Name: Çekirdekli Hücreler Sirkülasyon zenginleştirilmesi için Otomatik mikroakışkan Kan Lizis Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Öğrenin, dolaşımdaki çekirdekli hücreleri zenginleştirmek için otomatik mikroakışkan kan lizis protokolünü. Bu yöntem, yüksek kaliteli örneklerin hücre kaybı olmadan izole edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma Translasyonel Araştırma Wallace H. Coulter Vakfı Erken Kariyer Ödülü tarafından desteklenmektedir. Tim Andrews, Pediatrik Hematoloji / Onkoloji, kan örneği toplama konusunda yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Sam Wellhausen, Sitometrisi Core, James Graham Brown Kanser Merkezi, flow sitometri örnekleri çalışan yardım için teşekkürler.

Bölüm 1. Mikroakışkan cihaz imalat Mikroakışkan lizis cihazın bir silikon master kalıp, Louisville temiz Üniversitesi ekipman standart fotolitografik teknikleri kullanılarak yaratıldı [1]. AutoCAD (Autodesk Inc, San Rafael, CA) kanalları negatif kopyaları oluşturmak için bir saydamlık maskesi (Fineline Görüntüleme, Colorado Springs, CO) oluşturmak için kullanılır oldu. Elastomer poli (dimethylsiloxane) (Dow Corning, Midland PDMS) ile yumuşak litografik teknikleri kullanarak silikon ana kalıp mikroakışkan lizis cihaz üretildi. Çoğaltılmış kanalları ile elastomer piyasaya çıktı ve 20-gauge iğne (Küçük Parça, Miramar, FL.) Kanal erişim delikleri delikli edildi. PDMS gofret oksijen plazma ile geri dönüşümsüz bir bardak slayt gümrüklü ve deney için test edildi. Bölüm 2. Lizis cihazı çalıştırmak için Protokol Mikroakışkan cihaz imal ve test edildikten sonra, eritrosit lizis ile deneyler için hazırız. Aşağıdaki bölümde ayrıntıları mikroakışkan cihaz için protokol. 2.1 Örnek Toplama <ol><li> Iki adet 2 ml yeşil üst vaccutainers antikoagülan olarak heparin ile hastanın ön önkol ven, medyan kübital venden 4 mililitre kan örneği toplayın. </li><li> Yerinden olgun endotel hücreleri (yanlış pozitif) içeren ilk 2 ml tüp atın. </li><li> Aşağı yukarı torna ve kan heparin karıştırmak için ikinci tüp yeniden süspanse; buz üzerinde hemen kaydedin. </li><li> 1 ml kan 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarın. (Toplama bir saat içinde) kan örneği hemen işleyin. </li></ol> PBS ile 2.2 Başbakan mikroakışkan cihaz <ol><li> Cam bağlanmış bir mikroakışkan cihaz alın. Giriş ve çıkış (Şekil 1) biraz daha büyük çaplı press-fit erişim boru (Küçük Parça, Miramar, FL). </li><li> Makro mikro arayüzü sağlayarak, her girişler tüp için 30-gauge enjektör iğnesi (Küçük Parça, Miramar, FL) takın. </li><li> 1X PBS ile 1 ml şırınga doldurun ve şırınga iğnesi Flicking baloncuklar kurtulmak için emin olun. PBS yüklenmiş 1 ml şırınga mikroakışkan cihaz girişi 1 bağlayın. Çözüm girişi 2 akana kadar elle hafifçe 1X PBS içeren şırınga itin ve sonra hemen standart bir ofis bağlayıcı klip ile giriş 2 kelepçe </li><li> Ulaşıncaya kadar sıvı Mikroakiskan cihazın çıkış portu 1X PBS iterek devam edin. Çözüm çıkış dışarı akar sonra, başka bir bağlayıcı klip ile çıkış boru kelepçe. </li><li> 1 ml şırınga iterek 1X PBS girişi 3 akana kadar devam edin ve başka bir ofis bağlayıcı klip ile giriş portu 3 kelepçe. Mikroakiskan cihazı artık tamamen hazırdır. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 şematik ilgili çözümleri ve çıkış girişleri gösteren cihaz. 2.3 şırınga pompaları ve çözüm hazırlanması <ol><li> Pompaların kalibre etmek için şu adımları izleyin: <ol class="lalpha"><li> Büyük Harvard şırınga pompası (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702,000): 22.5 mm, 600 ul / dak akış hızı çapı yapılandırmayı ayarlayın. </li><li> Küçük Harvard Şırınga pompası (Harvard, Pico Plus Bölüm # 702.213): çapı 4.61 mm, akış hızı yapılandırması ayarlama 20 ul / dak. </li></ol></li><li> Biri 30 ml şırınga steril deiyonize su ile doldurun. Bu 50 ml konik tüp doğrudan çözüm çekerek yapılabilir. (Şırınga Etiket) </li><li> 9. adımda belirtilen prosedürü kullanarak 2X, fosfat tamponlu salin (PBS),% 2 paraformaldehid (PFA) ile ikinci bir 30 ml şırınga doldurun. (Şırınga Etiket) </li><li> 9. adımda belirtilen prosedürü kullanarak, 15 ml konik tüpler içinde saklanan alikotları 1X PBS ile 1 ml şırınga doldurun. </li><li> Giriş 2 30 ml deiyonize su şırınga ve girişi 3 30 ml 2X PBS şırınga (tüp veya Mikroakiskan cihaz don t tuzak kabarcıkları emin olun) bağlayın. Girişler 2, 3 ve çıkış boru kelepçe çıkarın. Girişi 1 1X PBS 1 ml şırınga bağlayın. Şırınga iğnesi ile, sıvı dolum, şırınga bağlayan ve baloncuklar kurtulmak için şırınga iğnesi Flicking kabarcıkları tanıtan kaçının. </li></ol> 2.4 Eritrosit lizis <ol><li> Aşağıda belirtilen uygun Harvard pompalar tüm şırınga ayarlayın: <ol class="lalpha"><li> Büyük Harvard şırınga pompası birlikte iki 30 ml şırınga (biri steril, de-iyonize su ve 2X PBS,% 2 PFA içeren) ayarlayın. </li><li> Küçük Harvard şırınga pompası, 1 ml şırınga (1X PBS içeren) ayarlayın. </li><li> Bir atık toplayıcı çıkış boru (w etiketli 50 ml konik tüp yerleştirinizAste). </li></ol></li><li> Büyük Harvard şırınga pompası (30 ml şırınga ile) açın ve bir dakika boyunca çalışmasına izin. (Herhangi bir cihaz veya tüp kabarcıkları ve herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun). </li><li> Küçük Harvard şırınga pompası açın ve ek bir dakika çalışmasına izin. (Herhangi bir cihaz veya tüp kabarcıkları ve herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun). Pompaların durdurun. Mikroakiskan cihazı artık kullanıma hazır. </li><li> Küçük Harvard şırınga pompası 1X PBS içeren 1 ml şırınga çıkarın. </li><li> Bir kan örneği alındıktan sonra, herhangi bir baloncukları yakalama 0.05 ml steril 1X PBS ile 1 ml şırınga doldurun. Daha sonra, 0.5 ml Eppendorf tüp elde edilen kan şırınga doldurun. (1 ml şırınga artık bir son hacmi 0.55 ml kan ve 1X PBS içerecektir.) Not: 0.05 ml PBS kana karışmasını önlemek için doldururken, şırıngayı dik tutun. </li><li> Connect girişi 1 kan içeren şırınga ve küçük Harvard şırınga pompası (şırınga pompası içine dikey olarak monte edilir) (tüp yoluyla kan cihazın içine iterek önlemek) şırınga dikkatle monte. </li><li> Atık tüpten çıkış tüpünü çıkarın ve onun yerine temiz bir 50 ml santrifüj tüpüne koyun ve bir kova buz ayarlayın. </li><li> Ilk büyük Harvard şırınga pompası açın ve 1 dakika boyunca çalışmasına izin. 50 ml santrifüj tüpü içine prizden örnek toplamaya başlayın. </li><li> Küçük Harvard şırınga pompası açın. </li><li> 1 ml şırınga içinde kan örneği tamamen cihaz üzerinden seyahat sonra, her iki pompa da durdurmak. Bu yaklaşık 20 dakika sürer. </li><li> 5 dakika boyunca toplanan örnek fren kapalı oda sıcaklığında 350 xg'de santrifüjleyin. </li><li> Beyaz pelet karşı tarafında pipet koyarak süpernatantı. Beyaz pelet rahatsız etmeden, mümkün, özellikle kırmızı hücre artıkları gibi çok supernatant olarak çıkarın. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından tekrar numune akışı, tampon 1 ml (1X PBS,% 1 BSA [sığır serum albumin],% 2 PFA) 1,5 ml Eppendorf tüp örnek aktarın. </li><li> 5 dakika oda sıcaklığında 4 xg'de Mikrosantrifüj toplanan örnek. Süpernatant kaldırmak için daha önce olduğu gibi aynı hassasiyette kullanın. </li><li> Vorteks akışı, tampon 1 ml örnek tekrar </li></ol> Akım sitometri analizi için 2,5 hazırlanması <ol><li> Flow sitometri kullanılarak numune analizi için örnek bir akış sitometri tüp 100 ul ekleyin. </li><li> Örnek 100 ul için (doğru konsantrasyonunu sağlamak) belirtilen antikor ekleyin. </li><li> Örnek C. 40, 30 dakika boyunca inkübe izin verin </li><li> Flow sitometri önce akışı, tampon ile iki kez yıkayın. Yıkama adım akışı, tampon 250 ul ekleyerek karıştırın, 5 dakika boyunca 350 xg'de santrifüj ve akış sitometri tüp bir sıvı dönüş ile süpernatant kaldırarak içerir. </li><li> 250 akış tampon ul pelletini tekrar. Flow sitometri ile analiz için örnek hazırdır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Tam kan, eritrositlerin biniyordu ve zenginleştirici dolaşımdaki çekirdekli hücreleri (CNCs) mikroakışkan lizis cihaz ve post-processing protokol ile işletilmektedir. İdeal sonuçlar ayrı CNC nüfusa sahip bir temiz flow sitometri scatter plot verecektir. Şekil 2 ve 3 altında görüntülenir ve forward scatter (FSC) karşı tarafında dağılım (SSC) ışık gibi eksenleri ile mikroakışkan protokol eritrosit lizis ile eritrosit lizis olmadan tam kan örneği scatter plot karşılaştırmalar. Mikroakışkan zenginleştirme protokolü, temiz bir akış sitometri scatter plot elde etmek için gerekli olduğu görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Flow sitometri scatter plot FSC ve SSC eksenleri ile eritrosit lizis olmadan tam kan örneği. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 FSC ve SSC eksenleri ile nüfusu etiketli mikroakışkan eritrosit lizis çekirdekli hücreleri dolaşımdaki akış sitometri scatter plot. 1. Bölge (kırmızı) granülositler temsil eden 3. Bölge (mavi), Bölge 2 (yeşil) temsil eden monositler, lenfositler temsil eder, ve 4. Bölge (mor) henüz karakterize edilebilir. Gerektiğinde protokolde pipet kırmızı hücre enkaz kaldırılması da önemlidir. Aşağıda Şekil 4 kırmızı hücre enkaz bir fazlalık gösteren bir scatter plot. Şekil 2'de scatter plot karaltı olmasa da, bir veri analizi sırasında eritrosit enkaz nedeniyle etkinlikler için hesaba katmalısınız. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Flow sitometri scatter plot kırmızı hücre artıkları, bir küme olarak tasvirBölge 5 (mavi) olayları. Belirli antikor fenotip işaretleri Boyama hücreler de karakteristik sonuçlar üretecektir. Lenfositler, monositler ve granülositler: Sayılarla, 3 farklı lökosit için antikor fenotip lekeler vardır. Şekil 5 eksenleri CD3 ve CD4 ile çizilen lenfosit toplulukları gösteriyor. Monositler ve granülositler sırasıyla, FSC karşı CD14 ve CD66b gibi balta ile 6-7 Rakamlarla gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Flow sitometri scatter plot, CD3 ve CD4 eksenleri ile lenfositlerin tasvir . <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 Flow sitometri scatter plot FSC ve CD14 eksenleri ile monositler tasvir. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7 Flow sitometri scatter plot FSC ve CD66b eksenleri granülositler tasvir.

<ol><li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+%28SCD%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li>
<li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li>
</ol>

Otomatik bir mikroakışkan kan lizis protokol bildirilmiştir. Protokol kapsamında fazlalaştı kritik adımlar. P.2.1 bölümü, örnek yerinden olgun endotel hücreleri içeren yanlış pozitif olarak hareket olarak toplanan ilk kan şişe atmak için önemlidir. Ayrıca toplama bir saat içinde kan örneği çalıştırmak için emin olun. Astar bölümü P.2.2 mikroakışkan cihaz, başlangıçta baloncuklar kurtulmak için önemlidir. Ayrıca, bir protokol boyunca iğne şırınga takarken kabarcıkları almaktan kaçınması gerekir. Bölümü P.2.4 kan ile 1 ml...

Çekirdekli hücreler sirkülasyon zenginleştirilmesi için otomatik mikroakışkan kan lizis protokolü

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Bu raporda, otomatik bir mikroakışkan kan parçalama cihaz için protokol ayrıntılı. Lökosit ve endotel hücreleri içeren çekirdekli hücreleri (CNCs), Sirkülasyon, bireyin bağışıklık durumuna güncelleştirilmiş bir durum için ideal bir platform sağlar. Mikroakışkan protokolü, seçici hücre kaybı ve kullanıcı-aracılı adımları nedeniyle numune hazırlama değişkenliği olmadan CNCs zenginleşmesine olanak sağlar. Kısaca, protokol cihaz imalat, örnek toplama, cihaz kurulumu ve mikroakışkan haznesinden kan çalıştıran içerir. Cihaz içinde tam kan hızla yaklaşık 10 saniye 50 mikron x 150 mikron mikroakışkan kanal için deiyonize su ile karıştırılır. Bu süre içinde a eritrositlerin hipotonik koşulları nedeniyle parçalanmış. Kanalın alt Herringbone yapıları tam karıştırma ve sabit bir ortama hücreleri maruz kalma sağlar. Kalan hücreleri izotonik koşulları, cihazın çıkışında iade, 2% paraformaldehid kullanarak sabit CNCs eritrosit enkaz ayırmak için santrifüj ve akışı, tampon boyama ve flow sitometri ile analiz için askıya. Sonuçlar kaydedilir CNC nüfusa sahip temiz akış sitometri dağılım araziler göstermektedir. Bu cihaz ve protokol önemi CNC popülasyonlarının analizi ile hastalığın patogenezinde çalışma ve anlayış geliyor. Bu nedenle, otomasyon, etkinliği ve mikroakışkan protokol basitliği göstermiştir.

Çekirdekli hücre zenginleştirme hücre kaybı olmadan yüksek kaliteli örnek izolasyonu sağlar eritrosit lizis ile periferik kan dolaşımını sağlamak için otomatik bir mikroakışkan cihaz geliştirildi.

Çekirdekli Hücreler Sirkülasyon zenginleştirilmesi için Otomatik mikroakışkan Kan Lizis Protokolü

Bu raporda, otomatik bir mikroakışkan kan liziz cihazı için protokol detaylandırılmıştır. Lökositler ve ... dahil olmak üzere dolaşımdaki çekirdekli hücreler (CNC'ler),

Kandaki dolaşımdaki çekirdekli hücrelerin zenginleştirilmesi için. Mikroakışkan aygıt, önce kabarcıklardan arındırılmak için bir adet XPBS ile ön hazırlığa tabi tutulur, ardından kan örneği yüklenmeden önce şırınga pompaları aracılığıyla aygıttan deiyonize su ve iki XPBS içinde %2 paraldehit geçirilerek işlem yapılır. Kan daha sonra mikroakışkan aygıtta işlenir ve toplanır; örneğin işlem sonrası aşamaları santrifüjleme ve süpernatan uzunluğunu gidermeyi içerir.Son olarak, faks grafikleri üretmek için örnek akış sitometrisi ile analiz edilir. Merhaba, ben Wool Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Mikroölçekli Biyoteknoloji laboratuvarından William White. Bugün size mikroakışkanlar yoluyla tam kanın lizislemesiyle dolaşan çekirdekli hücrelerin zenginleştirilmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz.Laboratuvarımızda, lökositlerin ve diğer dolaşımdaki çekirdekli hücrelerin kaybı veya aktivasyonu olmadan zenginleştirilmesini sağlamak amacıyla çeşitli hastalık süreçlerindeki inflamasyonu incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, giriş ve çıkış deliklerindeki kanal erişim deliklerinden biraz daha geniş çaplı erişim tüplerini yerleştirin.Ardından, makro-mikro ara yüzeyini sağlamak için her bir giriştekine 30 gauge şırınga iğnesi takın. Sonra, hava kabarcıklarını giderdiğinizden emin olarak bir mililitrelik bir şırıngayı 1X PBS ile doldurun. Şırıngayı birinci girişe bağlayın ve 1X PBS ikinci girişten akana kadar şırıngayı elinizle nazikçe itin.Ardından, ikinci girişi hemen bir ofis ataç klipsiyle sıkıştırın. 1X PBS çözeltisi mikroakışkan cihazın çıkış portuna ulaşana kadar şırıngayı itmeye devam edin. Çözelti çıkıştan aktığında, çıkış borusunu başka bir ataç klipsiyle sıkıştırın.Bir mililitrelik şırıngayı, giriş üçten XPBS akana kadar itmeye devam edin ve giriş üç portunu üçüncü bir ofis mandalıyla sıkıştırın. Mikroakışkan cihaz artık tamamen hazırlanmıştır. Çap konfigürasyonunu 22,5 milimetre ve akış hızını dakikada 600 mikrolitre olarak ayarlayarak, büyük Harvard şırınga pompası ile şırınga pompalarının kalibrasyonuna başlayın.Küçük Harvard şırınga pompası için çap konfigürasyonunu 4,61 milimetreye ve akış hızını dakikada 20 mikrolitreye ayarlayın. Ardından, 50 mililitrelik konik tüpten doğrudan çözelti çekerek bir adet 30 mililitrelik şırıngayı deiyonize su ile doldurun.Şırıngayı etiketlemeyi unutmayın, başka bir 30 mililitrelik şırıngayı iki XPBS %2 paraformaldehit çözeltisi ile doldurun. Yine, konik tüpten doğrudan çekin ve şırıngayı etiketleyin. Şimdi, hortumlarda veya mikroakışkan cihazda hava kabarcığı kalmadığından emin olurken, su içeren şırıngayı ikinci girişe ve iki XPBS'li %2 paraformaldehit şırıngasını üçüncü girişe bağlayın.Ardından, üç şırınga da bağlıyken ikinci giriş, üçüncü giriş ve çıkış borularındaki klempleri çıkarın. İki büyük şırıngayı büyük Harvard şırınga pompasına, bir mililitrelik şırıngayı ise küçük Harvard şırınga pompasına yerleştirin. Çıkış borusunu 50 mililitrelik konik bir atık toplama tüpüne yerleştirin.Şimdi 30 mililitrelik şırıngaları tutan büyük Harvard şırınga pompasını açın ve bir dakika boyunca çalıştırın. Cihazda veya tüplerde hava kabarcığı ya da sızıntı olmadığını kontrol edin. Ardından küçük Harvard şırınga pompasını açın ve onu da bir dakika daha çalıştırın.Hava kabarcıkları ve sızıntı kontrolü yapılır. Pompalar iki dakika sonra durdurulur. Mikroakışkan cihaz artık kan örnekleriyle kullanılmaya hazır olduğundan, analiz edilecek kan örnekleri ekteki yazılı protokolde açıklandığı şekilde toplanır ve toplandıktan sonra bir saat içinde kullanılır.Yalancı pozitif sonuçları önlemek için toplanan ilk kan tüpü atılır. Bir mililitrelik şırıngayı küçük Harvard şırınga pompasından çıkarın, ardından bir mililitrelik şırıngayı doldurarak şırınga iğnesine bir miktar XPBS enjekte edin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için, bir mililitrelik şırıngayı herhangi bir kabarcık hapsetmeden 50 microliters XPBS ile doldurun.Ardından şırıngayı 0,5 milliliters kan ile doldurun. PBS'nin kanla karışmasını önlemek için doldurma işlemi sırasında şırıngayı dikey tutun. Sonra, kan içeren şırıngayı tekrar birinci girişe bağlayın.Fazla sıvıyı silin ve şırıngayı küçük Harvard şırınga pompasına dikey olarak yerleştirin. Kanın tüp aracılığıyla cihazın içine itilmemesine dikkat edin. Çıkış tüpünü atık tüpünden çıkarın ve buz kovasında duran temiz bir 50 milliliter santrifüj tüpüne yerleştirin.Şimdi çalışmaya başlayın; önce büyük Harvard şırınga pompasını açın ve bir dakika boyunca çalışmasına izin verin. Ardından küçük Harvard şırınga pompasını açın. Numune, çıkış borusundan 50 mililitrelik santrifüj tüpüne toplanmaya başlayacaktır.Bir mililitrelik şırıngadaki kan örneğinin cihaz boyunca tamamen ilerlemesine izin verin; bu işlem yaklaşık 20 dakika sürer. Ardından her iki pompayı da durdurun. Çalışma tamamlandığında, toplanan örneği oda sıcaklığında, fren kapatılmış halde olarak 350 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Pipet ucunu beyaz peletin karşı tarafına yerleştirerek süpernatanı uzaklaştırın. Beyaz pelete zarar vermeden, özellikle kırmızı hücre kalıntıları da dahil olmak üzere süpernatanın mümkün olduğunca fazlasını alın. Örneği, pipetleme yoluyla 1% BSA ve 2% paraformaldehit içeren bir ml akış tamponu (flow buffer) içinde, bir XPBS ile yeniden süspanse edin.Numuneyi 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve toplanan numuneyi dört kat g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyin. Önceki santrifüj adımında olduğu gibi, süpernatanı oda sıcaklığında dikkatlice uzaklaştırın. Son olarak, numuneyi yeniden süspande etmek için bir mililitre akış tamponu ekleyip vorteksleyin ve numuneyi akış sitometrisi ile analiz etmeye geçin.Şimdi, mikroakışkan cihazla zenginleştirilmiş bir kan örneğinin akış sitometrisi kullanılarak yapılan analizinden elde edilen, fax plot şeklinde bazı temsili sonuçları göstereceğiz. Lizis yoluyla zenginleştirmenin önemi, alyuvarların bulut şeklinde göründüğü bir fax plot ile görülebilir. Mikroakışkan zenginleştirme protokolü tarafından üretilen saçılım grafiği, dolaşımda bulunan belirgin çekirdekli hücre popülasyonlarını içeren temiz bir saçılım grafiğidir.Kırmızı bölge lenfositleri, yeşil bölge monositleri, mavi bölge granülositleri temsil ederken mor bölge henüz karakterize edilmemiştir. Protokolde eritrosit kalıntılarının uzaklaştırılamaması, fax grafiğinin cam göbeği rengindeki bölgesinde görülen bir olay kümesine yol açar. Hücre popülasyonları ayrı fax grafiklerinde görselleştirilebilir.Lenfositler CD 3 ve CD 4 ile, monositler CD 14 ile ve granülositler CD 66 P ile desteklenmiştir. Mikroakışkan kan lizis cihazı ile bir kan örneğinin nasıl kurulduğunu ve çalıştırıldığını az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, PBS'nin cihaza girmeden önce kanla karışmasına izin vermemek ve cihaz kanallarına hava kabarcığı girmesini önlemek için kan örneğinin derhal çalıştırılması gerektiğini hatırlamak önemlidir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Bu protokol, çeşitli normal ve malign insan dokularında bulunan CD45+ hücrelerinin (lenfositler/lökositler) kalitatif ve kantitatif değerlendirmesi için taze insan doku fragmanlarının hızlı enzimatik olmayan ayrışmasını tanımlar. Ek olarak, birincil doku homojenatından elde edilen süpernatant, daha fazla analiz veya deney için toplanabilir ve saklanabilir.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

Bu protokolün amacı, kapalı bir sitokin yakalama sistemi içeren ve özel personel veya bir GMP tesisinin kullanılmasını gerektirmeyen tezgah üstü, otomatik, ikinci nesil hücre zenginleştirme cihazı kullanarak patojene özgü klinik dereceli T hücreleri üretmektir. Üretilen sitomegalovirüs pp65'e özgü T hücreleri doğrudan hastalara uygulanabilir.

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

Nötrofiller sadece istilacı mikroorganizmalara karşı konak savunmasında değil, aynı zamanda tümör hücrelerinin immün sürveyansında da önemli bir rol oynarlar. Burada, anti-tümör özelliklere sahip nötrofillerin izolasyonu ile ilgili teknikleri ve in vitro ve in vivo olarak anti-tümör nötrofil fonksiyonunu izleme yöntemlerini açıklıyoruz.

Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Bu araştırmada, sarmal atalet Havacilik kapalı çevrim işlemi kullanılarak klinik hava yolu salgıları bir etiket içermeyen nötrofil ayırma yöntemi göstermektedir. Önerilen yöntem çeşitli solunum yolu hastalıkları klinik vitro deneyleri artıracağı.

Kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak hasta kaynaklı hava yolu salgı dan etiket içermeyen nötrofil zenginleştirme

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CtCs) karakterizasyonu çeviri araştırmalarında popüler bir konudur. Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hasta örneklerinde PD-L1 karakterizasyonu ve KTK'ların numaralandırılması için yarı otomatik immünoresans (IF) tahtını tanımlar.

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Bu protokol, biyobankacılık ve diğer amaçlar için insan periferik kan mononükleer hücrelerini izole etmek için yüksek verimli otomasyonla uyumlu bir yöntemi detaylandırır.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Buffy Coats'tan Yüksek Verimli İmmünomanyetik Boncuk Ayırma ile İzole Edilmesi

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN) birçok hastalıkta önemli ölçüde artar. LDN genellikle hücre sıralaması yoluyla izole edilir. Saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem sunuyoruz. Periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra, hücreler manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, manyetik kolonlar aracılığıyla ayrılır.

Düşük Yoğunluklu Nötrofillerin Verimli Saflaştırılması için Hızlı Manyetik-mikro Boncuk Yöntemi

Öğrenin, dolaşımdaki çekirdekli hücreleri zenginleştirmek için otomatik mikroakışkan kan lizis protokolünü. Bu yöntem, yüksek kaliteli örneklerin hücre kaybı olmadan izole edilmesini sağlar.

Çekirdekli Hücreler Sirkülasyon zenginleştirilmesi için Otomatik mikroakışkan Kan Lizis Protokolü

Daha fazla video keşfet