Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

Bu prosedürde, floresan olarak işaretlenmiş RNA. Transkriptler XUS Sitlere enjekte edilir ve lokalizasyonları izlenir. İlk olarak, RNA floresan nükleotidlerle etiketlenir.

Bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunda, RNA daha sonra bir mikroenjeksiyon aparatına yüklenir. Oositler bir enjeksiyon kabına yerleştirilir ve dikkatlice mikro enjekte edilir. Son olarak, oositler, konfokal mikroskopta görüntülemeden önce RNA lokalizasyonunun gerçekleşmesine izin vermek için kültürlenir.

Merhaba, ben Brown Üniversitesi Moleküler Biyoloji, hücre biyolojisi ve biyokimya Bölümü'nden Dr. Kimberly Mallory'nin laboratuvarından James Gagnan. Bugün size Xap oositlerinde hücre altı RNA lokalizasyonunu görselleştirmek için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda, erken omurgalı gelişimi sırasında RNA lokalizasyonu için gerekli olan RNA mimarisini ve protein faktörlerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, ekteki yazılı protokolde açıklandığı gibi hem radyoaktif hem de floresan olarak etiketlenmiş mRNA'yı kopyalayın. Şablon DNA'yı bozmak için DS ekleyin ve ardından EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Bir G 50 sütunundan geçirerek birleşmemiş nükleotidleri ve diğer küçük molekülleri çıkarın. RNA daha sonra etanol çökeltme ile konsantre edilir, yıkanır ve yeniden süspanse edilir. Sintilasyon sayımı ile konsantrasyonu belirledikten sonra, RNA'yı 50 nano molar ile seyreltin ve eksi 80 santigrat derecede beş mikrolitrelik alikotlarda saklayın.

Mikroenjeksiyonu gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda, etiketli RNA denatüralitesinin bir Eloqua'sını beş dakika boyunca 70 santigrat derecede çözdürün. Daha sonra partikülleri uzaklaştırmak ve buz üzerinde tutmak için oda sıcaklığında bir mikro santrifüjde maksimum hızda 10 dakika döndürün. Daha sonra, xap post lavu yumurtalığının sitler trim parçalarını, mililitre başına 25 mililitre üç miligram içeren 50 mililitrelik bir konik ikiye izole edin.

pH 7.4'te 0.1 molar potasyum fosfat tamponunda kollajenaz. Partiden partiye varyasyon nedeniyle 18 santigrat derecede hafifçe çalkalayın. Kollajenaz tedavi süresi değişebilir ve görsel muayene ile dikkatli bir şekilde izlenmelidir.

Yaprak dökülmesini sağlamak için 15 dakika boyunca veya oositler yumurtalıktan gözle görülür şekilde ayrılana kadar çalkalamaya devam edin, oositlerin konik tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Çözeltiyi çıkarın ve MBSH arabelleği ile değiştirin. Bunu tekrarlayın, toplam üç yıkama için iki kez daha yıkayın.

Ardından, standart bir ışık mikroskobu altında üçüncü ila dört CYTES ve MBSH tamponunu manuel olarak sıralayın. Üçüncü aşama sitler tamamen opaktır, ancak beyazdır. Dördüncü aşama sitler biraz daha büyüktür ve pigment ile lekelidir.

Hafif saydam olan sitler çok gençtir ve tamamen pigmentli veya polarize pigment dağılımı sergileyen sitler çok eskidir. Son olarak, dış çapı yaklaşık 0,05 milimetre olan iğneler yapmak için üç buçuk inçlik kılcal damarları çekerek ve eğim vererek iğneleri mikroenjeksiyon için hazırlayın. Artık mRNA oositleri ve iğneleri hazır olduğuna göre mikroenjeksiyona geçin.

Enjeksiyon enjeksiyonu başına iki nanometre sağlamak için iğneyi desy su ile kalibre ederek başlayın. Ön. İğneyi gaz kontrollü bir mikro enjektör kullanarak yükleyin ve bir mikrometre kullanarak damla boyutunu kalibre edin, kalibrasyondan sonra iğneye enjekte edilecek RNA'yı önden yükleyin. Daha sonra sıralanmış oositleri bir enjeksiyon kabına yerleştirin MBSH tamponunda, çanak bir siyah köpük kauçuk tabakası içerir.

Beyaz cyte, siyah bir arka plana karşı iyi bir şekilde göze çarpıyor. Daha sonra her oosit 50 nanomolar'da iki litre RNA ile dikkatlice enjekte edin. Her oositi yalnızca bir kez enjekte ettiğinizden emin olun ve enjeksiyon tamamlandığında iğnede tıkanma olup olmadığını düzenli olarak kontrol edin.

Kalan RNA'yı dışarı atın, iğneyi tatlı su ile durulayın ve bir sonraki RNA'yı enjeksiyon için yükleyin. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen sitleri bine kadar steril 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. CYTES kuyu başına kültüre edilebilir.

Tamponu çıkarın ve oyuk başına 400 mikrolitre sit kültürü ortamı ile değiştirin. Daha sonra, kültür sırasında nemli bir ortam sağlamak için kültür plakasını ıslak bir kağıt havluyla plastik bir kabın içine yerleştirin, oositleri istenen inkübasyon süresinden sonra sekiz ila 48 saat arasında değişen zaman noktaları için 18 santigrat derecede inkübe edin. Oositler, enjekte edilen oositlerin inkübasyonundan sonra mikroskopi için hazırlanabilir.

Ölü oositleri ayırın ve hayatta kalan oositleri cam şişelere koyun. Oositlerin %90'ından fazlasının sağkalımı rutin olarak gözlenir. Tamponu M-E-M-F-A sabitleyici ile değiştirin ve sitleri 20 dakika boyunca sallayın.

Fiksasyon süresi tamamlandıktan sonra fiksasyon sırasında oositleri güneş ışığından koruyunuz. Sabitleyiciyi çıkararak ve eşit hacimde MBSH tamponu ile değiştirerek oositleri yıkayın. Toplam iki yıkama için bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.

Daha sonra, oositleri susuz metanol içine yıkayın. İlk olarak, hacmin yarısını çıkarın ve metanol ile değiştirin. Bunu iki kez daha tekrarlayın.

Bu yıkamalardan sonra, çözeltinin tamamını çıkarın ve metanol ile değiştirin. Bu metanol yıkamasını bir kez daha tekrarlayın. Sabit ve susuz kalmış oositler, görüntülenmeye hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.

Görüntülemeden önce, görüntüleme yüzeyini kaplamak için Marie'nin temizleme ortamını cam tabanlı bir WPI floro kabına ekleyin. Oositleri metanolden floro kabına dikkatlice aktarın, aktarılan metanol hacmini en aza indirin, oositleri ters konfokal bir mikroskopta görüntüler, hem Zeiss LSM beş 10 hem de aica TCSs P iyi sonuçlar verir. Şimdi, mikroenjeksiyonun hemen ardından hücre altı RNA lokalizasyonunun bazı temsili görüntülerini göstereceğiz: floresan RNA, floresan etiketli kontrolün sekiz saatlik kültüründen sonra çekirdekte görülebilir.

RNA, oositin sitoplazmasında düzgün bir şekilde dağılmış olarak görülebilir. Bununla birlikte, taşıma mekanizmasını işe alan dizileri içeren floresan etiketli bir RNA, oositin sebze kutbuna hücre altı lokalizasyonu sürecinde görülebilir. Floresan etiketli RNA'ları zap sitlerine nasıl mikro enjekte edeceğinizi ve konfokal mikroskopi ile RNA lokalizasyonunu nasıl gözlemleyeceğinizi az önce gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, RNA'ların kültüre kontaminasyonunu önlemek için, OCM'deki sitleriniz antibiyotik içerir ve foto ağartmayı önlemek için sitlerinizi mümkün olduğunca güneş ışığından korumak için deci ile muamele edilmiş solüsyonlar kullanmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.