Name: Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: Öğrenin, tek hücreli emiş elektrot kaydı yöntemiyle fare koni fotoreseptörlerinden flaş yanıtlarını nasıl kaydedeceğinizi. Retina diseksiyonu ve elektrofizyolojik ölçümler için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Körlük ve EY 02.687 (Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları ve Görsel Bilimleri Bölümü) önleyin Araştırma Körlük, NIH hibe EY 019.312 ve sınırsız ödenekle Önlemek için Kariyer Geliştirme Ödülü Research tarafından desteklenir.

Elektrotlar yapma <ol><li> Mikropipet çektirmenin kullanarak kayıt elektrotları olun ve mikroskop altında ısıtma filament elektrotlar lehçe. Fare koni tek hücreli emme kayıt için, elektrot ucu iç çapı yaklaşık 6-7 mm. </li><li> Referans elektrot hazırlayın. Distile su içinde% 1 agar tartılır. Agar çözüm sıcak su banyosunda eritin. Şırınga kullanarak% 1 agar ile cam pipetler (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) doldurun. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında agar katılaşmaya. </li><li> Pipetler bir elmas bıçak kullanarak parçaya kesin. </li><li> 4 en az 24 saat için referans çözüm referans elektrotlar Soak ° C. </li></ol> Denemenin kurulumu <ol start="5"><li> Karanlık bir gecede, siyah bir kafes içinde bir fare adapte. </li><li> 100 ml referans çözümü ve 1 L perfüzyon çözeltisi (aşağıya bakın) hazırlayın ve çözüm filtre. </li><li> % 0,1 BSA ve 10 mM Glukoz, 20 ml referans çözelti içinde çözülür. </li><li> Işık şiddetinin fotometre kullanarak optik stimülatörü kalibre edin. </li><li> Inverted mikroskop aşamasında kayıt odasının monte edin. </li><li> % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile Bubble perfüzyon çözüm, CO 2 çözünürlüğü artırmak için 40 ° C su banyosunda inkübe edin. Çözüm şişe, 36-38 ile ısınma seramik direnç geçerek kayıt odası ° C akar Isıtıcı, mikroskop aşamasında ideal kayıt odasına mümkün olduğunca yakın olarak yer almalıdır. </li><li> 1-1.5 ml / dak akış hızı akış regülatörü ayarlayın. </li><li> Kayıt elektrot referans solüsyonu ile doldurun. Bir elektrot tutucu elektrot yerleştirin. Elektrot hiçbir baloncuklar olmadığından emin olun. Amplifikatör headstage sahibi monte edin. Elektrot tutucu yan port kısmen mineral yağ ile dolu tüp bağlayarak yerleşik bir emme cihazı, tutucu bağlayın. Hortumun diğer ucunu ağız yoluyla hangi basınç uygulanabilir, mineral yağ küçük bir rezervuar bağlı. </li><li> Referans elektrot headstage diğer direğe bağlayın. Isıl çift (TC), referans elektrot bağlayın. Elektrot ve TC ipuçları birbirine yakın sıcaklık okuma, mümkün olduğu kadar hücre yakın olarak alınır, böylece emin olun. </li><li> Elektrot görselleştirmek için kızılötesi aydınlatma açın. Elektrot bir monitöre bağlı kızılötesi kamera tarafından görüntülendi. Merkezi görme alanı ve mikro-manipülatör kullanarak monitör elektrot görüntü. </li><li> Referans elektrot kayıt elektrot ucu ucuna yakın (2-4 mm) konumunu ayarlayın. </li><li> Çözeltinin sıcaklığı 36-38 hakkında ° C olacak şekilde ısıtıcı DC gerilim ayarlayın </li><li> Normalde 900 kÊ hakkında, kayıt elektrot direnci kontrol etmek için bir sızdırmazlık testi çalıştırın. </li></ol> Fare retina Yalıtımlı <ol start="18"><li> Loş kırmızı ışık altında, CO 2 ve servikal dislokasyon ile karanlık adapte fare euthanize. Biraz sklerasına en dorsal noktası dağlama, sıcak metal meşale ucu kullanarak gözbebekleri işaretleyin. Makas kullanarak gözbebekleri aydınlatmak. Sonraki tüm işlemler, kızılötesi ışık altında yapılmaktadır. </li><li> Kızılötesi aydınlatma ve görüntü dönüştürücüler ile mikroskop altında gözbebekleri Hemisect. </li><li> Kornea ve lens çıkarın. Vitreus kadar mümkün olduğu kadar çıkarın. </li><li> M-koni yanıtları kaydetmek için, koter işareti yargılamak bir jilet ile Göz yuvası 4 ventral kısmı çıkarın. </li><li> Retina pigment epitel tabakası soyulur. </li><li> Retina düzleştirin ve 1-2 ml referans solüsyonu ile dolu Petri kabı alt üzerine yerleştirin. </li><li> Retinanın bir jilet kullanarak küçük ince parçalar halinde dilimleyin ve saf oksijen ile doymuş bir ışık geçirmez kutu hazırlanmasında kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> Kayıtlar <ol start="25"><li> Isıtıcı geçici olarak kapatın. Odasının kurumasını önlemek için bir by-pass boru perfüzyon akım anahtarı. </li><li> En Kimwipe dokusunun bir parçası kullanarak odasında çözüm boşaltın. Cam bir pipet kullanarak kayıt odasına retina süspansiyon aktarın. </li><li> Retina dilim yerleşmek kadar yaklaşık 2 dakika bekleyin. Perfüzyon geçin. Isıtıcıyı açın. </li><li> Hazırlık görselleştirmek için kızılötesi aydınlatma açın. Retinanın fotoreseptör dış segmentleri (örneğin şekle bakınız) yapışmasını odasına yatarken bir parça için ara. Emme ile elektrot içine yavaşça iç segmentleri çizin. Bu yapılandırmada, birkaç çekirdek ve iç bölümleri elektrot çizilmelidir. Bir koni iç segment hücre iyileşmesi olup olmadığını elektrot olup olmadığını test etmek için parlak bir flaş photoresponse KayıtSenin, cevap kinetiği ve genlik yargılamak. </li><li> Mineral deposu, yardımcı elektrot iç segment tutun için elektrot ucu hafif negatif basınç uygulamak için indirin. </li><li> Kayıt test flaş yanıtları için loş aydınlık şiddeti iyi bir hücre bir kez. Test yanıp söner kalibre edilmiş bir optik Stimülatörü 5 sağlanmaktadır. Flash yoğunluğu ve dalga boyu sırasıyla, bir dizi nötral yoğunluk filtreleri ve dar bant girişim filtreleri tarafından kontrol edilir. Test flaş süresi (20 ms), bilgisayar kontrollü kepenkler tarafından kontrol edilir. </li></ol> Çözümler <ol><li> Fare perfüzyon çözüm: 112.5 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7.4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM süksinat, Na, 0.5 mM Na glutamat, 0.02 mM EDTA ve 10 mM glukoz. </li><li> Fare kayıt elektrot çözüm: 140 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7.4), 0.02 mM EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

Fotoreseptör hücrelerinin Tek hücreli emme kayıt 3 yıl önce geliştirilmiştir. Bu hücre zarının delinmesi ışık stimülasyonu ile indüklenen trans-membran geçerli değişikliği kaydetmek için bize sağlar. Yüksek hücre-hücre adezyon Çünkü, amfibi retina gibi fare retinanın sağlıklı tek bir çubuk ve koni izole etmek zor ve düşük oranda (% 3) ve küçük boyutu nedeniyle bireysel konileri bulmak zordur. Iç kademeli (IS-in) kayıt yöntemi bir koni dahil olabilir, bunların arasında birkaç fotoreseptörlerin iç kesimleri güncel kayıt B...

tek hücreli fare koni fotoreseptörlerin emiş kayıtlar

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Çubuk ve koni retinadaki fotoreseptör ışık algılama sorumludur. Karanlıkta, dış segmente siklik nükleotid kapılı (CNG) kanalları açıktır ve katyonların hücre depolarize zarından içeri doğru istikrarlı bir şekilde akmasına izin verin. Işığa maruz kalma CNG kanalları, bloklar içe katyon akım, ve böylece hücre hiperpolarizasyon sonuçları kapatılması tetikler. Fotoreseptörlerin polarite dayanarak, bir emme kayıt yöntemi klasik yama klemp tekniği aksine, plazma zarı delinmesi gerektirmez, 1970&#39;li yıllarda geliştirilen<sup&gt; 1</sup&gt;. Ekstrasellüler çözümü ile dolu sıkı oturan bir cam pipet içine dış segmente Çizim test flaş pozlama üzerine tek tek hücrelerin içinde güncel değişiklikler kayıt sağlar. Ancak, bu köklü &quot;dış segment (OS)&quot; emme kayıt fare retinanın koni düşük oranda (% 3) ve koni belirlenmesinde zorluklar nedeniyle, fare koni kayıtları için uygun değildir dış segmentleri. Son zamanlarda, bir iç-segment (IS) kayıt yapılandırma kayıt pipet içine iç segment / fotoreseptör nükleer bölge çizmek için geliştirilmiştir<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Bu video, tek hücreli emme elektrot kullanarak bireysel fare koni photoresponses nasıl kayıt gösterecektir.

Biz bir emme elektrot kullanarak tek bir fare kozalakları flaş cevaplarını kaydetmek için nasıl gösterecektir.

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Retinadaki çomak ve koni fotoreseptörleri ışık algılamasından sorumludur. Karanlıkta, dış segmentteki döngüsel nükleotidle kapılı (CNG) kanalları...

Bu video, fare retinasının diseksiyonunu ve ardından koniler için tek hücreli vakum kayıtlarının alınmasını göstermektedir. Ötanazi uygulanmış ve karanlığa adapte edilmiş bir farenin göz küreleri, loş kırmızı ışık altında dorsal kısımdan koterize edilir ve nükleasyona tabi tutulur. Ardından göz küreleri hemisektörlenir.Ekvator boyunca kornea ve göz kürelerinin ventral kısımları çıkarılır. Dorsal retina, pigment epitelyum tabakasından izole edilir ve bir jilet kullanılarak küçük, ince parçalara bölünür. Retina dilimleri daha sonra bir mikroskop tablasına uygun olan kayıt haznesine yerleştirilir.Birkaç fotoreseptör hücre gövdesi kayıt elektroduna çekilir. Bir koni fotoreseptörü elektroda çekildiğinde, parlak bir test flaşı dört pikoamperin üzerinde genliğe sahip bir foto yanıt oluşturacaktır. Merhaba. Ben Washington University in St. Louis Oftalmoloji Bölümü ve görme duyuları merkezindeki Dr. Mir Kops Laboratuvarı'ndan Jin.Bugün size tekil Moscon fotoreseptörlerinden foto yanıtların kaydedilmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, gündüz görmemizi sağlayan fotoreseptörler olan memeli koni hücrelerinin adaptasyon özelliklerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Kayıttan bir gün önce, deneyi karanlıkta gerçekleştirin. Bir fareyi gece boyunca ışık sızdırmayan bir kafese yerleştirerek adapte edin. Bileşik bir mikroskop altında, Borrow silikat cam tüplerden kayıt elektrotları hazırlamak için bir mikro pipet çekici kullanın.Yakmak için bir ısıtma filamanı kullanın. Her bir elektrodun ucunu, pürüzsüzleştirmek ve açıklığını istenen çapla küçültmek için cilalayın. Bir fare koni tek hücre vakumlama işlemi için, elektrot ucundaki iç çap yaklaşık altı ila yedi mikrometre olmalıdır.Distile su içerisinde %1'lik bir agar çözeltisi hazırlayın. Agarı eritmek için çözeltiyi kaynayan suya yerleştirin. Agar eridikten sonra, çözeltiyi bir şırıngaya aktarın ve cam pipetleri bu çözeltiyle doldurun.Referans elektrotları hazırlamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca katılaşmaya bırakın. Agar katılaştıktan sonra, her bir pipeti iki referans elektrot oluşturacak şekilde ortadan ikiye bölmek için elmas bıçak kullanın. Referans elektrotlarını referans çözeltisi ile doldurulmuş bir sintilasyon şişesine yerleştirin ve çözeltinin agar jeline nüfuz etmesini sağlamak için dört °C'de en az 24 saat boyunca bekletin.Referans elektrotlar, hazırlandıkları tarihten itibaren üç aya kadar kullanılabilir. Kullanılan elektrotlar deneyin ardından atılır. Kayıt sistemi, titreşim gürültüsünü en aza indirmek için hava süspansiyonlu bir masaya monte edilmiş ve elektromanyetik gürültüyü en aza indirmek için bir Faraday kafesi ile korunan ters mikroskoptan oluşmaktadır.Kayıt elektrodunun konumlandırılması için motorlu bir mikro manipülatör kullanılır. Optik stimülatör; dalga boyunu ve ışık yoğunluğunu kontrol etmek için tungsten filaman, bilgisayar kontrollü panjurlar ve optik filtrelerden oluşur. Münferit fotoreseptör hücrelerinden gelen membran akımlarını tespit etmek için bir patch clamp amplifikatörü kullanılır.Kayıtlar boyunca doku perfüze edilecektir. Hazırlanan perfüzyon tamponundan bir litreyi, kayıt sisteminin yakınındaki 40 derece Celsius'lik bir su banyosuna yerleştirin. Ardından, perfüzyon tamponunu hortumlar kullanarak %95 oksijen ve %5 karbondioksite bağlayarak sürekli olarak kabarcık çıkmasını sağlayın.Bir fotometre kullanarak, optik stimülatörden gelen zayıflatılmamış ışık gücünü ölçün; fotometrenin dedektörünü, preparatın yerleştirileceği düzlemde mikroskop tablası üzerine yerleştirin. Ardından, test flaşı başına düşen foton sayısını tahmin etmek için, mikrowatt cinsinden verilen okumayı saniyede kare mikrometre başına foton sayısına dönüştürün. Nötr yoğunluk filtrelerinin ışığı zayıflatma etkisini dikkate alın.Sönümlenmemiş ışık gücü ölçüldükten sonra, fotometreyi sahneden kaldırın ve deneylerde kullanılacak kayıt haznesini ters mikroskobun sahnesine monte edin. Borular yardımıyla, perfüzyon çözeltisi şişesini bir regülatör valf aracılığıyla kayıt haznesine bağlayın. Boruları bir ısıtma direnci üzerinden yönlendirin.Isıtıcı direncin kayıt odasının hemen önüne yerleştirildiğinden emin olun. Ardından, regülatör valften kayıt odasına uzanan baypas tüpünü bağlayın. Akış regülatör valfini açarak ve akış hızını dakikada 1 ila 1.5 ml olarak ayarlayarak perfüzyonu başlatın.Perfüzyon çözeltisi, kayıt odasından yerçekimi ile bir toplama balonuna akar. Elektrot tutucuları referans çözeltisiyle doldurmak için küt uçlu iğnesi olan bir şırınga kullanın. Bir mikrofill şırınga iğnesi kullanarak, kayıt elektrodunu referans çözeltisiyle doldurun ve yıkayın; elektrot içerisinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun.Referans elektrodu bir elektrot tutucuya yerleştirin ve amplifikatör kafa katının referans kutbuna bağlayın. Termokuplu referans elektroda sabitlemek için bir kauçuk halka kullanın. Sıcaklık okumasının hücreye mümkün olduğunca yakın bir noktadan alınmasını sağlamak için elektrot ve termokupl uçlarını birbirine yakın yerleştirdiğinizden emin olun.Ardından kayıt elektrodunu bir elektrot tutucuya yerleştirin ve tutucuyu amplifikatörün kafa ünitesine monte edin. Boru yardımıyla, küçük bir mineral yağ rezervuarını elektrot tutucunun yan portuna bağlayın. Rezervuara bağlı boru üzerinden ağızla yapılan hafif vakumlama, hücreyi elektrodun içine çekecektir.Bilgisayar yazılımını kullanarak optik stimülatörün panjurlarından birini açın. Test flaşının ışın alanını mikroskop tablası üzerinde görüntülemek için mikroskobu kayıt odasının tabanına odaklayın. Mikro manipülatörü kullanarak elektrodu test flaşının ışın alanının merkezine taşıyın.Referans elektrodu, kayıt elektrodunun ucuna yakın bir konuma yerleştirin. Kayıt haznesindeki çözeltinin sıcaklığı yaklaşık 36 ila 38 °C olacak şekilde ısıtıcının voltajını ayarlayın. Kayıt elektrodunun direncini kontrol etmek için, önceden ayarlanmış akım genliğine karşı voltajı ölçerek direnci hesaplayan bir sızdırmazlık testi gerçekleştirin; direnç normalde yaklaşık 900 kΩ olmalıdır.Sızdırmazlık testi, kayıt veya referans elektrotlardaki hava kabarcıklarının veya kayıt elektrodunun uygun olmayan uç boyutunun tespit edilmesini sağlar. Sızdırmazlık testi, veri toplama programı clamp X tarafından yazılımsal olarak kontrol edilir. Direnç değeri bilgisayar ekranında görüntülenir. Direnç çok düşükse (500 kilo ohm'dan az), elektrot ucu muhtemelen çok büyüktür ve yeni bir elektrot takılması gerekecektir.Direnç bir mili ohm'dan yüksekse, elektrot içerisinde bir hava kabarcığı olabilir veya elektrot ucu çok dar olabilir; bu durumda elektrodun yıkanması veya değiştirilmesi gerekecektir. Kayıt düzeneği hazır olduğunda, retinal dilimleri loş kırmızı ışık altında deneye hazırlayın; ötanazi uygulanmış ve karanlığa adapte edilmiş bir farenin her bir göz küresinin en dorsal noktasındaki sklera tabakasını yakmak için sıcak diseksiyon iğnesinin ucunu kullanın. Ardından, göz kürelerini makas kullanarak nükle edin.Göz kürelerini, kızılötesi aydınlatma ve kızılötesi görüntü dönüştürücülerle donatılmış bir diseksiyon mikroskobuna aktarmak için küt uçlu pens kullanın. Bundan sonraki tüm diseksiyon işlemleri kızılötesi ışık altında gerçekleştirilir. Ardından, mikro makas kullanarak göz küresini, koter noktası hariç ekvator boyunca kesin.Lensi çıkarmak için sivri pens kullanın. Ardından, koter ucunu referans alarak vitreus dokusunun mümkün olduğunca fazlasını temizleyin. Göz çukurunun ventral kısmını çıkarmak için bir jilet kullanın.Ardından korneayı çıkarın. Sonra, dorsal retinayı pigment epitelyum tabakasından ayırmak için pens kullanın. Daha sonra retinayı, 1-2 mL 10 mM glukoz referans çözeltisi ve %0,1 BSA ile doldurulmuş yeni bir Petri kabının tabanına, reseptör tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve bir jilet yardımıyla retinayı düzleştirmek için üzerine hafifçe bastırın.Retinayı küçük ve ince parçalara ayırın. Ardından, retina dilimlerini kayıt haznesine eklemeden önce, preparatı sürekli olarak saf oksijenle doyurulmuş ışık geçirgen bir kutuda inkübe edin. Isıtıcıyı geçici olarak kapatın.Perfüzyon akışını bypass tüpüne yönlendirin. Ardından bir kim wipe kullanarak, çözeltinin büyük kısmını odağıktan boşaltın. Kızılötesi aydınlatmayı açın.Retina süspansiyonunu inkübatörden çıkarın ve dilimleri kayıt odasına aktarın. Geniş ağızlı bir transfer pipeti kullanarak, dilimlerin iki dakika boyunca çökelmesini sağlayın. Retina dilimleri çökelip yerleştikten sonra, doğrudan perfüzyonu ve ısıtıcıyı tekrar açın.Fotoreseptör dış segmentleri dışarı doğru çıkıntı yapan bir retina parçası belirleyin. Ağız vakumu kullanarak kayıt elektrodunun ucunu retinanın dış nükleer tabakasının üzerine konumlandırın. Birkaç fotoreseptör hücre gövdesini, hücreler elektrodun içine çekilecek şekilde nazikçe elektroda çekin.20 milisaniyelik 500 nanometrelik bir test flaşı verin. Fotoreseptörden geçen akımda ışığın tetiklediği değişim, test flaşı yanıtını temsil eder. Sağlıklı bir koni hücresi, dört ila yedi piko, MPI veya pA'lik bir maksimum yanıt genliği oluşturacaktır.Sönümlenmemiş test flaşı ile uyarıldığında, uygun bir hücre bulunduğunda, hücrenin iç segmentinin elektrot içinde tutulmasına yardımcı olmak amacıyla elektrot ucuna hafif bir negatif basınç uygulamak için mineral yağı rezervuarını elinizle nazikçe aşağı indirin. Hücre yanıt veriyorsa, eşikten doyuma kadar değişen yoğunluktaki test flaşlarına karşı bir dizi yanıt kaydedin.Bu teknik kullanılarak, bir vakum elektrodu yardımıyla fare retinal kesitlerinden koni foto-yanıtları elde edebiliriz. Burada, aynı hücreden alınan birkaç kaydın üst üste bindirilmiş hali gösterilmektedir. Tek bir koninin foto-yanıtları, yaklaşık 1 pA'lik eşik yanıt oluşturan sönükten, yaklaşık 5,5 pA'lik doygun yanıt oluşturan parlak şiddete kadar artan yoğunluktaki test flaşları ile indüklenmiştir.Flaş şiddeti arttıkça, foto tepki genliği doygunluğa ulaşana kadar artar. Flaşlar sıfır anında verilir. Size, vakumlu bir elektrot kullanarak tekil moscon fotoreseptörlerinden foto tepkilerin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz.Bu prosedür uygulanırken retinanın ilgili kısmının elde edildiğinden emin olmak, retinayı ince dilimler halinde kesmek, elektrodu hava kabarcıklarından uzak tutarak temiz tutmak ve hem mekanik hem de elektromanyetik gürültüleri en aza indirmek önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

single-cell-suction-recordings-from-mouse-cone-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İşte biz elektrofizyolojik kayıtlar için fare retina karanlık adapte dilim üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm.  (2017).  Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir.

Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

Kaynak: Kulkarni, M. et al. Fare retinasının koni fotoreseptörü akson terminallerinde Ca2+ dinamiği. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, transgenik bir fare retinasının koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiklerini izlemek için iki foton mikroskobunun kullanımını göstermektedir. Arka plan aydınlatması ve ışık stimülasyonu altında kalsiyum seviyelerini ölçmek için retina dilimleri hazırlama, FRET tabanlı kalsiyum biyosensörlerini görüntüleme ve floresan değişikliklerini analiz etme adımlarını ana...

Fare Retina Koni Fotoreseptörlerinde Kalsiyum Dinamiğini İzlemek için İki Foton Mikroskobu

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması...

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

8 gün yaşlı bir fare Sinir retina% 4 jelatin bloğunun üstünde olduğunu. Vibratome ile fotoreseptör tabakası (200 um), izole edildikten sonra, fotoreseptör kültür mekanik ve enzimatik ayrışma sonrasında tohumlanır. fotoreseptör moleküler ve biyokimyasal analizler ya da transplantasyon için kullanılabilir.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Tavuk embriyolarının retinasından koni fotoreceptörlerinin birincil kültürlerini elde etmek için bir yöntem ve yüksek içerik taraması için kullanımını açıklıyoruz.

Tavuk Embriyolarının Retinasından Koni Zenginleştirilmiş Kültürler Çubuktan Koni Hücresel Etkileşimlerine

Öğrenin, tek hücreli emiş elektrot kaydı yöntemiyle fare koni fotoreseptörlerinden flaş yanıtlarını nasıl kaydedeceğinizi. Retina diseksiyonu ve elektrofizyolojik ölçümler için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Daha fazla video keşfet