Name: Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Öğrenin Solaris qPCR testleriyle gen ifadesi analizi yapmayı. Bu yöntem, tüm bilinen splice varyantlarını tespit ederek yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlar. Araştırmacılar için güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Thermo Scientific Solaris qPCR Testi Tasarım Algoritma <ol><li> Solaris qPCR prob / primer çiftleri tasarımında kullanılan algoritma ve böylece evrensel bisiklet koşulları sağlayan her bir bileşenin Tm ayarlar. MGB Ortaklık veya küçük oluk bağlama, prob içinde benzer parçaları Tm artırır ve daha fazla tahlil esneklik ve performans için tasarlanmış gibi kısa probları olanak sağlar. Kendi adından da anlaşılacağı gibi, MGBs DNA sarmalını küçük oluk içine sığabilecek bir sınıf antibiyotiklerin. MGBs bir DNA prob sonuna kadar 3 ya da 5 bağlıdırlar. Çözüm, probun FAM muhabiri floresan Eclipse Dark Quencher ile söndürülür. Prob hedef dizisine bağlanır, prob 3-D yapısındaki değişimin güçlü bir floresan sinyal sağlar. DNA prob hedef sırasına Cilt PCR için uygun erime sıcaklığını korurken, son derece özel, kısa probları kullanımına izin verir MGB tarafından stabilize edilir. Böylece, sinyal algılama hedef amplifikasyon tavlama aşamasında oluşur. MGB prob disassociates uzatma adım sırasında, floresan tekrar söndürülür. Prob kesilir, çünkü PCR verimliliği etkilemez. </li><li> Solaris algoritması bir başka özelliği kullanımı Superbases. Superbases bağlar AT istikrarı geliştirmek ve GG guanin zengin dizileri kendine dernek ortadan kaldırmak için bağlayıcı yetenekleri gelişmiş üsler modifiye edilmiştir. Ayrıca, 5 terminus bağlı bitişik fluorophores söndürmeyecek. Bu bazlar hedef dizilerinin kullanılabilirliğini genişletmek için, seçici algoritmasına göre yerleştirilir. Bu mümkün aksi astar ve sondalar tasarımı önlenmiş olur GC zengin bölgeler olarak dizileri, kullanımı mümkün kılar. </li><li> Mümkün olduğunca, Solaris algoritması, hedef site ekzon kavşağı kapsayan bölgelerde içermektedir. Bu kirletici genomik DNA amplifikasyon kaçınarak özgüllük artar. </li><li> Önemlisi, algoritma, aynı zamanda tek bir prob / astar seti ile kaplı olduğu gibi, bilinen tüm ek varyasyonları için bir konsensüs dizisi, tanımlar. Yani, sadece bir testi ilgi belirli bir gen için ihtiyaç vardır. </li><li> Son olarak, Solaris qPCR Testi tasarım algoritması GC içeriği, uzunluğu, Tm, ve homojen nükleotidlerin uzanan dahil olmak üzere, kritik tasarım konuları için çok sıkı parametreleri kullanır. Genomik, transkript, pseudogene: sonuçlanan dizileri analiz özgüllük için 3 farklı veritabanları kullanılarak BLAST. </li></ol> 2. Solaris Reaktifler Alınması <ol><li> Uygun Solaris reaktifleri elde etmek için, ziyaret <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Bir kez web sitesinde "GENEius Ürün Arama" üzerine tıklayın. GENEius ürün arama doğrudan gitmek için, gitmek <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Sorgulama, arama kutusuna tıklayın ve uygun bir hedef organizma seçin. </li><li> GENEius ürün arama, birçok farklı gen tanımlayıcıları işleyebilir. Burada, Ref Seq Katılım, Gen kimliği, Gen Sembol, Gen Açıklama, Sanger kimliği veya Katılım sayısı, ya da bir katalog numarası da dahil olmak üzere ilgi geni bulmak için önerilen Arama terimlerinizi girin. Daha sonra, "Ara" tıklayın. </li><li> Ilgi gen belirlenmesi ve sol tarafta "Select" tıklayın. Bu ilgi gen farklı Thermo Scientific ürünleri gösteren bir pencere açılacaktır. "Ürünler" başlığı altında "qPCR Algılama" sekmesini seçin. </li><li> Başlığı "Solaris Gen İfadesi Testi" altında, bir optimal Solaris prob / astar tahlil tasarlanmış göreceksiniz. Bu bir testi gen hedef bilinen tüm splice varyantları kapsayacaktır. Istenilen miktar seçin. 100, 200, 400 mevcuttur ve 1000 X 25 ul reaksiyonlar (tahlil için sipariş olarak tespit ise, 100 paket boyutu mümkün olmayacaktır). "Sepete Ekle" butonuna tıklayın. </li><li> Daha sonra, kullanılacak olan termal cycler için uygun ana karışımı seçin. Ana karışımı makine ile mevcut olan en iyi çalışacak belirlemek için, tıklayın "Master Mix PCR Cycler ile en iyi çalıştığını öğrenin!" </li><li> Menü kullanımı hangi karışımı belirlemek için kullanılan olacak qPCR cycler bul. </li><li> GENEius ürün arama penceresine geri dönün ve uygun ana karışımı seçin. Ana karışımı, 100, 200, 400, ve 1000 reaksiyon boyutları gelmektedir. "Sepete Ekle" yi tıklatın. </li><li> Önerilen referans genler ve verso cDNA sentezi kitleri de tam bir QRT-PCR analizi için sipariş edilebilir. </li><li> Solaris qPCR reaktifler geldiğinizde, kullanıma hazır olana kadar -20 ° C'de saklayın. Aşağıdaki reaktifler alınan olmalıdır: 200 nm, sequ sağlanan her bir gen spesifik prob 800 nM iki primer içeren 20X çözümprob ve primerler ve 2X bir konsantrasyonda Solaris qPCR Gen İfadesi Master Mix için referans bilgileri. Solaris qPCR Gen İfade Tahliller en az 12 ay boyunca stabildir. Tekrarlanan dondurulmasından kaçının. </li></ol> 3. qPCR kurulum <ol><li> QPCR protokolü cDNA ile başlayın. Toplam RNA bir spin kolon yöntemi ile elde edilmelidir. Thermo Scientific Verso cDNA sentezi kiti cDNA oluşturmak için ters transkripsiyon için tavsiye edilir. </li><li> Astar, sondalar, çözülme ve buz üzerinde ana karışımı qPCR için hazırlayın. Ayrıca yanda PCR sınıf su ve real-time PCR hassasiyeti artırabilir, opak beyaz qPCR tabak, var. </li><li> 1) Thermo-Başlangıç ​​DNA polimeraz, Thermoprime DNA polimeraz sıcak bir başlangıç ​​sürümü: master karışımı da dahil olmak üzere, gerçek zamanlı PCR tüm bileşenleri içerir. Bu tür polimeraz reaksiyon ayarlamak sırasında non-spesifik amplifikasyon önlemek için kullanılan ve Etkinleştirme adımını 95 ° C'de 15 dakika gerektirir. 2) Solaris Master karışımı dNTP dTTP Solaris astar / sonda deneyleri ile çalışmak üzere optimize Tescilli reaksiyon tamponu amplifikasyon verimliliğini 3), en üst düzeye çıkarmak için dUTP yerini almıştır. Bu reaksiyon tamponu, reaktif ve plastik arasındaki kontrastı arttırmak için mavi boya içerir. 4) ROX qPCR araç gerektiriyorsa ROX. </li><li> Çözümleri çözülmüş sonra, tüp (vorteks) hafifçe vurarak karıştırın. Reaktif kaybını önlemek için onları aşağı spin. </li><li> Sonra, numune sayısına göre ölçekleme ilgi gen, artı için bir referans gen, reaksiyon karışımı kurmak için 15 ml steril Falcon tüp hazırlar. Üç analiz için standart eğri yöntemi kullanılacaksa, bir şablon kontrolü (NTC) ve standart eğri örnekleri de dahil olmak üzere, her bir örnek için hazırlanmış olabilir çoğaltır öyle ki yeterli hazırlayın. </li><li> 96 plaka üzerinde çalışan her bir örnek için, aşağıdaki karışımı: 2X Solaris qPCR Master Mix 5 mcL, 0,5 Solaris Primer / Prob seti (20X) ul, ve PCR sınıf su gibi nihai reaksiyon hacmi, bir kez cDNA 25 mcL olacak eklenir. 384 plaka üzerinde çalışan her bir numune için aşağıdaki karışımı: 2X Solaris qPCR Master Mix 12.5 mcL, Solaris Primer / Prob seti (20x) 1.25 ul ve PCR sınıf su gibi nihai reaksiyon hacmi, bir kez cDNA 10 mcL eklenir olacaktır. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, plaka uygun kuyular için ana karışımı aktarın. Master miks içerisinde yer alan mavi boya beyaz tabak izleme pipetleme ilerleme yardımcı olacaktır. Ardından, 1-5 mcL cDNA şablon (96 plaka için) veya cDNA şablonu 1-2 mcL (384 plaka) ekleyin. Karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. Santrifüj plaka koyun ve bu floresan okumaları ile engel olacak şekilde, herhangi bir kabarcıkları aşağı doğru döndürün. </li><li> Program termal cycler: enzimi ile aktive edilmelidir 95 ° C 15 dakika (1 döngü). Sonra 40 döngü 95 ° C, 15 saniye denatürasyon, tavlama ve uzatma, 60 ° C 60 saniye boyunca. </li><li> QPCR araç plaka yerleştirin. Programı başlatın. </li></ol> Solaris kullanarak Temsilcisi qPCR sonuçları <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. PCR verimliliği ve r2 değerleri tarafından değerlendirilecek Solaris testleri, çok düşük girdi konsantrasyonlarda bile güvenilir şekilde algılanmasını sağlar . Sentetik RNA Amplikon dizisi veya DNA Amplikon dizisi sentezlenen cDNA On 10 kat dilüsyonlarının sırasıyla F2RL1 veya CDC20, Solaris qPCR Gen İfade Testi kullanarak bir ABI 7900HT enstrüman güçlendirildi. Log-ölçek büyütme eğrileri ve standart eğrileri, verimliliği, r2 değeri, 10 log10 dilüsyonları dinamik aralık ve algılama alt sınırı da dahil olmak üzere her bir testin performansı ile birlikte gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Solaris Tahliller hatta farklı araştırmacılar ve laboratuvarlar arasında tutarlı sonuçlar verir. ALDOA ve PPIB yanı sıra hedefleme Kontrolü (NTC) hedefleyen siRNA'lar, 100, 10, 1 ve 0.1 nM son konsantrasyonları HeLa hücrelerine transfekte edildi. Hücreler hasat ve 48 saat tedavi sonrası total RNA izole edildi. Thermo Scientific Verso cDNA Sentezi Kit kullanılarak cDNA sentezlendi. Roche LightCycler 480 (384-iyi) platformu üzerinde Solaris qPCR Gen İfade Tahliller ALDOA, PPIB ve GAPDH tespiti için coğrafi olarak ayrılmış iki laboratuvarlarda cDNA bir kısım güçlendirildi. Demonte ΔΔCq (GAPDH referans gen ve NTC-tedavili hücrelerde normalize) yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır. Demonte ile aynı düzeyde, hem de araştırmacılar her iki site arasındaki gen hedefleri hem için gösterildi.

Bu makalenin yazarları, Thermo Scientific çalışanları.

Thermo Scientific Solaris qPCR Tahliller qPCR analiz yapmak için basit, gelişmiş bir yöntem sağlar. MGB teknolojisi ve Superbases içeren, yüksek darlığı algoritması kullanarak, bu astar ve prob setleri qPCR deneylerin doğruluk ve sağlamlık en üst düzeye çıkarmak. Bir astar ve prob seti, belirli bir gen bilinen tüm ek varyantları tanır. Hedef site, mümkün olduğunca bu genomik DNA amplifiye değildir sağlamak için ekzon kapsayan bölgeler, içerir. Bu özellikler mümkün karmaşık deneyler gerçekleştirmek için gereken zaman miktarını büyük ölçüde azaltarak, aynı anda çok sayıda örnekleri çalıştırmak için. Ana karışımı mavi olduğundan, beyaz opak pipetleme takip kaybetmeden, qPCR duyarlılığını artırmak tabak, kullanmak mümkündür. Hep birlikte ele alındığında, Solaris qPCR Testi tasarım özellikleri bu romanı qPCR tahlil, hem özel ve hem de sağlam bir yüksek performanslı, henüz basit bir tahlil yapmak.

thermo scientific solaris qpcr testi kullanarak kantitatif real-time pcr

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Solaris qPCR Gen İfade Testi, testin duyarlılığı ve hassasiyeti korurken qPCR sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmış primer / prob seti bir roman türüdür. Bu primer / prob setleri&gt;% 98, daha önce mevcut teknolojilerin insan ve fare genomlarından ve özellik önemli iyileştirmeler için önceden tasarlanmış. Bu gelişmeler Thermo Scientific biyoinformatik uzmanları tarafından geliştirilen yeni tasarım algoritması sayesinde mümkün olmuştur. Birçok kullanışlı özellikleri, kantitatif gerçek zamanlı PCR performans sürecini kolaylaştırmak için Solaris qPCR Testi içine dahil edilmiştir. İlk olarak, protokol sık istihdam alternatifleri benzer, bu yüzden qPCR sırasında kullanılan yöntemleri aşina olmak için muhtemeldir. İkinci olarak, ana karışımı, mavi izlemek için qPCR reaksiyonlar daha kolay ayar yapar. Üçüncü olarak, termal döngü koşulları mümkün bir anda birçok örnekleri çalıştırmak ve hata potansiyelini azaltarak, (genler), tüm testleri için aynıdır. Son olarak, prob ve primer sırası bilgilerinin, yayın sürecinin basitleştirilmesi sağlanır. Burada, sipariş web sitesi (www.thermo.com / solaris) ve standart eğri yöntemi kullanılarak qPCR gerçekleştirmek için Solaris reaktifleri kullanmak bulundu GENEius ürün arama özelliğini kullanarak uygun Solaris reaktifleri elde etmek için nasıl gösterilmektedir.

Solaris qPCR Gen İfadesi Tahlilleri testinin özgüllük ve sağlamlık ödün vermeden qPCR sürecini kolaylaştırmak için tasarlanmış yeni önceden tasarlanmış qPCR primer / prob kombinasyonları.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

Solaris qPCR Gen Ekspresyon Analizi, hassasiyeti ve ... korurken qPCR sürecini basitleştirmek için tasarlanmış yeni bir primer/prob seti türüdür.

Bu video makalesinde, Solaris QPCR analizleri kullanılarak gerçek zamanlı PCR gösterilmektedir. Solaris QPCR analizleri, belirli bir genin tüm bilinen ekleme varyantlarını tespit etmek için tasarlanmış gene özgü prob ve primer setleridir. Evrensel termal döngü koşulları altında, Solaris probu beş prime ucunda bir minör oluk bağlayıcı grup ve FA raporlayıcıya, üç prime ucunda ise gizlenmiş bir karanlık söndürücüye sahiptir.Real-time PCR'nin denatürasyon basamağı sırasında, prob çözelti içinde kalır ve FAM raporlayıcı floresansı söndürülür. Tavlama ve uzama fazları sırasında, primerler ve prob hedef sekansa bağlanır ve söndürücü FAM'den ayrılır. Prob ayrıştığında FAM güçlü bir floresan sinyal verir ve ardından floresans tekrar söndürülür.Bu etkili analiz yönteminin duyarlılığını, özgüllüğünü ve tekrarlanabilirliğini kanıtlayan gerçek zamanlı PCR sonuçları elde edilmiştir. Merhaba, ben Lafayette, Colorado'daki Thermo Fisher Scientific Araştırma ve Geliştirme Ekibi'nden James Covino. Bugün size Lars QPCR gen ekspresyon reaktiflerini kullanarak standart bir QPCR reaksiyonu kurma prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda, RNA interferans teknolojilerini kullanarak hedef genlerin susturulmasını (knockdown) incelemek için bu prosedürü uyguluyoruz. Öyleyse başlayalım. Solaris QPCR assay STEM, insan ve farelerde anotasyon yapılmış genlerin %98'i için tek ve kullanışlı bir analiz sağlamak amacıyla MGB ve süper baz teknolojilerini kullanan benzersiz algoritması ile tanımlanır.Genellikle, DNA probu ve primer tasarımı, bazların sayısı ve türü ile belirlenen prob erime sıcaklığı ile kısıtlanır. Daha uzun dizilerin ve GC açısından zengin dizilerin erime sıcaklıkları daha yüksektir. Solaris problarında kullanılan minör oluk bağlayıcı grup, DNA heliksinin minör oluğuna yerleşerek prob ile hedef dizi arasındaki etkileşimi stabilize eder.Bu durum erime sıcaklığını artırarak daha kısa probların kullanılmasına olanak tanır. Solaris algoritması ayrıca, AT bağlarının stabilitesini artırmak ve guanin bakımından zengin dizilerdeki GG kendi kendine ilişmesini (self-association) önlemek için süper bazlar adı verilen modifiye nükleotidleri seçici olarak bünyesine katar. Bu, normalde kaçınılacak olan hedef dizilerin kullanımına imkan sağlar.Bu teknolojilerin kullanımıyla sağlanan artırılmış sekans esnekliği, tek bir genin bilinen tüm ekleme varyantlarını tanıyan primer prob setlerinin tasarlanmasına olanak tanır. Spesifisiteyi artırmak amacıyla, kontamine genomik DNA amplifikasyonunu önlemek için mümkün olan her durumda hedef bölgeye ekzon birleşim bölgelerinin dahil edildiğini unutmayın; elde edilen primer prob setleri, spesifisiteyi sağlamak için genomik, transkript ve psödogen olmak üzere üç farklı veri tabanında blast analizine tabi tutulmuştur. Ayrıca, Solaris primer prob setleri tamamen optimize edilmiştir, böylece tüm QPCR analizleri için döngü koşulları özdeştir; bu da çeşitli transkriptlerin ekspresyonunun tek bir PCR çalışmasında değerlendirilmesine imkan verir.qPCR R deneyini planlamaya başlamak için, thermo.com/solaris adresinde bulunan genius ürün aramasıyla, ilgilenilen gen için qPCR gerçekleştirmek üzere gerekli reaktifleri belirleyin. Arama sorgu kutusuna tıklayın ve uygun hedef organizmayı seçin. Genius ürün araması, birçok farklı gen tanımlayıcısını işleyebilir.Burada.İlgi duyulan gene yönelik önerilen arama terimlerinden birini girin, ardından ara butonuna tıklayın, ilgi duyulan geni belirleyin ve sol taraftaki seç butonuna tıklayın. Bu işlem, ilgi duyulan gen için mevcut olan farklı reaktifleri gösteren bir pencere açacaktır. Solaris gen ekspresyon testi altındaki QPCR deteksiyon sekmesine tıklayın.Optimal olarak tasarlanmış bir Solaris prob primer deneyi gösterilmektedir. Bu tek deney, ilgilenilen genin bilinen tüm ekleme varyantlarını saptayacaktır. Uygun primer ajanı belirlendikten sonra, menüden kullanılacak olan QPCR döngüleyiciyi bulun ve uyumlu master mix'i; ayrı bir ROX pasif referans boya şişesi içeren master mix'i, ROX mix'i veya düşük ROX mix'i belirleyin.Burada Roche light cycler four 80 kullanılacaktır, dolayısıyla master mix plus rock vial kullanılacaktır. Ayrıca, çalışmaya uygun bir referans genin dahil edildiğinden emin olmak önemlidir. Tüm Solaris QP CR reaktifleri alındıktan sonra B two M kullanılacaktır.Kullanılana kadar -20 °C'de saklanmalıdırlar. Reaktifler en az 12 ay boyunca stabildir. Tekrarlayan dondurma-çözme işlemlerinden kaçınılmalıdır.Örnek RNA üzerinde ters transkripsiyon reaksiyonları gerçekleştirerek qPCR için cDNA hazırlayın. cDNA hazırlandıktan sonra, Solaris assayini ve master mixi buz üzerinde çözdürün. Master mix, gene özgü assay ve şablon bileşenleri hariç kantitatif PCR için gereken tüm bileşenleri içerir; bu bileşenler arasında termostat, DNA polimeraz dn ve TPS rocks bulunur.QPCR cihazı için gerekli olanlar ile iç mavi boya içeren tescilli bir reaksiyon tamponu gerekiyorsa, PCR sınıfı su ve QPCR plakalarını da hazır bulundurun. Çözeltiler çözündükten sonra hafifçe vurarak karıştırın, ardından reaktif kaybını önlemek için çözeltileri kısa süreliğine santrifüjleyin. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte, bir x Solaris QPCR testi ve master mix hazırlayın.Bir 384 kuyucuklu plakada çalışılacak istenen numune sayısı için, her bir kuyucuktaki final hacmi 10 µL olacak şekilde 5 µL 2x master mix, 0,5 µL 20X Solaris assay ve PCR grade su karıştırın. cDNA eklendikten sonra; kontamine reaktifleri veya kontamine genomik DNA'yı sırasıyla kontrol etmek amacıyla, şablon içermeyen kontrol (NTC) ve ters transkriptaz içermeyen kontrol (no RT) dahil olmak üzere her bir numunenin üç tekrarı için yeterli miktarda hazırlama yaptığınızdan emin olun. Ardından, karışımı steril bir rezervuara aktarın.Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak uygun hacimdeki 1x master mix'i PCR plakasının ilgili kuyucuklarına aktarın. Beyaz plakalar kullanılıyorsa, master mix içeriğindeki iç mavi boya pipetleme ilerleyişinin takip edilmesine yardımcı olacaktır. Tüm döngü koşulları aynı olduğundan, aynı plaka üzerinde birden fazla cDNA kütüphanesi ve referans gen analiz edilebilir.Bir x master mix uygun kuyucuklara eklendikten sonra, nihai hacim 10 µL olacak şekilde her kuyucuğa seyreltilmiş CD NA kalıbı ekleyin ve karıştırmak için pipetle yukarı aşağı hareket ettirin. Plakayı, burada gösterildiği gibi yapışkan bir sızdırmazlık bandı veya ısıyla mühürleme yöntemiyle kapatın.Plakayı bir santrifüje yerleştirin ve reaktifleri kuyucukların dibine indirmek ve floresans okuma programına engel olacak hava kabarcıklarını gidermek için santrifüjleyin. Termosikletörde, Solaris QPCR master mix içindeki hot start polimeraz 95 °C'de 15 dakika boyunca tek bir döngü ile aktive edilmelidir; ardından 95 °C'de 15 saniyelik denatürasyon ve 60 °C'de 60 saniyelik uzama aşamasını içeren 40 döngü uygulanır. Bu protokol, amplifiye edilen gene bakılmaksızın tüm Soliris QPCR analizleri için aynıdır.Son olarak, plakayı QPCR cihazına yerleştirin ve programı başlatın. Bu şekil, Solaris assaylerinin yüksek performansını göstermektedir; burada, sentetik DNA veya CDNA'nın 10 katlık 10 seyreltisi, CDC 20 ve F two RL one için Solaris QPCR gen ekspresyon assayleri kullanılarak amplifiye edilmiştir; log ölçekli amplifikasyon eğrileri ve 10'luk log 10 seyreltiler için standart eğriler, assayin düşük girdi konsantrasyonlarında bile yüksek performans gösterdiğini kanıtlamaktadır.Her bir analizin performansı, 10 üzerinden hesaplanan dinamik aralık kare değer verimliliği, log 10 dilüsyonları ve alt saptama sınırı ile ölçülür. Burada gösterilen veriler, Solaris analizlerinin tekrarlanabilirliğini kanıtlamaktadır. Bu çalışmada, CD NA alikotları, Solaris QPCR gen ekspresyon analizleri ve master mix kullanılarak coğrafi olarak birbirinden ayrı iki laboratuvarda amplifiye edilmiştir.Her iki laboratuvarda da iki gen hedefi için aynı ekspresyon seviyeleri hesaplanmıştır. Solaris QPCR gen ekspresyon reaktiflerini kullanarak standart bir QPCR reaksiyonunun nasıl kurulacağını göstermiş olduk. Bu deneyi gerçekleştirirken, reaktiflerin doğru son konsantrasyonlarına sahip master mix'lerin hazırlandığını ve uygun biyolojik ve/veya teknik tekrarların dahil edildiğini hatırlamak önemlidir.Ayrıca, QPCR cihazının Solaris için doğru termodöngü koşullarıyla kurulması zorunludur. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Bu protokol, tip I ve III IFN ekspresyon imzalarının analizi için yüksek verimli bir qRT-PCR testini tanımlar. Tahlil, bu genlerin oldukça benzer transkriptleri arasındaki tek baz çifti farklılıklarını ayırt eder. Toplu montaj ve robotik pipetleme sayesinde tahliller tutarlı ve tekrarlanabilirdir.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Sentetik Maya Genom projesi, Sc2.0'ın tasarımcı kromozomları, varlık/yokluk uç noktasına sahip PCRTagging adı verilen PCR tabanlı bir genotipleme testi kullanılarak doğal muadillerinden ayırt edilebilir. Burada, PCRTag genotiplemesi için yüksek verimli bir gerçek zamanlı PCR tespit yöntemini açıklıyoruz.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

Bu kanser yönetimi yüksek karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olduğu hedeflenen terapötik ajanlar, Edinsel direnç mekanizmaları araştıran bir zaman ve cost effective vitro protokoldür.

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

Bitki patojenleri yerinde, özellikle toprak kaynaklı patojenler, hızlı ve doğru tespiti daha fazla inoculum üretim ve alanında bitki hastalıklarının yayılması önlemek için çok önemli olduğunu. Burada bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR algılama sistemi kullanılarak geliştirilen yöntem yerinde tanı alan koşullarında sağlar.

Toprak kaynaklı Phytopathogens bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak yerinde moleküler tespiti

T7 bakteriyofaj numaralandırmak için bir tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli kantitatif PCR (qPCR) yöntemi burada açıklanmıştır. Protokol açıkça fajının genomik DNA hazırlık, PCR reaksiyon hazırlama, qPCR Bisiklet koşullarını ve qPCR veri analizi açıklar.

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

Microvolume örnekleri doğal yüzey gerilimi, küvet ya da kılcal damarların kullanmadan örnekleri korumak için kullanan bir spektrofotometre sistem tarafından sayısal. Ölçülebilir olan protein konsantrasyonları ve hız dinamik aralık, bu yöntem büyük ölçüde artmıştır.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Öğrenin Solaris qPCR testleriyle gen ifadesi analizi yapmayı. Bu yöntem, tüm bilinen splice varyantlarını tespit ederek yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlar. Araştırmacılar için güvenilir sonuçlar sunar.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

Daha fazla video keşfet