Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

Bu video makalesinde, Solaris QPCR analizleri kullanılarak gerçek zamanlı PCR gösterilmektedir. Solaris QPCR analizleri, belirli bir genin tüm bilinen ekleme varyantlarını tespit etmek için tasarlanmış gene özgü prob ve primer setleridir. Evrensel termal döngü koşulları altında, Solaris probu beş prime ucunda bir minör oluk bağlayıcı grup ve FA raporlayıcıya, üç prime ucunda ise gizlenmiş bir karanlık söndürücüye sahiptir.

Real-time PCR'nin denatürasyon basamağı sırasında, prob çözelti içinde kalır ve FAM raporlayıcı floresansı söndürülür. Tavlama ve uzama fazları sırasında, primerler ve prob hedef sekansa bağlanır ve söndürücü FAM'den ayrılır. Prob ayrıştığında FAM güçlü bir floresan sinyal verir ve ardından floresans tekrar söndürülür.

Bu etkili analiz yönteminin duyarlılığını, özgüllüğünü ve tekrarlanabilirliğini kanıtlayan gerçek zamanlı PCR sonuçları elde edilmiştir. Merhaba, ben Lafayette, Colorado'daki Thermo Fisher Scientific Araştırma ve Geliştirme Ekibi'nden James Covino. Bugün size Lars QPCR gen ekspresyon reaktiflerini kullanarak standart bir QPCR reaksiyonu kurma prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, RNA interferans teknolojilerini kullanarak hedef genlerin susturulmasını (knockdown) incelemek için bu prosedürü uyguluyoruz. Öyleyse başlayalım. Solaris QPCR assay STEM, insan ve farelerde anotasyon yapılmış genlerin %98'i için tek ve kullanışlı bir analiz sağlamak amacıyla MGB ve süper baz teknolojilerini kullanan benzersiz algoritması ile tanımlanır.

Genellikle, DNA probu ve primer tasarımı, bazların sayısı ve türü ile belirlenen prob erime sıcaklığı ile kısıtlanır. Daha uzun dizilerin ve GC açısından zengin dizilerin erime sıcaklıkları daha yüksektir. Solaris problarında kullanılan minör oluk bağlayıcı grup, DNA heliksinin minör oluğuna yerleşerek prob ile hedef dizi arasındaki etkileşimi stabilize eder.

Bu durum erime sıcaklığını artırarak daha kısa probların kullanılmasına olanak tanır. Solaris algoritması ayrıca, AT bağlarının stabilitesini artırmak ve guanin bakımından zengin dizilerdeki GG kendi kendine ilişmesini (self-association) önlemek için süper bazlar adı verilen modifiye nükleotidleri seçici olarak bünyesine katar. Bu, normalde kaçınılacak olan hedef dizilerin kullanımına imkan sağlar.

Bu teknolojilerin kullanımıyla sağlanan artırılmış sekans esnekliği, tek bir genin bilinen tüm ekleme varyantlarını tanıyan primer prob setlerinin tasarlanmasına olanak tanır. Spesifisiteyi artırmak amacıyla, kontamine genomik DNA amplifikasyonunu önlemek için mümkün olan her durumda hedef bölgeye ekzon birleşim bölgelerinin dahil edildiğini unutmayın; elde edilen primer prob setleri, spesifisiteyi sağlamak için genomik, transkript ve psödogen olmak üzere üç farklı veri tabanında blast analizine tabi tutulmuştur. Ayrıca, Solaris primer prob setleri tamamen optimize edilmiştir, böylece tüm QPCR analizleri için döngü koşulları özdeştir; bu da çeşitli transkriptlerin ekspresyonunun tek bir PCR çalışmasında değerlendirilmesine imkan verir.

qPCR R deneyini planlamaya başlamak için, thermo.com/solaris adresinde bulunan genius ürün aramasıyla, ilgilenilen gen için qPCR gerçekleştirmek üzere gerekli reaktifleri belirleyin. Arama sorgu kutusuna tıklayın ve uygun hedef organizmayı seçin. Genius ürün araması, birçok farklı gen tanımlayıcısını işleyebilir.Burada.

İlgi duyulan gene yönelik önerilen arama terimlerinden birini girin, ardından ara butonuna tıklayın, ilgi duyulan geni belirleyin ve sol taraftaki seç butonuna tıklayın. Bu işlem, ilgi duyulan gen için mevcut olan farklı reaktifleri gösteren bir pencere açacaktır. Solaris gen ekspresyon testi altındaki QPCR deteksiyon sekmesine tıklayın.

Optimal olarak tasarlanmış bir Solaris prob primer deneyi gösterilmektedir. Bu tek deney, ilgilenilen genin bilinen tüm ekleme varyantlarını saptayacaktır. Uygun primer ajanı belirlendikten sonra, menüden kullanılacak olan QPCR döngüleyiciyi bulun ve uyumlu master mix'i; ayrı bir ROX pasif referans boya şişesi içeren master mix'i, ROX mix'i veya düşük ROX mix'i belirleyin.

Burada Roche light cycler four 80 kullanılacaktır, dolayısıyla master mix plus rock vial kullanılacaktır. Ayrıca, çalışmaya uygun bir referans genin dahil edildiğinden emin olmak önemlidir. Tüm Solaris QP CR reaktifleri alındıktan sonra B two M kullanılacaktır.

Kullanılana kadar -20 °C'de saklanmalıdırlar. Reaktifler en az 12 ay boyunca stabildir. Tekrarlayan dondurma-çözme işlemlerinden kaçınılmalıdır.

Örnek RNA üzerinde ters transkripsiyon reaksiyonları gerçekleştirerek qPCR için cDNA hazırlayın. cDNA hazırlandıktan sonra, Solaris assayini ve master mixi buz üzerinde çözdürün. Master mix, gene özgü assay ve şablon bileşenleri hariç kantitatif PCR için gereken tüm bileşenleri içerir; bu bileşenler arasında termostat, DNA polimeraz dn ve TPS rocks bulunur.

QPCR cihazı için gerekli olanlar ile iç mavi boya içeren tescilli bir reaksiyon tamponu gerekiyorsa, PCR sınıfı su ve QPCR plakalarını da hazır bulundurun. Çözeltiler çözündükten sonra hafifçe vurarak karıştırın, ardından reaktif kaybını önlemek için çözeltileri kısa süreliğine santrifüjleyin. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte, bir x Solaris QPCR testi ve master mix hazırlayın.

Bir 384 kuyucuklu plakada çalışılacak istenen numune sayısı için, her bir kuyucuktaki final hacmi 10 µL olacak şekilde 5 µL 2x master mix, 0,5 µL 20X Solaris assay ve PCR grade su karıştırın. cDNA eklendikten sonra; kontamine reaktifleri veya kontamine genomik DNA'yı sırasıyla kontrol etmek amacıyla, şablon içermeyen kontrol (NTC) ve ters transkriptaz içermeyen kontrol (no RT) dahil olmak üzere her bir numunenin üç tekrarı için yeterli miktarda hazırlama yaptığınızdan emin olun. Ardından, karışımı steril bir rezervuara aktarın.

Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak uygun hacimdeki 1x master mix'i PCR plakasının ilgili kuyucuklarına aktarın. Beyaz plakalar kullanılıyorsa, master mix içeriğindeki iç mavi boya pipetleme ilerleyişinin takip edilmesine yardımcı olacaktır. Tüm döngü koşulları aynı olduğundan, aynı plaka üzerinde birden fazla cDNA kütüphanesi ve referans gen analiz edilebilir.

Bir x master mix uygun kuyucuklara eklendikten sonra, nihai hacim 10 µL olacak şekilde her kuyucuğa seyreltilmiş CD NA kalıbı ekleyin ve karıştırmak için pipetle yukarı aşağı hareket ettirin. Plakayı, burada gösterildiği gibi yapışkan bir sızdırmazlık bandı veya ısıyla mühürleme yöntemiyle kapatın.

Plakayı bir santrifüje yerleştirin ve reaktifleri kuyucukların dibine indirmek ve floresans okuma programına engel olacak hava kabarcıklarını gidermek için santrifüjleyin. Termosikletörde, Solaris QPCR master mix içindeki hot start polimeraz 95 °C'de 15 dakika boyunca tek bir döngü ile aktive edilmelidir; ardından 95 °C'de 15 saniyelik denatürasyon ve 60 °C'de 60 saniyelik uzama aşamasını içeren 40 döngü uygulanır. Bu protokol, amplifiye edilen gene bakılmaksızın tüm Soliris QPCR analizleri için aynıdır.

Son olarak, plakayı QPCR cihazına yerleştirin ve programı başlatın. Bu şekil, Solaris assaylerinin yüksek performansını göstermektedir; burada, sentetik DNA veya CDNA'nın 10 katlık 10 seyreltisi, CDC 20 ve F two RL one için Solaris QPCR gen ekspresyon assayleri kullanılarak amplifiye edilmiştir; log ölçekli amplifikasyon eğrileri ve 10'luk log 10 seyreltiler için standart eğriler, assayin düşük girdi konsantrasyonlarında bile yüksek performans gösterdiğini kanıtlamaktadır.

Her bir analizin performansı, 10 üzerinden hesaplanan dinamik aralık kare değer verimliliği, log 10 dilüsyonları ve alt saptama sınırı ile ölçülür. Burada gösterilen veriler, Solaris analizlerinin tekrarlanabilirliğini kanıtlamaktadır. Bu çalışmada, CD NA alikotları, Solaris QPCR gen ekspresyon analizleri ve master mix kullanılarak coğrafi olarak birbirinden ayrı iki laboratuvarda amplifiye edilmiştir.

Her iki laboratuvarda da iki gen hedefi için aynı ekspresyon seviyeleri hesaplanmıştır. Solaris QPCR gen ekspresyon reaktiflerini kullanarak standart bir QPCR reaksiyonunun nasıl kurulacağını göstermiş olduk. Bu deneyi gerçekleştirirken, reaktiflerin doğru son konsantrasyonlarına sahip master mix'lerin hazırlandığını ve uygun biyolojik ve/veya teknik tekrarların dahil edildiğini hatırlamak önemlidir.

Ayrıca, QPCR cihazının Solaris için doğru termodöngü koşullarıyla kurulması zorunludur. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.