Çekirdekli Hücreler Sirkülasyon zenginleştirilmesi için Otomatik mikroakışkan Kan Lizis Protokolü

Kandaki dolaşımdaki çekirdekli hücrelerin zenginleştirilmesi için. Mikroakışkan aygıt, önce kabarcıklardan arındırılmak için bir adet XPBS ile ön hazırlığa tabi tutulur, ardından kan örneği yüklenmeden önce şırınga pompaları aracılığıyla aygıttan deiyonize su ve iki XPBS içinde %2 paraldehit geçirilerek işlem yapılır. Kan daha sonra mikroakışkan aygıtta işlenir ve toplanır; örneğin işlem sonrası aşamaları santrifüjleme ve süpernatan uzunluğunu gidermeyi içerir.

Son olarak, faks grafikleri üretmek için örnek akış sitometrisi ile analiz edilir. Merhaba, ben Wool Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Mikroölçekli Biyoteknoloji laboratuvarından William White. Bugün size mikroakışkanlar yoluyla tam kanın lizislemesiyle dolaşan çekirdekli hücrelerin zenginleştirilmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, lökositlerin ve diğer dolaşımdaki çekirdekli hücrelerin kaybı veya aktivasyonu olmadan zenginleştirilmesini sağlamak amacıyla çeşitli hastalık süreçlerindeki inflamasyonu incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, giriş ve çıkış deliklerindeki kanal erişim deliklerinden biraz daha geniş çaplı erişim tüplerini yerleştirin.

Ardından, makro-mikro ara yüzeyini sağlamak için her bir giriştekine 30 gauge şırınga iğnesi takın. Sonra, hava kabarcıklarını giderdiğinizden emin olarak bir mililitrelik bir şırıngayı 1X PBS ile doldurun. Şırıngayı birinci girişe bağlayın ve 1X PBS ikinci girişten akana kadar şırıngayı elinizle nazikçe itin.

Ardından, ikinci girişi hemen bir ofis ataç klipsiyle sıkıştırın. 1X PBS çözeltisi mikroakışkan cihazın çıkış portuna ulaşana kadar şırıngayı itmeye devam edin. Çözelti çıkıştan aktığında, çıkış borusunu başka bir ataç klipsiyle sıkıştırın.

Bir mililitrelik şırıngayı, giriş üçten XPBS akana kadar itmeye devam edin ve giriş üç portunu üçüncü bir ofis mandalıyla sıkıştırın. Mikroakışkan cihaz artık tamamen hazırlanmıştır. Çap konfigürasyonunu 22,5 milimetre ve akış hızını dakikada 600 mikrolitre olarak ayarlayarak, büyük Harvard şırınga pompası ile şırınga pompalarının kalibrasyonuna başlayın.

Küçük Harvard şırınga pompası için çap konfigürasyonunu 4,61 milimetreye ve akış hızını dakikada 20 mikrolitreye ayarlayın. Ardından, 50 mililitrelik konik tüpten doğrudan çözelti çekerek bir adet 30 mililitrelik şırıngayı deiyonize su ile doldurun.

Şırıngayı etiketlemeyi unutmayın, başka bir 30 mililitrelik şırıngayı iki XPBS %2 paraformaldehit çözeltisi ile doldurun. Yine, konik tüpten doğrudan çekin ve şırıngayı etiketleyin. Şimdi, hortumlarda veya mikroakışkan cihazda hava kabarcığı kalmadığından emin olurken, su içeren şırıngayı ikinci girişe ve iki XPBS'li %2 paraformaldehit şırıngasını üçüncü girişe bağlayın.

Ardından, üç şırınga da bağlıyken ikinci giriş, üçüncü giriş ve çıkış borularındaki klempleri çıkarın. İki büyük şırıngayı büyük Harvard şırınga pompasına, bir mililitrelik şırıngayı ise küçük Harvard şırınga pompasına yerleştirin. Çıkış borusunu 50 mililitrelik konik bir atık toplama tüpüne yerleştirin.

Şimdi 30 mililitrelik şırıngaları tutan büyük Harvard şırınga pompasını açın ve bir dakika boyunca çalıştırın. Cihazda veya tüplerde hava kabarcığı ya da sızıntı olmadığını kontrol edin. Ardından küçük Harvard şırınga pompasını açın ve onu da bir dakika daha çalıştırın.

Hava kabarcıkları ve sızıntı kontrolü yapılır. Pompalar iki dakika sonra durdurulur. Mikroakışkan cihaz artık kan örnekleriyle kullanılmaya hazır olduğundan, analiz edilecek kan örnekleri ekteki yazılı protokolde açıklandığı şekilde toplanır ve toplandıktan sonra bir saat içinde kullanılır.

Yalancı pozitif sonuçları önlemek için toplanan ilk kan tüpü atılır. Bir mililitrelik şırıngayı küçük Harvard şırınga pompasından çıkarın, ardından bir mililitrelik şırıngayı doldurarak şırınga iğnesine bir miktar XPBS enjekte edin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için, bir mililitrelik şırıngayı herhangi bir kabarcık hapsetmeden 50 microliters XPBS ile doldurun.

Ardından şırıngayı 0,5 milliliters kan ile doldurun. PBS'nin kanla karışmasını önlemek için doldurma işlemi sırasında şırıngayı dikey tutun. Sonra, kan içeren şırıngayı tekrar birinci girişe bağlayın.

Fazla sıvıyı silin ve şırıngayı küçük Harvard şırınga pompasına dikey olarak yerleştirin. Kanın tüp aracılığıyla cihazın içine itilmemesine dikkat edin. Çıkış tüpünü atık tüpünden çıkarın ve buz kovasında duran temiz bir 50 milliliter santrifüj tüpüne yerleştirin.

Şimdi çalışmaya başlayın; önce büyük Harvard şırınga pompasını açın ve bir dakika boyunca çalışmasına izin verin. Ardından küçük Harvard şırınga pompasını açın. Numune, çıkış borusundan 50 mililitrelik santrifüj tüpüne toplanmaya başlayacaktır.

Bir mililitrelik şırıngadaki kan örneğinin cihaz boyunca tamamen ilerlemesine izin verin; bu işlem yaklaşık 20 dakika sürer. Ardından her iki pompayı da durdurun. Çalışma tamamlandığında, toplanan örneği oda sıcaklığında, fren kapatılmış halde olarak 350 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Pipet ucunu beyaz peletin karşı tarafına yerleştirerek süpernatanı uzaklaştırın. Beyaz pelete zarar vermeden, özellikle kırmızı hücre kalıntıları da dahil olmak üzere süpernatanın mümkün olduğunca fazlasını alın. Örneği, pipetleme yoluyla 1% BSA ve 2% paraformaldehit içeren bir ml akış tamponu (flow buffer) içinde, bir XPBS ile yeniden süspanse edin.

Numuneyi 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve toplanan numuneyi dört kat g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyin. Önceki santrifüj adımında olduğu gibi, süpernatanı oda sıcaklığında dikkatlice uzaklaştırın. Son olarak, numuneyi yeniden süspande etmek için bir mililitre akış tamponu ekleyip vorteksleyin ve numuneyi akış sitometrisi ile analiz etmeye geçin.

Şimdi, mikroakışkan cihazla zenginleştirilmiş bir kan örneğinin akış sitometrisi kullanılarak yapılan analizinden elde edilen, fax plot şeklinde bazı temsili sonuçları göstereceğiz. Lizis yoluyla zenginleştirmenin önemi, alyuvarların bulut şeklinde göründüğü bir fax plot ile görülebilir. Mikroakışkan zenginleştirme protokolü tarafından üretilen saçılım grafiği, dolaşımda bulunan belirgin çekirdekli hücre popülasyonlarını içeren temiz bir saçılım grafiğidir.

Kırmızı bölge lenfositleri, yeşil bölge monositleri, mavi bölge granülositleri temsil ederken mor bölge henüz karakterize edilmemiştir. Protokolde eritrosit kalıntılarının uzaklaştırılamaması, fax grafiğinin cam göbeği rengindeki bölgesinde görülen bir olay kümesine yol açar. Hücre popülasyonları ayrı fax grafiklerinde görselleştirilebilir.

Lenfositler CD 3 ve CD 4 ile, monositler CD 14 ile ve granülositler CD 66 P ile desteklenmiştir. Mikroakışkan kan lizis cihazı ile bir kan örneğinin nasıl kurulduğunu ve çalıştırıldığını az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, PBS'nin cihaza girmeden önce kanla karışmasına izin vermemek ve cihaz kanallarına hava kabarcığı girmesini önlemek için kan örneğinin derhal çalıştırılması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.