıkarın ve ventral tarafları ile bir agar bloğu üzerine hizalayın. Ortada, dikdörtgen bir balmumu ve bir parça çift çubuklu bant içeren bir slayt görüyoruz Bir ucunda, sıralanmış embriyoların bulunduğu bloğun üzerindeki çift çubuklu bandı ters çevirin ve onları slayta aktarmak için embriyolara dokundurun.

Şimdi hemen sırt tarafı yukarı bakacak şekilde olacaklar. Embriyoları kaplayacak şekilde balmumu dikdörtgeni ile çevrelenen slayt alanına PBS ekleyin. Üst kısımda slaydın yandan görünümü, alt kısım ise üstten görünüm gösterir.

Bir cam diseksiyon iğnesi ile viel zarı boyunca bir yarık kesin. Embriyoları beyin bölgesine sokun, kaldırın ve camın üzerindeki sıralara yerleştirin. Sonra bir fileto yapmak için her embriyoyu inceleyin.

İşlemin sonunda, fileto embriyo sıraları içeren bir slaytınız olacaktır. Artık düzeltmeye hazır. Merhaba, ben Peter Lee, Caltech'teki biyoloji bölümündeki Kaizens laboratuvarında bir posterim.

Merhaba, ben Ashley Wright, Kaizens Lab'de Caltech yüksek lisans öğrencisiyim. Ben Kaizen, Caltech'te profesörüm ve araştırma grubum meyve sineklerinde sinir sisteminin gelişimi üzerinde çalışıyor. Bugün size canlı opal embriyoları incelemek için bir prosedür göstereceğiz.

Yetim reseptör ligandlarını aramak için bu yöntemleri kullandık. Bunu, embriyoların reseptör füzyon proteinleri ile canlı boyanması ile eksprese eden hücre yüzey proteinleri üzerindeki çizgi koleksiyonlarını tarayarak yapıyoruz. Bu prosedürü laboratuvarda embriyonik fenotipleri incelemek ve genetik taramalar yapmak için de kullanıyoruz.

Rehberlik fenotipleri üzerinde motor eylemler için bir eksiklik taraması yaptım. Öyleyse başlayalım. Peter size bunun nasıl yapıldığını gösterecek.

Başlamak için, bir embriyo toplama odasının fıçılarının her birine karşılık gelen bir üzüm agri yumurta toplama plakasına bir maya ezmesi lekesi yerleştirmek için bir spatula kullanın. Daha sonra, sinekleri uyutmak için sinek şişelerine karbondioksit gazı enjekte edin. Birkaç yüz sineği doğrudan toplama odasına aktarın.

Ardından, hazneyi yumurta toplama plakası ile örtün ve aşağı doğru bastırın: 20 inç uzunluğunda bir etiketleme bandı şeridi kullanarak, agar plakasının ortasından başlayarak hazneyi ve plakayı birbirine sarın. Bant, yumurta toplama plakası üzerinde üst üste binecektir. Sinekler uyandıktan sonra, inkübasyonu takiben yatay pozisyonda iki veya üç saat karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin, sinekleri aşağı hafifçe vurun ve toplama plakasını değiştirin.

Çıkarılan plakanın her sektöründe 100'den az embriyo varsa. Yeterli embriyo toplanana kadar iki saatlik koleksiyonlar yapmaya devam edin. Toplanan embriyolar, ekteki yazılı protokoldeki özelliklere göre bir araya getirilebilir.

Embriyoları yaşlandırmak için, bir Petri kabının kapağına ıslak bir parça 90 milimetre daire filtre kağıdı yerleştirin ve embriyolar baş aşağı gelecek şekilde toplama plakasını yerleştirin. Plakayı istenen süre boyunca ve istenen sıcaklıkta inkübe edin, bir slayt üzerine çift taraflı yapışkan bant yerleştirerek embriyo evreleme ve sıralama için bir slayt hazırlayın. Ardından S slaytının üzerine dikdörtgen bir üzüm agar levhası yerleştirin.

Yumurta, 10 ila 15 embriyodan oluşan beş ila 10 sıra tutacak kadar büyük olmalıdır. Embriyolar istenen aşamaya ulaştığında, embriyoları inkübatörden çıkarın. Yaşlanmış embriyoları toplama plakasından çift taraflı yapışkan banda aktarın.

Islak bir boya fırçası kullanarak embriyoları bant boyunca eşit şekilde yayın. Bir GFP diseksiyon mikroskobu altında, genotipi gösteren uygun GFP ekspresyonu için SOAR embriyoları. Bu deneyde, dengeleyici kıvırcık kol GFP'nin ekspresyonu olmayan embriyolar seçilerek genotipleme gerçekleştirilir.

Embriyo genotiplemesi kullanılan dengeleyiciye bağlı olarak değişeceğinden, bunun gerçekleştirilmesi hakkında daha fazla bilgi için lütfen ekteki yazılı protokole bakın. Adım. Daha sonra, körelmiş bir diseksiyon iğnesi kullanarak embriyoları çift taraflı yapışkan bant boyunca nazikçe yuvarlayarak kaplayın. 16. aşamada, bağırsak üç gruba ayrılmıştır.

Bundan sonra, bağırsak kuyruğa yakın çapraz bantlar geliştirmeye başlar ve daha sonra sarılır ve embriyo daha net hale gelir. Daha sonra, her bir embriyoyu corion veya diğer embriyoların üzerine yuvarlamak için diseksiyon iğnesini kullanın. Bantla temastan kaçınarak, embriyoyu kaldırın ve üzüm agar levhasına aktarın.

Bu levha üzerindeki kaplanmış embriyoları, sırt tarafları agar levhasına karşı ve arka uçları aşağı bakacak şekilde hizalayın. Daha sonra slaytı ıslak filtre kağıdı ile bir Petri kabına yerleştirin ve embriyoları istenen yaşa ulaşana kadar oda sıcaklığında inkübe edin Diseksiyon için, küçük bir dikdörtgen çift taraflı yapışkan bant parçası keserek canlı diseksiyon için bir slayt hazırlayın. Bandı süper donun bir ucuna yakın bir yere yerleştirin ve bir balmumu kalemi kullanarak kaydırın.

Bandın etrafına slayt genişliğinde ve 30 ila 40 milimetre uzunluğunda bir dikdörtgen çizin. Balmumu ve bant arasında yaklaşık üç milimetre boşluk olmalıdır. Daha sonra, slaytı ters çevirerek ve bandın onlarla temas etmesi için sıralanmış embriyoların üzerine hafifçe indirerek embriyoları büyük plaka levhasından bant üzerine aktarın.

Embriyolar arka uçları aşağı bakacak şekilde yönlendirilmelidir. Transferden sonra, embriyolar slayt üzerinde sırt tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırılacak, enjeksiyon iğnesi gibi bir iğne çektirmesi üzerinde yapılan bir cam diseksiyon iğnesi kullanarak balmumu dikdörtgenini doldurmak için embriyoların üzerine hemen bir XPBS ekleyecektir. Embriyonun arka ucundan başlayarak dorsal orta hat boyunca kesin.

Şimdi embriyonun ön ucunu dürtün ve yukarı kaldırın. Alttan başlayarak, embriyoyu tamponda tutarak bant şeridinin sağına aktarın. Embriyoları diseksiyona ve transfer etmeye devam edin, slayt üzerinde ağrı levhasındaki her satırla eşleşen düzenli bir embriyo sırası oluşturun.

Diseksiyon iğnesini kullanarak, vücut duvarının kanatlarını yavaşça sürgünün üzerine itin. Malzemeyi yüzeylerinden germekten veya çıkarmaktan kaçınmak. İğne sadece vücut duvarının sırt kenarlarındaki ön ve arka köşelere temas etmelidir.

Çünkü motor aksonları bu kadar uzamaz. Dorsal olarak, tüm embriyolar transfer edildikten ve slayta yapıştırıldıktan sonra kırılacağı için lamın iğnelerine dokunmaktan kaçının. Dört bağırsağı beyin bölgesinden ayırarak ve tüm bağırsağı embriyodan çekerek her embriyodan bağırsağı çıkarın.

Arka bağırsağı kaydırağın üzerine çıkarın. Tüm diseksiyonlar tamamlandıktan sonra, oda sıcaklığını, %5 formaldehiti balmumunun bir köşesine, dikdörtgene aynı anda vermek için iki geçmiş pipet kullanın ve karşı köşeden çözeltiyi çıkarın. Fiksatif çözeltiyi yaklaşık altı mililitrelik bir toplam hacim kullanarak üç kez değiştirin.

Embriyoları fiksatif solüsyonda 45 dakika inkübe edin. Menisküsün embriyolarla temas etmesine izin vermemek çok önemlidir çünkü bu onları yok edecektir. Sabitleyici solüsyonun çoğunu çıkarmak için pipetinizin geçmişini kullanın.

İki mera pipeti yöntemini kullanarak PB S3 ile yıkayın. Daha sonra embriyolara nüfuz etmek için PBT ile üç kez yıkayın. Bu adım aynı zamanda embriyoları menisküse daha az duyarlı hale getirir.

Son yıkamadan sonra, slaytı eğerek PBT'yi dikkatlice çıkarın ve fazla solüsyonu çıkarmak için balmumu ile çevrili alanın köşesine kısa bir süre Kim mendiliyle hafifçe dokunun. Önceden yüklenmiş bir pipet kullanarak, hemen 10 ila 30 dakika boyunca 200 mikrolitre bloke edici solüsyon bloğu ekleyin. Oda sıcaklığında, bir Kim mendil mendili kullanarak engelleme solüsyonunu çıkarın.

Daha sonra, bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş istenen primer antikorun 200 mikrolitresini hemen ekleyin. Slaytı nemlendirilmiş bir tabağa yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bu deneyde, monoklonal antikor 1D dört, motor aksonları etiketlemek için kullanılır.

Ertesi gün, bulaşıkları dört santigrat dereceden çıkarın ve embriyoları yıkama başına en az 15 dakika boyunca PBT ile sallanan bir platformda üç kez yıkayın. Tüm yıkama adımları için, sallama sırasında sürgüyü tamamen daldırmak için yeterli PBT olduğundan emin olun. Embriyolar yıkandıktan sonra, slaytı daha önce olduğu gibi bloke edin.

Bloke ettikten hemen sonra 200 mikrolitre ikincil antikor ve bloke edici solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin, burada bir Alexa 4 88 anti-US olsun. İkincil, kas liflerini etiketlemek için Rodine Phin ile birlikte kullanılır. Yine, yıkama başına en az 15 dakika boyunca sallanan platformda PBT ile üç kez yıkayın.

Kalan deterjanı çıkarmak için slaytları farklı bir tepsiye aktarın. Daha sonra PBS ile beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytı PBS grafiğinden çıkarın, kalan PBS'nin çoğunu bir kimyasal mendil ile kuyudan çıkarın ve hemen 500 mikrolitre% 70 gliserol ekleyin.

Gliserol, embriyo ile aynı kırılma indisine sahip olduğundan, bu adımı gerçekleştirmek lekelenmeyi daha görünür hale getirecek, embriyoları oda sıcaklığında iki saat veya gece boyunca dört santigrat derecede temizleyin. Ardından gliserolü bir silme mendiliyle çıkarın. Neredeyse tüm gliserolün çıkarılması embriyoları düzleştirirken, daha az gliserolün çıkarılması daha üç boyutlu bir yapıya neden olacaktır.

Gliserol çıkarıldıktan sonra, bir numaralı kapak fişini takın. Embriyolar görüntüleme için hazırdır, diseke edilmiş ve boyanmış embriyolar immünofloresan mikroskobu ile görüntülenebilir. Burada diseke edilmiş bir embriyo, motor akson etiketleme antikoru 1D four ile boyanmıştır.

Bu görüntü, HRP immünohistokimyasının immünofloresan kullanılarak görselleştirme için kullanıldığı daha yaygın olarak görülen görüntülere görünüş olarak benzerdir. Motor akson dallarının detaylarının daha net görüldüğü daha kaliteli görüntüler elde etmek mümkündür. Aksini bağlayan rho domine etiketli phin ile yapılan cos boyama, kasların aynı anda görüntülenmesini sağlar.

Bu, kas katmanlaması ve organizasyonunun daha net bir resmini verir, daha sonra HRP boyama ile elde edilebilir Burada, 1D dört veya motor aksonlar yeşil Fein veya kas kırmızı ile gösterilir. Az önce canlı drosophila embriyolarının mutant soy koleksiyonlarından nasıl ayrılacağını gösterdik. Bu prosedürleri yaparken, lio, armadillo, GFP, dengeli hisse senetleri gibi kolay çizgilerle başlamak ve bir seferde sadece birkaç satır yapmak önemlidir.

Diseksiyonlarda daha uzman ve daha hızlı hale geldikçe, günde 10 satıra kadar yapabilirsiniz ve bu, 20 günlük bir süre içinde 200 veya daha fazla mutant çizgiden oluşan bir koleksiyonu taramanıza olanak tanır. Dolayısıyla, tüm adımları yürütme konusunda uzmanlaştığınızda bu gerçekten çok verimli bir prosedürdür. İşte bu kadar ve izlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.