İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Hipoksik yerleştirme cihazı, altılı bir kuyucuklara yuva yapan altı direğe sahiptir. Kuyu plakası gazı, direğin tabanındaki mikroakışkan ağ boyunca akar ve gaz geçirgen PDMS membranı boyunca yayılarak gaz ağını ve kültür ortamını ayırabilir. Bu cihaz, oksijen kaynağı, sütunun tabanındaki mikroakışkan ağ ve daha hızlı oksijen konsantrasyonuna izin veren hücreler arasındaki difüzyon yolu uzunluğunu en aza indirir. Dengeleme.

Cihaz ayrıca, fotoğraf maskeleri kullanılarak standart fotolitografi ile yapılan mikroakışkan gaz ağı tasarımı ile belirlenen, hücrelere maruz kalan oksijenin uzamsal modeli üzerinde çok daha fazla kontrole izin verir. Merhaba, ben Chicago'daki Illinois Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü'ndeki Dr.David Edington laboratuvarından Sean Ard. Merhaba, ben Ellie de Edington Laboratuvarı'ndan.

Bugün size, altı katlı bir plakadaki in vitro hücre kültürlerini farklı oksijen konsantrasyonlarına maruz bırakmak için özel bir cihazın nasıl üretileceğini, doğrulanacağını ve kullanılacağını göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü oksijenin yara iyileşmesi, reaktif oksijen türlerinin oluşumu ve göçü üzerindeki etkisini incelemek için kullandık. Öyleyse başlayalım.

Oksijenleştirici ekin imalatına başlamak için, ön polimer ve kürleme maddesi arasında 10'a bir oranında Polimetil Sloane veya PDMS hazırlayın. Üreticinin talimatlarına göre, PDMS karışımı, standart altı kuyulu kültür plakasının şeklini taklit edecek şekilde desenli, önceden işlenmiş bir Dell çalışan kalıba eklenir. Gece boyunca 75 santigrat derecede kürlendikten sonra, ortaya çıkan replika kalıplanmış sütun dizisi, oksijenleme ekinin ikinci temel bileşenini imal etmek için oksijenleme ekini oluşturan üç bileşenden ilkini oluşturacaktır.

Bir SU sekiz master, önce SU 8 21 50'nin eğirilmesiyle hazırlanır. Bir silikon gofret üzerinde, gofrete bir fotoğraf maskesi uygulanır ve SU sekiz, 300 mikrometre mikrokanal kalınlığına sahip bir ana kalıp oluşturmak için fotoğraf maskesi aracılığıyla UV'ye maruz bırakılır. PDMS'yi SU eight Master'ın üzerine dökün ve sonuçta her bir sütunun altındaki mikro kanalları oluşturacak pozitif bir kalıp elde etmek için 75 santigrat derecede iki saat kürleyin.

Cihazın üçüncü bileşeni, PDMS'nin bir silikon gofret üzerinde 10 saniye boyunca 500 RPM'de döndürülmesi ve ardından 100 mikrometre kalınlığında bir zar beyin elde etmek için 30 saniye boyunca 900 RPM ile üretilir. PDM'ler gaz geçirgen olduğundan, oksijen doğrudan bu membran aracılığıyla mikro kanallara iletilebilir. Tüm bileşenler hazırlandıktan sonra, her bir yapıştırma yüzeyi bir dakika boyunca oksijen plazma işlemine tabi tutulur.

El tipi bir plazma cihazı kullanarak, önce altı mikro kanal bileşenini sütun dizisine bağlayın, ardından gaz girişleri ve çıkışları olarak işlev görmesi için her sütunda iki delik açın. Son olarak, yapışmayı kolaylaştırmak ve kabarcıkları dışarı atmak için zarı mikro kanalın altına yapıştırın. Plazma ile muamele edilmiş yüzeyler, karışım, bir cımbız ucu kullanılarak yaklaşık bir dakika boyunca birbirine bastırılır, cihazın tamamen bağlandığından ve kalibre edilebildiğinden emin olmak için her yapıştırma arasında bir saat beklenir.

Eksiksiz bir cihaz üretildikten sonra, gerçek deneylerde oksijenasyon eki kullanılırken hücreler tarafından alınan oksijen seviyesinin kalibre edilmesi gerekir. Kalibrasyon için, oksijenle söndürülen bir floresan rutenyum boya kaplaması içeren bir floresan oksijen sensörü veya tilki slaytı kullanın. Foxy slaytlar, altı kuyulu bir plakanın dibine sığacak şekilde önceden kesilmiştir.

Tilki slaytı, kuyu yüzeyini mümkün olduğunca kaplayacak şekilde kesilmelidir. Tilki slaytı yaklaşık bir milimetre kalınlığa sahip olduğundan, yeterli zar için istenen mesafeyi korumak için cihazı değiştirin. Slayt difüzyonu.

Bu mesafe deneye bağlıdır, ancak çoğu durumda elde taşınan plazma cihazı dört kesim bir milimetre kalınlığında cam mikroskobu kullanılarak bir milimetrenin altında olmalıdır. Yaklaşık altı milimetre uzunluğunda ve dört milimetre genişliğinde direkleri cihazın altına kaydırın. Cihaz, kayar kesimin üzerindeki direklere dayanacaktır.

Cam kapak kızakları, oksijen kullanımını doğrulamak için 0,17 milimetrelik bir difüzyon boşluğu için de kullanılabilir. Oda sıcaklığında üç mililitre deiyonize su, oksijenin ölçüleceği altı kuyulu plakanın kuyularına yerleştirilir. Cihazı plakaya yerleştirin ve metamorf yazılımını kullanarak, tilki sensöründe istenen konumların sayısını ve konumunu seçin.

Oksijen konsantrasyonlarını test etmek için kaydırın. Oksijen gazı tankı ile hipoksik yerleştirme cihazı arasına tai tabancası hortumunu bağlayın. Verilen gazın hassas kontrolü için dakikada 50 ila 100 mililitre akış hızına ayarlanmış hassas bir akış regülatörü kullanılır.

Hassas akış regülatörünün kapalı olduğundan emin olun. Önce tank üstü regülatörü, ardından hassas regülatörü açın. 15 dakika sonra akış hızını dakikada 10 ila 20 arasına düşürün.

Suda kabarcık oluşmasını önlemek için, önümüzdeki bir saat boyunca akış hızı değerini yakından izleyin ve sistem dengelenirken basınç düşüşü değişeceğinden, plakanın ve tilki sensörlerinin görüntülerini yakalamak için akış hızını değiştireceğinden gerektiği gibi ayarlamalar yapın. Floresan donanımlı Olympus IX 71 mikroskobu, Q Imaging'den bir şarj çifti cihaz kamerası, Tiga, SRV ve Metamorpho görüntü elde etme yazılımları kullanılmaktadır. Mikroskop, 475 nanometre uyarma dalga boyuna ve 600 nanometre emisyon dalga boyuna sahip tilki uyumlu bir floresan filtre olan Olympus 3 1 0 2 0 ile donatılmıştır.

Cihaz için dengeleme süresini ve oksijenasyon derecesini test etmek için, oksijen konsantrasyonunun ölçüleceği tilki slaytında üç nokta seçin. Gaz akışına başlamadan hemen önce slaytın bir görüntüsünü yakalayın. Heterojenliği ve oksijen iletimini test etmek için gaz cihazdan akarken 30 dakika boyunca 10 saniyelik görüntüler ve aralıklar yakalayın.

Kanalın genişliğini kapsayan bir milimetre aralıklarla birden fazla nokta oluşturun ve metamorf kullanarak kuyu yüzeyindeki oksijen konsantrasyonunu ölçün. Her konum için ortalama görüntü yoğunluğunu dışa aktarın ve floresan yoğunluğuna bağlı olarak oksijenasyon konsantrasyonunu çizin. Floresan yoğunluğunu oksijen konsantrasyonuyla ilişkilendiren sıfır ila %10 çizgisine ve %10 ila %21 çizgisine doğrusal eğriler uydurarak bir kalibrasyon eğrisi oluşturun: Her konum için ölçülen ham yoğunluk verileri metamorftan dışa aktarılabilir ve Microsoft Excel veya diğer istatistiksel yazılımlarla daha fazla analiz edilebilir.

Cihaz kalibre edildikten sonra, yara iyileşme tahlilleri gibi deneyler, kalibre edilmiş ek parçayı deneyden önceki 24 saat içinde 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlamaya başlayabilir ve sonraki kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı bir kültür başlığında onunla çalışabilir. Plaka kuyucuk kültürüne, MDCK hücrelerine veya diğer yapışkan hücrelere yerleştirirken gaz kabarcıklarını önlemek için sterilize edilmiş PDMS ekini 24 saat boyunca serum içermeyen bir ortamda bekletin, altı oyuklu bir plakada %100 co akıcılığına kadar mono katmanlarda düz çizikler oluşturun P 200 pipet ucu ile. Çizikler, yapışık tek tabakadaki yaraları simüle eder.

Tek tabakayı bozmadan hücre ortamını aspire edin ve beş mililitre ortam ile durulayın. Tekrar aspire edin ve kuyucukları üç mililitre serumsuz olarak doldurun. Orta: Kabarcıkları önlemek için cihazı yavaşça plakaya yerleştirin.

Yerleştirme sırasında cihazın açılandırılması, kabarcıkların bir taraftan dışarı atılmasına yardımcı olur. Cihaza aşırı baskı uygulamaktan kaçınmaya dikkat edin, bu da PDMS'yi alttaki hücreleri ezecek kadar deforme edebilir. Plakayı ve cihazı 37 santigrat derece ısıtılmış bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve kaynak gaz tankından gelen boruları cihazın giriş ve çıkış portlarına bağlayın.

Kültür inkübatörü, boru girişine izin verecek bir deliğe sahip olmalı ve boru bağlanmalıdır Cihazı inkübatöre yerleştirdikten sonra, yara iyileşmesini değerlendirmek için daha önce tarif edilenle gaz akışını başlatmak için aynı prosedürü izleyin. Daha önce tarif edildiği gibi ekipman ve görüntüleme yazılımı kullanarak 15 ila 18 saat boyunca her 20 dakikada bir hücrelerin hızlandırılmış görüntülerini yakalayın, T çizik bir yara ölçüm algoritması, istenen bir deney süresinden sonra iyileşmemiş yüzey alanını analiz etmek için kullanılabilir. Gaz akışını durdurun, plakayı çıkarın ve istenirse daha fazla hücre işlemeye devam edin. Hipoksik yerleştirme cihazı, burada gösterildiği gibi% 0,5 oksijene stabilize etmek için iki dakikadan az bir süre gerektirir.

Cihaz membranı kuyusu alt boşluk boyutu, kararlı durum oksijen konsantrasyonu değerlerine ulaşmak için daha fazla zaman gerektiren daha büyük boşluk boyutları ile dengeleme verimliliğinin belirlenmesinde kritik bir faktördü. Cihaz aynı zamanda tek bir kuyuda mekansal oksijenasyon üzerinde büyük bir kontrole izin vererek, birden fazla koşulun oluşmasına ve hatta kuyu yüzeyi boyunca döngüsel bir oksijen profili oluşturulmasına izin verir. MDCK hücre tek tabakaları %10 veya %21 oksijene maruz bırakıldı ve yaranın yüzey alanı zaman içinde MATLAB Ts çizik yara kuyruğu algoritması kullanılarak analiz edildi.

Toplam 17 saatlik 11 saat sonra, %10 oksijene maruz kaldığında orijinal yaranın %6.87'si kalırken, yaranın %64.4'ü %21'in altında kaldıBurada gösterildiği gibi, oksijen konsantrasyonları her iki oksijen konsantrasyonu için yara açık alanı ile negatif korelasyon gösterir. Deney süresince, size bir çizik yara iyileşme testi için hipoksik yerleştirme cihazının nasıl üretileceğini, doğrulanacağını ve kullanılacağını gösterdik. Cihaz, daha küçük bir laboratuvar ayak izi ve hücre yüzeyindeki uzamsal ve zamansal oksijenasyon üzerinde çok daha fazla kontrol gibi diğer oksijenasyon sistemlerine göre bir dizi avantaj sunar.

Cihaz, oksijen veya karbondioksit gibi diğer gazların in vitro hücre kültürleri üzerindeki etkisini inceleyen hemen hemen her laboratuvar tarafından kullanılabilir. Bu prosedürü yaparken, sterilize edilmiş cihazı ve kültür ortamını gece boyunca ıslatmak ve deney sırasında kabarcık oluşumunu en aza indirmek önemlidir. Ek olarak, deneye başlamadan önce sistemin eşitlemesine izin verin.

Bunun nedeni, sistemdeki basınç eşit oldukça akış hızının değişmesidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.