Hücre Lensless-çip Görüntüleme Yüksek throughput Hücre Biyolojisi ve Tıbbi Teşhis için Yeni Aracı sağlar.

Bu videoda, Lucas olarak adlandırılan lens listesi on-chip görüntüleme sistemi için konsept kanıtı gösterilmektedir. Lucas, gölge görüntülemeye dayalı lens listesi ultra geniş görüş alanlı hücre izleme dizisi platformu anlamına gelmektedir. Geleneksel görüntüleme düzeneklerinin aksine, Lucas platformu herhangi bir mikroskop objektifine veya diğer hacimli optik bileşenlere ihtiyaç duymaz.

Lucas için, incelenen örnek bir mikroskop lamı üzerine yerleştirilir ve özdeş bir lameliyle nazikçe kapatılır. Bir vakum kalemi kullanılarak örnek, optoelektronik sensör dizisinin aktif bölgesine yüklenir. Ardından görüntüleme platformu, görüş alanı içerisindeki incelenen her bir hücrenin gölge veya lens listesi dijital hologramlarını kaydeder.

Bu hücre gölgelerinin otomatik dijital işlemesi; çözelti içindeki hücrelerin tipini, sayısını ve bağıl konumlarını belirleyebilir. Görüş alanı, yaklaşık beş milimetre alan derinliği ile 18 santimetrekareye kadar genişleyebilir. Elde edilen difraksiyon görüntüleri, hedef hücrelerin veya partiküllerin hem karakterizasyonunu hem de tanımlanmasını sağlamak amacıyla özel olarak geliştirilmiş bir karar algoritması tarafından dijital olarak işlenir.

Lucas, görüntüleme tabanlı deneyler için maliyeti düşüren ve verimliliği önemli ölçüde artıran minyatürize bir platform sunarak, mikroakışkanlar ve biyolojik araştırmalardaki gelişmiş son teknoloji sistemlerle uyumlu hale gelmektedir. Merhaba, ben California Üniversitesi, Los Angeles Elektrik Mühendisliği Bölümü'ndeki ROM Biyo ve Nano Laboratuvarı'ndanım ve ben de Nano ve Biyofotonik laboratuvarından Anthony Erlinger. Bugün sizlere, tam kan örneği gibi heterojen bir SA çözeltisinin görüntülenmesi için yüksek verimli bir lens prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızdaki bu prosedür, kısaca Lucas olarak adlandırdığımız, gölge görüntülemeye dayalı lens list ultra geniş alan hücre dizisi izleme platformu dediğimiz yeni bir görüntüleme tekniği kullanmaktadır. Öyleyse başlayalım. İşleme başlamak için üç mililitre tam kan ile 5, 10 ve 20 µm gibi çeşitli çaplarda polistiren mikroboncuklar temin edin ve bunları 30 dakika boyunca oda sıcaklığına getirin.

Serolojik bir pipet kullanarak, steril beş mililitrelik bir polipropilen tüpe seyreltici olarak iki mililitre RPMI 1640 klasik sıvı besiyeri ekleyin. 30 dakikalık bir çöktürme süresinin ardından, tam kan toplama tüpünün dibinden 10 mikrolitre eritrosit örneği çekin ve bunu RPMI çözeltisine aktarın. Eritrosit RPMI seyreltisine toplam 20 mikrolitre hacminde polistiren mikroboncuk ekleyin ve hücre çözeltisini nazikçe pipetleyerek karıştırın. Heterojen çözeltiden 5 ila 15 mikrolitreyi, bir penset kullanarak bir lamel üzerine aktarın.

Çözeltinin üzerine ikinci ve özdeş bir lamel yerleştirin. Örnek, iki lamel arasında eşit şekilde sıkıştırılmış olmalıdır. Ardından, bir vakum kalemi kullanarak örneği görüntüleme için sensör dizisinin aktif bölgesine yükleyin.

Ardından, %0.1 tamponlanmış SNY ve seyreltilmiş yeni metilen mavisi veya NMB çözeltisini ikiye bir hacim oranında birleştirerek sulu boyama reaktifini hazırlayın; SNY ve yeni metilen mavisi çözeltilerinin hazırlanmasına ilişkin ayrıntılar için lütfen ekteki yazılı protokole bakın. Daha sonra, bir polipropilen beherde, ACOA boyama reaktifini tam kan örneği ile bir bir hacim oranında birleştirin ve iki dakika boyunca manyetik karıştırıcı ile karıştırın. Ardından, çözeltiyi 1,99 mL RPMI 1640 klasik sıvı çözeltisi ile birlikte beş mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe edin.

Ardından, 1 NADPH'a 200 hacim oranını elde etmek için boyanmış kan çözeltisinin 10 µL'sini RPMI'ya aktarın. Daha sonra çözeltiyi 30 saniye boyunca vorteksleyin ve boyanmış hücre çözeltisinin 10 ila 100 µL'sini lamlar arasına veya bir mikroakışkan rezervuara pipetleyin. Son olarak, bir vakum kalemi kullanarak örneği sensör dizisinin aktif bölgesine yerleştirin.

Lucas platformu, lenssiz hücre hologramlarını dijital olarak kaydetmek için bir optoelektronik sensör dizisi kullanır. Bu amaçla, ayarlanabilir dalga boyu aydınlatmasını sağlamak için şarj bağlı aygıtlar veya CCD'ler kullanılır; xenon lambalı bir monokromatör ile birlikte, fiber demetinden ve sensör yüzeyinin yaklaşık beş ila 10 santimetre üzerinde yer alan yaklaşık 100 mikrometre çapında bir iğne deliğinden oluşan standart derece füzyon silika fiber, ayarlanabilir dalga boyu için kullanılabilir. Aydınlatma, hücrelerin holografik imzalarının hassas bir şekilde ayarlanabildiği ve sinyal-gürültü oranını ve Lucas görüntüsünün kontrastını artırmak için birden fazla dalga boyu birleştirilerek hibrit dijital imzaların sentezlenebildiği esnek bir platform sunar.

Daha iyi karakterizasyon için, iki lamel arasına yerleştirilmiş doğruluk numuneleri, ışık kaynağı tarafından homojen olarak aydınlatılan sensör dizisinin aktif bölgesine yüklenir. Heterojen bir çözelti içindeki her bir hücrenin veya mikro nesnenin difraksiyon hologramları, sensör dizisinin üzerine düşerek bir Lucas görüntüsü oluşturur. Elde edilen Lucas Difraksiyon görüntüleri, hedef hücrelerin veya mikro nesnelerin otomatik karakterizasyonu ve tanımlanması için istatistiksel bir difraksiyon görüntüsü kütüphanesi kullanan, özel olarak geliştirilmiş bir karar algoritması tarafından işlenir.

Bu şekil, beş, 10 ve 20 mikrometrelik polistiren mikroboncuklar ile eritrositlerden oluşan heterojen bir çözeltinin konvansiyel 40 x objektif görüntüsünü göstermektedir. Bu partiküllerin 3D morfolojileri, kırılma indisleri ve karşılıklı karmaşıklıkları birbirinden farklıdır.

Bu özelliklerin bazıları geleneksel bir mikroskop altında ayırt edilebilir, ancak Lucas platformunda 0,5 milimetrekare'den daha küçük, oldukça sınırlı bir görüş alanı üzerinden yapılabilir. Tüm bu mikropartiküller, bir parmak izi gibi kendine özgü ve farklı holografik desenler sergiler. Bu nedenle, 2D dokularına dayanarak herhangi bir belirsizlik olmaksızın karakterize edilebilirler.

Lucas, 10 ila 20 santimetrekareye kadar genişletilebilen ultra geniş bir görüş alanını izleyebilir. Bu, standart lens tabanlı mikroskoplardan kat kat daha büyüktür. Bu görüntü, Lucas platformu kullanılarak boyanmış bir tam kan örneğinin 40 x objektif görüntüsüdür.

Boyanmış beyaz kan hücrelerinin iç özellikleri, hücre çekirdeklerinin kırılma indisi ve saçılma özelliklerinin değiştirilmesiyle etkili bir şekilde farklılaşır. Her bir hücrenin kendine özgü kırınım paternleri sensör dizisi tarafından kaydedilir. Bu durum, Lucas platformunun hasta başı sitometri ve tanısal amaçlar için güçlü bir araç olarak sunduğu bir diğer avantajı ortaya koymaktadır.

İlgi duyulan hücrelerin hızlı karakterizasyonu için tam otomatik bir platform olan Lucas difraksiyon görüntüleri, özel olarak geliştirilmiş bir karar yazılımı kullanılarak dijital olarak işlenir. Bu şekilde, kırmızı kan hücreleri ve mikroboncuklardan oluşan heterojen bir karışım arayüz tarafından işlenmektedir. Algoritma, yüksek yoğunluklu bölgelerin yanı sıra üç mikrometrelik boncuklar gibi düşük sinyal-gürültü oranına sahip partikülleri tespit etmede dayanıklıdır.

Lucas özel arayüzünde işlenmiş bir görüntü burada gösterilmektedir. Yazılım, sensör piksel boyutu veya aydınlatma dalga boyu gibi çeşitli spesifikasyonların girilmesine olanak tanır. Ayrıca, görüntü üzerinden seçimler yapılabilir ve hücre desenleri tanımlanabilir.

Örnek bu verilere göre sayılır ve işaretlenmiş görüntü kullanıcıya gösterilir. Size Lucas'ın yüksek kapasiteli platformunu kullanarak hücrelerin nasıl görüntülendiğini ve karakterize edildiğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, gösterilen deneylerin çok çeşitli hücrelere ve mikropartiküllere uygulanabileceğini hatırlamak önemlidir.

Ayrıca heterojen bir solüsyonun ultra geniş alanlı ve yüksek verimli hücre karakterizasyonuna olanak tanır. İşte hepsi bu. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.