Name: İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-06T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Keşfedin, hücre kültürlerinde oksijenasyon kontrolünü artıran hipoksik insert cihazının imalatını ve doğrulanmasını. PDMS ve fotolitografi kullanılarak üretilen bu yöntem, yara iyileşmesi üzerindeki oksijen etkilerini incelemek için uzamsal ve zamansal oksijen manipülasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, Illinois Halk Sağlığı Bölümü ve Ulusal Bilim Vakfı (DBI-0.852.416) tarafından finanse edildi.

1. Cihaz işlevi <ol><li> Hipoksik eklemek cihaz 6-sütunlar içerdiğini standart 6-plaka içine yuva. Gaz direğinin dibinde mikroakışkan ağ üzerinden ayağı içine akar ve cihazın geri akar. Mikrokanallı alt duvarını oluşturan direği dibinde Mikrokanallı gaz ve kültür ortamı arasındaki oksijen difüzyon izinleri 100 mikron kalınlığında bir gaz geçirgen PDMS membran. Böylece, cihazın istenen değere doğru medya oksijen konsantrasyonu sürücüler bir konsantrasyon gradiyenti kurarak çalışır. </li><li> Bir cihaz hipoksik odası ve diğer hücre oksijenasyonu sistemleri üzerinde bir dizi avantaj sunar: 1)) daha hızlı zamansal kontrol, 2 izin oksijen difüzyon yolu en aza indirir, ayağı Mikrokanallı tasarım, 3 bağlı oksijenasyon üzerinde mekansal kontrol) artırır sahip küçük bir laboratuvar ayak izi ve deneysel verimliliği artırmak için daha yüksek verim ve 4), özel bilgi ve ekipman için gereksinimi olmadan ortak hücre kültürü araçları (örneğin multiwell plaka) uyarlar. </li></ol> 2. Cihaz fabrikasyon <ol><li> İlk ayağı dizisi PDMS ile daha önce işlenmiş bir Delran kalıp kalıp kopyasıdır. </li><li> Sonraki gaz her ayağı altındaki Mikrokanallı standart SU-8 fotolitografi ve PDMS çoğaltma kalıp kullanılarak imal edilir. </li><li> Gaz geçirgen zar, istenilen kalınlığı elde etmek için bir silikon yonga üzerinde PDMS tanımlanan iplik üretilir. Bu örnekte 10 saniye için 500 rpm ve daha sonra 30 saniye süreyle 900 rpm dönen tarafından imal edilen 100 mikron kalınlığında bir membran kullanın. </li><li> Tüm bileşenleri bir el plazma cihazı (Model BD-20, Elektro-Teknik Ürünler) ile oksijen plazma tedaviden sonra bir araya yapıştırılır. </li></ol> 3. Cihaz ayarları <ol><li> Yavaşça cihazın kabarcıkları önlemek için emin olun, plakası takın. Yerleştirilmesi sırasında cihazın bir tarafında kabarcıklar Olta sınırdışı etmeye yardımcı olur. Gerçek hücre tabanlı deneyler için, bu adımı steril bir laminer akış kaputu içinde yapılmalıdır. Cihazın takılı bir kez kirlenme şansı büyük ölçüde azalır, montaj inkübatör, steril olmayan bir ortamda yapılabilir. </li><li> Boru kaynak gaz tankı cihazın giriş ve çıkış portlarına bağlayın. Hücre tabanlı deneyler için, kültür inkübatör boru giriş ve boru cihaz taşıma ve kuvöz içine yerleştirerek sonra bağlı olmalıdır izin verecek bir delik olmalıdır. Altta yatan hücreler ezmek için yeterli PDMS deforme cihazı, aşırı basınç koyarak önlemek için dikkatli olun. </li><li> Hassas akış regülatörü, cihaz taşan önlemek için tank top regülatörü açmadan önce kapalı olduğundan emin olun. Gaz akışını başlatın. Istenen akış hızı (50-100 ml / dk) hafifçe açık hassas akış regülatörü. Basınç düşüşü akış hızını değiştirerek sistemi, equilibrates değişecek, bir sonraki saatten fazla değer yakından izlemek ve gerekli değişiklikleri yapmak. Medya kabarcıklarının oluşumunu önlemek için, yüksek debili bir ilk 15 dakika dengelenme süresi sonra 10-20 arasında ml / dk akış hızını azaltır. </li><li> Istenilen deneme süresinden sonra, gaz akışını durdurmak, plaka kaldırmak ve süreç hücrelerin buna göre (örneğin, vb, sayım, leke, lyse). </li></ol> 4. Aygıt Doğrulama <ol><li> Ayarlama <ol><li> Floresan oksijen pozisyonların sayısı ve konumu seçin. (FOXY) oksijen ölçümü için kullanılan sensör slayt (doğrulama gereksinimlerine göre). Slayt oksijen ile söndürülür floresan Rutenyum boya kaplama içerir. </li><li> 0, 10 slayt Açığa ve doğrudan gaz tankeri,% 21 oksijen ve düzgün dengelenmesi için 5 dakika sonra görüntüleri yakalayabilir. </li><li> Floresan yoğunluğuna bağlı olarak her bir pozisyon ve arsa oksijenasyonu konsantrasyonu ortalama görüntü yoğunluğu ihracat. </li><li> % 0-10 çizgisine uyan doğrusal eğrileri ve 10-21% hattı kalibrasyon eğrisi oluşturun. </li></ol></li><li> Heterojenite <ol><li> Belirli bir aralığı (örneğin her 1 mm) kanal genişliği kapsayan birden çok nokta oluşturulması. Boşluğu bağlı olarak görüntüleri üst üste olabileceğini unutmayın. </li><li> Cihaz üzerinden iyi yüzey oksijen konsantrasyonu ölçün </li></ol></li><li> Dengeleme <ol><li> Oksijen konsantrasyonu ölçmek için üç puan FOXY slayt seçin. </li><li> Ortam oksijen seviyesi ilk fotoğraf çekiminden hemen sonra, cihazın içine gaz akışını başlatmak için hassas akış regülatörü açın. Oksijen Concentr süresi ve kapsamı değerlendirmek için uygun bir aralıkta görüntüler yakalayınation dengeleme (örneğin her 10 saniyede bir 30 dakika). </li></ol></li></ol> 5. Uygulamalar <ol><li> Yara İyileşmesi <ol><li> Deneyden önce bir gün serum orta, iyi gaz kabarcık oluşumunu engellediğini azaltmak için sterilize PDMS eklemek bekletin. </li><li> 6 plaka% 100 confluency Kültür hücreleri. </li><li> Yaralar simüle etmek için bir P200 pipet ile mono tabakaları düz çizikler oluşturun. </li><li> Hücre aspire medya, 5 ml medya ile temizleyin, durulayın ve tekrar aspire. Hücrelerin tek tabaka rahatsız değil önemlidir. </li><li> Yedek hücre proliferasyonu azaltmak için 4 ml serum orta kuyular. </li><li> Place kuyuların içine yerleştirin ve karşılık gelen bir oksijen konsantrasyonu her iyi bağlamak. </li><li> 37 ısıtılmış sahnede eki ile birlikte koyun 6-plaka ° C </li><li> Istenen aralık ve toplam süresi hücrelerinin zaman atlamalı görüntüleri yakalayın. MATLAB T_Scratch, bir yara ölçüm algoritması, iyileşmeyen yüzey alanı analiz etmek için kullanılır. </li></ol></li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> Cihaz doğrulama Hipoksik eklemek cihaz,% 0.5 oksijen stabilize etmek için en az 2 dakika gerektiren, oksijen dengeleme zamanı ve kapsamı açısından hipoksik odasının içinde büyük gelişmeler sergilemektedir. Cihazın membran kuyu alt boşluğu boyutu, daha büyük boşluk boyutları kararlı durum oksijen konsantrasyonu değerlerine ulaşmak için daha fazla zaman gerektiren, dengeleme verimliliği belirleyen en kritik faktör oldu. Cihaz, aynı zamanda birden fazla koşul oluşumuna izin, tek bir kuyuda mekansal oksijenasyonu büyük bir anlaşma üzerinde kontrol izin verir, ve hatta iyi bir yüzey üzerinde döngüsel bir oksijen profili oluşturmak. </li><li> Yara iyileşmesi % 10 veya% 21 oksijen ve yara yüzey alanı hücre mono tabakaları maruz kaldılar zamanla analiz edildi. % 21 oksijene maruz çizikler yavaş ve% 10 hızlı kapattı. Şekil 1, 17 saat boyunca bir çizik görüntüleri gösterir. Şekil 5 grafikler, açık yara alan deney süresi boyunca her iki oksijen konsantrasyonları için yüzde göstermektedir. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"></a> Şekil 1 şematik ve cihaz özellikleri gösteren diyagramları. Oksijen eklemek cihaz geleneksel fotolitografi (mikroakışkan network), çoğaltma kalıplama (mikroakışkan ağ ve insert iskele) tarafından imal ve (gaz geçirgen zar) PDMS iplik tanımlanır. A) oksijen cihazı 6 plaka iç içe. B) 24 ve 96-kuyu direği dizileri örnekleri. C) bir ayağı çapraz-kesitsel şematik. Oksijen giriş üzerinden cihazın içine akar ve ayağı altındaki mikroakışkan bir ağ üzerinden geçecek. Oksijen, gaz geçirgen PDMS membrandan serbestçe direğinin altındaki diffüz ve kültür ortamı içine çözülür. D) dengeleme çalışmaları için gümrüklü cam Mesajları, üstten tek kanallı bir sütun çeşitli özellikler gösteren bir mikroskop görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"></a> Şekil 2 oksijen sensörleri ile cihazın Doğrulama. Oksijen basıncı her bir kuyunun içinde bir düzlemsel rutenyum oksijen sensörü kullanılarak karakterize edilmiştir. Tüm oksijen karışımları medya tamponlama için dengeli azot ve% 5 CO 2 içeriyordu. A) Denge süresi ve etkinliği üzerinde Arsa yazılan yüksekliğinin etkisi gösteren ve böylece membran ve hücreleri arasındaki oksijen difüzyon mesafesi. Heights cihazın altına bağlı kesme cam Mesajları kuruldu. Her üç yazılan boyutları verim dengeleme kez hipoksik odasının içinde çok geliştirdi. Zaman bir günlük ölçekte olduğunu unutmayın. B) Arsa hızlı oksijen dengeleme tepki süresi 0,2 mm boşluk cihazın tasvir. C) Çok konumlu linescans da Mikrokanallı altında iyi genelinde cihaz tarafından tanıtılan oksijen konsantrasyonu homojenliği sağlamak için alınmıştır. Grafik,% 0,% 10, ve 10 dakika süreyle% 21 oranında oksijen beslerken sonra ölçülen oksijen konsantrasyonu gösteriyor. D) Cihaz, 5 gün boyunca etkili% 10 oksijen korur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="Şekil 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"></a> Şekil 3, daha karmaşık oksijen Mikrokanallı tasarımları ile denemeleri . A) Çift koşulu Mikrokanallı kurulum, istikrarlı bir% 0 ve 14 gün içinde% 21 oksijen profili verir. B) 500 mikron genişlik mikro bir interdigitated ve sarma desen inci boyunca uzanandöngüsel bir oksijen profili e ayağı sonuçlanır. Mikrokanallı hizalama zor olduğu gibi veriler sadece bir temsilci deneme gösteriyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="Şekil 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"></a> Şekil 4 yaranın kapanması 0, 7, ve 17 saat sonra ilk sıfırdan Timelapse görüntüler. Hücreler Deney süresi boyunca% 21 oksijen teslim edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="Şekil 5" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"></a> Şekil 5, oksijen konsantrasyonu üzerinde bir çizik tayininde yara iyileşmesi oranı etkisi .

SU-8 standart fotolitografi çoğaltma kalıplama, ve iplik ve polidimetilsiloksan tamamen tanımlanan cihaz tarafından imal. Gaz, istenen denge oksijen konsantrasyonu doğru sistem, sürüş Mikrokanallı ayağı ve kültür ortamı arasında konsantrasyon farkı kurmak için cihazın içine tanıtıldı. Cihaz, bir kuyu içinde zamansal ve mekansal oksijenasyonu modüle, yanı sıra uygun bir şekilde hücresel davranışı modüle gösterilmiştir. Oksijenasyon mekansal desenlendirme direğinin dibinde Mikrokanallı tarafından tanımlanan, çeşitli tasarımlar photomask işçiliği uygulanan olabilir. Ayrıca, iyi gaz fazına istenen gaz infüzyon, dengeleme zamanı ve kapsamı hipoksi geliştirmek için bekleniyor. Mikroakışkan karıştırma ağ sadece birkaç stok gaz tankları roman gaz karışımları üretmek için bir araç sağlamak için cihaza adapte olabilir. Son olarak, medya değişimi için bir mekanizma hücreleri yanıt verebilir multiwell plaka, cihazın çıkarılması için ihtiyaç ortadan kaldıracaktır. Cihaz in vitro veya ex vivo deneyi oksijen konsantrasyonu üzerinde kontrol gerektiren herhangi bir uygulamalar vardır. Oksijen sinyal yolları büyük bir çoğunluğu etkileyen önemli bir fizyolojik değişken olduğundan, yararlanacak araştırma alanlarında araştırmacı yaratıcılığı ile sınırlıdır. Diğerleri arasında kanser metastazı, uyku apnesi ve kardiyak iskemi reperfüzyon hasarı, oksijen konsantrasyonu gelişmiş temporal kontrolü yararlanacak bazı alanlar şunlardır. Örneğin, aralıklı hipoksi sürekli hipoksi ve normoxia göre metastastis ilişkili genlerin bir dizi upregulating, daha invaziv kanserler ile ilişkili. Mekansal kontrolü oksijen gradyanlar geliştirme, karaciğer zonation, ilaç zehirlenmesi, ve kök hücre niş kritik olduğu gibi, aynı zamanda önemlidir. Bu makalede sunulan cihaz, bir sistem, daha küçük bir laboratuvar ayak izi, nispeten basit operasyonel gereksinimleri ve hücrelere oksijen aşırı maruz kalmak çok daha fazla kontrol sağlayarak araştırma alanlarında bir dizi fayda sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>PDMS-Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Planar FOXY sensörü</td><td>Ocean Optics</td><td>FOXY-SGS-M</td><td>Kaplanmış mikroskop lamı</td></tr><tr><td>Gaz regülatörü</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>FL-1472-G</td><td></td></tr><tr><td>Gaz</td><td>Airgas</td><td>Özel karışımlar</td><td>Hepsinde %5 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; bulunur</td></tr><tr><td>SU-8 2150</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin içeren MDCK Büyüme Ortamı</td><td>SAFC Global</td><td>M3803</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin solüsyonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr></tbody></table>

İmalat ve operasyon yapışkan hücresel kültürler oksijen ekle

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oksijen birçok hücresel yollar önemli bir modülatör, ancak mevcut cihazların izin<em&gt; In vitro</em&gt; Oksijen modülasyon biyomedikal araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için başarısız olur. Hipoksik odasına standart kültür damarlarındaki oksijenlenme kontrol etmek için basit bir sistem sunuyor, ancak, fizyolojik olayların çeşitli eğitim uygulaması önlenmesi, hücre yüzeyinde bulunan oksijen konsantrasyonu üzerinde tam zamansal ve mekansal kontrol yoksun. Diğer sistemler hipoksik odasının üzerine geliştirilmiş, ancak kendi çalışması için özel bilgi ve ekipman gerektiren, ortalama araştırmacı için onları korkutucu hale getirir. Multiwell plakaları için microfabricated eklemek bulundu iyi model fizyolojik olgular için zamansal ve mekansal oksijen konsantrasyonu daha etkili bir şekilde kontrol etmek için geliştirilmiştir<em&gt; In vivo</em&gt;. Platformu, standart bir multiwell plakasına yuvaları ve pasif mikroakışkan amaçlayan bir gaz geçirgen bir zar ile gaz ağının olarak hizmet vermektedir yapışık hücrelere oksijen sunumunu modüle polidimetilsiloksan eklemek oluşur. Cihaz kullanımı kolay ve platform haline istenen oksijen konsantrasyonu tanıtmak basınç sağlayan gaz silindirleri bağlı. Fabrikasyon bir silikon yonga üzerinde iplik standart SU-8 fotolitografi, çoğaltma kalıplama, ve tanımlanmış PDMS bir kombinasyonu içerir. Cihazın bileşenleri, elde tutulan bir plazma sistemi kullanılarak yüzey tedaviden sonra yapıştırılır. Doğrulama düzlemsel floresan oksijen sensörü ile gerçekleştirilebilir. Dengelenme zamanı dakika sırasına ve oksijen profilleri geniş bir yelpazede bulunan bu taklit etmek için, bu çalışmada elde edilen siklik profili olarak cihaz tasarımı, ve hatta oksijen gradyanlar göre elde edilebilir<em&gt; In vivo</em&gt;. Cihaz fonksiyon kaybı olmadan ortak yöntemler kullanılarak hücre kültürü için sterilize edilebilir. Okuyan cihazın uygulanabilirliği<em&gt; In vitro</em&gt; Yara iyileşmesi tepki gösterdi.

6 plaka mekansal ve zamansal oksijenasyonu üzerinden gelişmiş kontrol imkanı sağlayan bir add-on bir platform imalatı ve doğrulama. Cihaz bir dizi kültür sistemleri uyarlanabilir ve yara iyileşmesi üzerine oksijen etkilerini araştırmak amacıyla kullanılabilir.

İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Oksijen, birçok hücresel yolağın temel bir modülatörüdür; ancak in vitro oksijen modülasyonuna izin veren mevcut cihazlar, biyomedikal ihtiyaçları karşılamakta yetersiz kalmaktadır...

Hipoksik insert cihazı, altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleşen altı sütuna sahiptir. Gaz, sütunun tabanındaki mikroakışkan ağ üzerinden akar ve gaz ağı ile kültür ortamını ayıran gaz geçirgen PDMS membran boyunca difüze olabilir. Bu cihaz, oksijen kaynağı (sütun tabanındaki mikroakışkan ağ) ile hücreler arasındaki difüzyon yol uzunluğunu minimize ederek oksijen konsantrasyonunun daha hızlı dengelenmesini sağlar.Cihaz ayrıca, foto maskeler kullanılarak standart fotolitografi ile oluşturulan mikroakışkan gaz ağı tasarımı tarafından belirlenen, hücrelerin maruz kaldığı oksijenin uzaysal deseni üzerinde çok daha fazla kontrol sağlar. Merhaba, ben Illinois Üniversitesi Chicago Kampüsü Biyomühendislik Bölümü'ndeki Dr. David Edington laboratuvarından Sean Ard. Merhaba, ben de Edington Laboratuvarı'ndan Ellie.Bugün size, altılı plakadaki in vitro hücre kültürlerini farklı oksijen konsantrasyonlarına maruz bırakmak için özel bir cihazın nasıl üretileceğini, doğrulanacağını ve kullanılacağını göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, oksijenin yara iyileşmesi, reaktif oksijen türleri oluşumu ve migrasyon üzerindeki etkilerini incelemek için kullandık. Öyleyse başlayalım.Oksijenlendirme insertinin üretimine başlamak için, ön polimer ve kürleme ajanı arasında 10'a bir oranında Polimetil Siloksan veya PDMS hazırlayın. Üretici talimatlarına göre, PDMS karışımı, standart altı kuyucuklu kültür plağının şeklini taklit edecek şekilde desenlenmiş, önceden işlenmiş bir kalıba eklenir. 75 °C'de gece boyunca kürlendikten sonra, ortaya çıkan replika kalıplanmış sütun dizisi, oksijenlendirme insertini oluşturan üç bileşenden ilkini oluşturacaktır; oksijenlendirme insertinin ikinci ana bileşenini üretmek için.Bir SU-8 master kalıbı, öncelikle SU-8 2150 spin kaplama yöntemiyle hazırlanır. Silikon bir gofret üzerine fotomaske uygulanır ve mikrokanal kalınlığı 300 µm olacak şekilde bir master kalıp oluşturmak için SU-8, fotomaske aracılığıyla UV ışığına maruz bırakılır. SU-8 Master'ın üzerine PDMS dökülür ve her bir sütunun tabanında mikrokanalları oluşturacak olan pozitif kalıbı elde etmek için 75 °C'de iki saat boyunca kürlenir.Cihazın üçüncü bileşeni, önce 10 saniye boyunca 500 RPM'de, ardından 100 mikrometre kalınlığında bir membran elde etmek için 30 saniye boyunca 900 RPM'de bir silikon gofret üzerine PDMS döndürülerek üretilir. PDMS gaz geçirgen olduğu için, oksijen bu membran aracılığıyla doğrudan mikro kanallara iletilebilir. Tüm bileşenler hazırlandığında, her bir yapıştırma yüzeyine bir dakika boyunca oksijen plazma işlemi uygulanır.Bir el tipi plazma cihazı kullanarak önce altı mikrokanal bileşenini pillar dizisine yapıştırın, ardından gaz girişleri ve çıkışları olarak hizmet edecek şekilde her pillar üzerinde iki delik açın. Son olarak, yapıştırmayı kolaylaştırmak ve varsa hava kabarcıklarını tahliye etmek için membranı mikrokanalın altına yapıştırın. Plazma ile işlem görmüş yüzeyler, bir cımbızın ucu kullanılarak yaklaşık bir dakika boyunca birbirine bastırılır; cihazın tamamen yapıştığından emin olmak ve kalibre edilebilmesini sağlamak için her yapıştırma işlemi arasında bir saat beklenir.Tam bir cihaz üretildikten sonra, gerçek deneylerde oksijenlendirme eklemi kullanılırken hücrelerin aldığı oksijen seviyesinin kalibre edilmesi gerekir. Kalibrasyon için, oksijen tarafından sönümlenen floresan rutenyum boya kaplaması içeren floresan bir oksijen sensörü veya foxy lamı kullanın. Foxy lamları, altı kuyuklu bir plaketin tabanına sığacak şekilde önceden kesilmiştir.Foxy lamı, kuyu yüzeyinin mümkün olduğunca büyük bir kısmını kaplayacak şekilde kesilmelidir. Foxy lam yaklaşık bir milimetre kalınlığında olduğundan, yeterli membran difüzyonu için istenen mesafeyi koruyacak şekilde cihazı modifiye edin.Bu mesafe deneye bağlıdır, ancak çoğu durum için el tipi plazma cihazı kullanılarak bir milimetrenin altında olmalıdır; bir milimetre kalınlığında cam mikroskop lamı kullanarak yaklaşık altı milimetre uzunluğunda ve dört milimetre genişliğinde destekler kesin ve bunları cihazın altına yerleştirin. Cihaz, lam üzerindeki bu desteklerin üzerinde duracaktır.Oksijen kullanımını doğrulamak için 0,17 milimetrelik bir difüzyon boşluğu amacıyla cam lameller de kullanılabilir. Oksijenin ölçüleceği altı kuyucuklu plakanın kuyucuklarına oda sıcaklığında üç mililitre deiyonize su ekleyin. Cihazı plakanın içine yerleştirin ve metamorph yazılımını kullanarak foxy sensörü üzerindeki istenen konumların sayısını ve yerini seçin.Oksijen konsantrasyonlarını ölçmek için lamı kaydırın. Oksijen gaz tankı ile hipoksik ekleme cihazı arasındaki tai gun borusunu bağlayın. Verilen gazın hassas kontrolü için dakika başına 50 ila 100 mililitre akış hızına ayarlanmış bir hassas akış düzenleyici kullanılır.Hassas akış regülatörünün kapalı olduğundan emin olun. Önce tank üstü regülatörü, ardından hassas regülatörü açın. 15 dakika sonra akış hızını dakikada 10 ile 20 arasına düşürün.Suda kabarcık oluşumunu önlemek için, sistem dengelenirken basınç düşüşü değişeceği ve bu durum plak ile foxy sensörlerin görüntülerini yakalamak için akış hızını değiştireceği için, önümüzdeki bir saat boyunca akış hızı değerini yakından izleyin ve gerektiğinde ayarlamalar yapın. Floresans donanımlı bir Olympus IX 71 mikroskobu, Q Imaging Tiga'dan bir şarj bağlılı cihaz (CCD) kamera, SRV ve Metamorpho görüntüleme yazılımları kullanılmıştır. Mikroskop, 475 nanometre uyarım dalga boyuna ve 600 nanometre emisyon dalga boyuna sahip, foxy uyumlu bir floresan filtre olan Olympus 3 1 0 2 0 ile donatılmıştır.Cihazın dengelenme süresini ve oksijenasyon derecesini test etmek için, foxy lam üzerinde oksijen konsantrasyonunun ölçüleceği üç nokta seçin. Gaz akışını başlatmadan hemen önce lamın bir görüntüsünü yakalayın. Heterojenliği ve oksijen iletimini test etmek için, gaz cihazdan akarken 30 dakika boyunca 10 saniyelik aralıklarla görüntüler yakalayın.Kanal genişliği boyunca bir milimetre aralıklarla birden fazla nokta belirleyin ve metamorph kullanarak kuyucuk yüzeyindeki oksijen konsantrasyonunu ölçün. Her konum için ortalama görüntü yoğunluğunu dışa aktarın ve oksijenasyon konsantrasyonunu floresan yoğunluğuna bağımlı olarak grafiğe dökün. Floresan yoğunluğunu oksijen konsantrasyonuyla ilişkilendiren %0 ila %10 hattına ve %10 ila %21 hattına doğrusal eğriler uydurarak bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Ölçülen her bir konum için ham yoğunluk verileri metamorph'tan dışa aktarılabilir ve Microsoft Excel veya diğer istatistiksel yazılımlarla daha detaylı analiz edilebilir.Cihaz kalibre edildikten sonra, yara iyileşmesi deneyleri gibi çalışmalara başlanabilir; kalibre edilmiş inserti deneyden önceki 24 saat içerisinde 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın ve sonraki kontaminasyonları önlemek için laminar akışlı kültür kabininde çalışın. Gaz kabarcıklarını önlemek için sterilize edilmiş PDMS inserti, plaka kuyucuklarına yerleştirmeden önce 24 saat boyunca serumsuz ortamda bekletin. MDCK hücrelerini veya diğer yapışkan hücreleri altı kuyucuklu bir plakada %100 konfluensle kültüre edin; tek katmanlarda P 200 pipet ucuyla düz çizikler oluşturun. Bu çizikler, yapışkan tek katmandaki yaraları simüle eder.Monotabakayı bozmadan hücre besiyerini aspire edin ve beş mililitre besiyeri ile durulayın. Tekrar aspire edin ve kuyucukları üç mililitre serumsuz besiyeri ile doldurun. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek cihazı plakaya nazikçe yerleştirin.Cihazın yerleştirme sırasında açılı tutulması, kabarcıkların bir taraftan dışarı atılmasına yardımcı olur. PDMS'yi, alttaki hücreleri ezebilecek kadar deforme edebilecek aşırı basınç uygulamaktan kaçının. Plakayı ve cihazı 37 °C sıcaklığa ısıtılmış bir mikroskop tablasına yerleştirin ve gaz kaynağı tankından gelen tüpleri cihazın giriş ve çıkış portlarına bağlayın.Kültür inkübatöründe tüplerin girişine izin verecek bir delik bulunmalı ve tüpler bağlanmalıdır. Cihaz inkübatöre yerleştirildikten sonra, yara iyileşmesini değerlendirmek için gaz akışını başlatmak üzere önceden açıklanan prosedürü izleyin; önceden açıklanan ekipman ve görüntüleme yazılımını kullanarak hücrelerin her 20 dakikada bir, 15 ila 18 saat boyunca zamanla hızlandırılmış görüntülerini yakalayın. İstenen deney süresinin ardından, iyileşmemiş yüzey alanını analiz etmek için bir çizik yara ölçüm algoritması kullanılabilir. Gaz akışını durdurun, plakayı çıkarın ve istenirse hücrelerin ileri işlemlerine geçin. Hipoksik insert cihazının, burada gösterildiği gibi %0,5 oksijen seviyesinde stabilize olması iki dakikadan kısa sürer.Cihaz membran kuyucuk taban boşluk boyutu, dengeye ulaşma verimliliğini belirlemede kritik bir faktördü; daha büyük boşluk boyutlarının, kararlı durum oksijen konsantrasyon değerlerine ulaşmak için daha fazla zamana ihtiyaç duyduğu görülmüştür. Cihaz ayrıca, tek bir kuyucuktaki mekansal oksijenasyon üzerinde yüksek düzeyde kontrol sağlayarak birden fazla koşulun oluşturulmasına ve hatta kuyucuk yüzeyi boyunca döngüsel bir oksijen profilinin üretilmesine olanak tanır. MDCK hücre tek tabakaları %10 veya %21 oksijene maruz bırakılmış ve yaranın yüzey alanı, MATLAB Ts çizik yara izleme algoritması kullanılarak zaman içinde analiz edilmiştir.Toplam 17 saatin 11 saati sonunda, %10 oksijene maruz kalındığında orijinal yaranın %6,87'si kalırken, %21 oksijen altında yaranın %64,4'ü kalmıştır. Burada gösterildiği üzere, her iki oksijen konsantrasyonu için de oksijen konsantrasyonları ile yara açıklık alanı arasında negatif bir korelasyon vardır. Deney süresi boyunca, çizik yara iyileşme analizi için hipoksik insert cihazının nasıl üretileceğini, doğrulanacağını ve kullanılacağını göstermiş olduk. Cihaz, daha küçük bir laboratuvar alanı kaplaması ve hücre yüzeyindeki uzamsal ve zamansal oksijenasyon üzerinde çok daha fazla kontrol sağlaması gibi, diğer oksijenasyon sistemlerine göre bir dizi avantaj sunmaktadır.Cihaz, oksijenin veya karbondioksit gibi diğer gazların in vitro hücre kültürleri üzerindeki etkilerini inceleyen hemen hemen her laboratuvar tarafından kullanılabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, sterilize edilmiş cihazın ve kültür ortamının gece boyunca bekletilmesi ve deney sırasında kabarcık oluşumunun minimize edilmesi önemlidir. Ayrıca, deneye başlamadan önce sistemin dengelenmesine izin verin.Bunun nedeni, sistemdeki basınç dengelendikçe akış hızının değişmesidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Teknoloji, protokol ve yüksek verim yapışık hücre kültürü için kullanılan Corning HYPERStack gemiler ve aksesuarları işlenmesi halinde bir giriş. Protokol, mevcut yığılmış plaka ürünler üzerinde artan hücre hasat için kapalı sistem gemileri nasıl kullanılacağını gösterecektir.

Gaz Geçirgen Malzeme Teknolojisi HYPERStack gemiler Kapalı Sistem Hücre Kültürü Protokolü

Fermantörler biyomühendislik hücrelerinin kültür verim ve verimliliği artırmak için kullanılır. Çalkalama şişelerinde birden fazla mikrobiyal ya da hayvan hücre kültürü aday tarama sonra, bir sonraki mantıksal aşama fermantöre Seçilen kültürün biyokütle artırmaktır. Bu video, tipik bir tezgah üstü biyoreaktör sisteminin kurulumunu ve çalışmasını gösterir.

Bir Benchtop Biyoreaktör Operasyonu

Kültürdeki hücrelerin işlevsel davranışı, 3 boyutlu bir kültür ortamında 16-21 benzeri in vivo olarak daha fazla kültür iyileştirilebilir. Bu el yazması, in vivo benzeri memeli doku kültürü için bir içi boş fiber biyoreaktör sisteminin kurulum ve çalışması açıklanmaktadır.

için içi boş fiber Biyoreaktörler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Benzeri Memeli Doku Kültürü

Çok hücreli organizmalarda, salgılanan çözünür faktörler, parakrin sinyalizasyonunun bir sonucu olarak farklı hücre tiplerinden yanıtlar ortaya çıkarır. Insert ko-kültür sistemleri, hücre-hücre temasının yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin aracılık ettiği değişiklikleri değerlendirmek için basit bir yol sunar.

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Kimyasal ve oksijen gradyanlarının kontrolü hücre kültürleri için esastır. Bu makale, hücre göçü çalışmaları için kimyasal ve oksijen gradyanlarının kombinasyonlarını güvenilir bir şekilde üretebilen ve karmaşık enstrümantasyon olmadan biyolojik laboratuvarlarda pratik olarak kullanılabilen bir polidimetilsiloksan-polikarbonat (PDMS-PC) mikroakışkan cihazını bildirmektedir.

Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

Burada, tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar dolaşan bir protokol tümör progresyon adımları taklit eder ve birincil tümörün izole etmek için yardımcı olan bir ex vivo akciğer kanseri modeli için mevcut.

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Bu yazıda, yeni tasarlanmış bir 3D baskılı ek, bir ko-kültür modeli olarak sunulmuş ve endotel hücreleri ile keratinositler arasındaki parakrin hücreler arası iletişimin incelenmesiyle doğrulanmıştır.

Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

Retina pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde oksijen tüketim oranlarını (OCR) ölçmek için yeni bir cihaz sunuyoruz. Cihaz, plakalar standart bir hücre kültürü inkübatöründeyken standart hücre kültürü plakaları üzerinde standart ortamla büyütülen RPE üzerinde bir seferde haftalarca OCR'yi ölçebilir.

Yüksek Derecede Diferansiye ve Polarize Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Oksijen Tüketim Oranlarının Uzun Süreli İzlenmesi

Bu protokol, çift katmanlı bir mikroakışkan çip üretmek ve hızlı oksijen salınımları altında mikrobiyal büyümeyi analiz etmek için bir yöntem sunar. Cihazın performansı, sıvı kanallarında oksijen algılama ve mikrobiyal yetiştirme yoluyla doğrulandı.

Mikroakışkan Çift Katmanlı Cihaz Kullanarak Mikrobiyal Tek Hücreli Büyüme Analizinde Hızlı Oksijen Salınımları Oluşturma

Keşfedin, hücre kültürlerinde oksijenasyon kontrolünü artıran hipoksik insert cihazının imalatını ve doğrulanmasını. PDMS ve fotolitografi kullanılarak üretilen bu yöntem, yara iyileşmesi üzerindeki oksijen etkilerini incelemek için uzamsal ve zamansal oksijen manipülasyonu sağlar.

İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Daha fazla video keşfet