Name: Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin, Xenopus oositlerine floresan etiketli RNA enjekte ederek konfokal mikroskopi ile RNA taşınmasını görselleştirme yöntemini. Bu teknik, hücre içi RNA dinamiklerini in vivo ortamda izlemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RNA lokalizasyonuna KLM NIH (R01GM071049) bir hibe ile desteklenmektedir.

Bölüm 1: floresan ile işaretlenmiş mRNA Transkripsiyon. <ol><li> Plazmid DNA, RNA yerelleştirme elemanı ya da ilgili diğer dizisi içeren Linearize ve 1 mcg / ml DEPC tedavi H 2 O. ile tekrar süspansiyon DNA şablonu T7, SP6 veya T3 RNA polimeraz tarafından transkripsiyon için upstream organizatörü sitelerine sahip olması gerekir. </li><li> 1.5mL steril bir tüpe aşağıdaki reaktifler ekleyin: <table><tbody><tr><td> a. 10X Tx tampon (M &amp; M) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> b. 20X kapak / NTP mix (M &amp; M) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> d. UTP, [α-32 P] (1 μCi / ml) (Perkin Elmer) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> e. DEPC-H 2 O </td><td> 11 ul </td></tr><tr><td> f. 0.2 M DTT </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> g. RNasin (Promega) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> h. doğrusal DNA </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> i. RNA Polimeraz (Promega) </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Reaktifler hafifçe karıştırın ve kısaca santrifüj (10 sn. Mikrosantrifüj). </li><li> Tüp fluorofor, photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile kaplama, 37 ° C'de 2-4 saat inkübe. </li><li> DNA aşağılamak için 1 ul 1 mg / ml RNaz ücretsiz DNaz (Promega) ekleyin. </li><li> 37 az 15 dakika inkübe ° C </li><li> Reaksiyonu durdurmak için 79 ul 20 mM EDTA (pH 8.0) ekleyin. </li><li> "Giriş" ve kaydetmek olarak etiketlenmiş ayrı bir tüp, 1 ul çıkarın. </li><li> 1 ml G50 sütun üzerinden tam uzunlukta mRNA hariç adi nükleotid içerecektir Spin reaksiyonu (Gereç ve Yöntem). </li><li> RNA etanol yağış Konsantre: <ol class="lalpha"><li> 250 ul% 100 etanol, 10 ul 7M CH 3 COONH 4, 1 ul taşıyıcı RNA (maya tRNA, 10 mcg / ml) veya 1 ul glikojen (20 mg / ml) ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve katı kadar donma -80 ° C&gt; 30 dakika veya 15 dakika boyunca kuru buz üzerinde. </li><li> 15 dakika, süzün süpernatant mikrosantrifüj maksimum hızda dönerler. </li><li> 150 ul% 75 etanol ile yıkayın. </li><li> Mikrosantrifüj, süzün süpernatant maksimum hızda 3 dakika Spin. </li><li> Tüm etanol buharlaştı sağlamak, 3 dakika boyunca 37 ° ° C pelet kurulayın. </li></ol></li><li> 11 ul DEPC-H 2 O süspanse edin ve "anonim" olarak etiketli ayrı bir tüp, 1 ul kaldırmak. </li><li> Yüzde dahil belirleyin ve 50 nm RNA sulandırmak (Malzeme ve Hesaplama Yöntemleri bakınız). </li><li> Donma / çözülme döngüleri önlemek için tek kullanımlık, RNA 5 ul alikotları dondurulmuş ve -80 ° C'de birkaç hafta saklanabilir. </li></ol> Bölüm 2: Mikroenjeksiyon için hazırlanıyor. <ol><li> RNA Hazırlanışı: RNA (50 nM) bir kısım çözülme ve RNA denatüre 70 ° C, 3-5 dakika. Herhangi bir parçacık kaldırmak ve buz üzerinde tutmak için, oda sıcaklığında mikrosantrifüj maksimum hız 10 dakika boyunca dönerler. </li><li> Oosit Hazırlanışı: <ol class="lalpha"><li> Cerrahi Xenopus laevis kadın (Nasco) yumurtalık çıkarın. </li><li> 25 ml kollajenaz çözüm içeren 50 ml konik bir tüp içine Xenopus laevis yumurtalık Trim parçaları (Gereç ve Yöntem) . </li><li> 18 ° C'de 15 dakika süreyle hafifçe sallayın ya da oosit kadar gözle görülür bir şekilde yumurtalıktan ayrılır. Parti değişimi için toplu iş nedeniyle, kollajenaz tedavi süresi değişebilir ve defoliculation sağlamak için görsel olarak dikkatle izlenmelidir. </li><li> Oosit tüp yerleşmek için izin verin, çözüm kaldırmak ve (Gereç ve Yöntem) MBSH tamponu ile oosit yıkayın. </li><li> Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez daha tekrarlayın yıkayın. Bu oosit izolasyon protokolü Cohen ve ark, 2009 yılında bu detaylı benzer. </li><li> MBSH tampon standart bir diseksiyon mikroskobu altında elle tür evre III / IV oosit (Dumont, 1972). Evre IV oosit pigment ile biraz daha büyük ve benekli ise Evre III oosit, tamamen opak ancak beyaz. Biraz şeffaf Oosit tam pigmentli veya sergi polarize pigment dağılımı çok eski olduğunu, çok genç ve oosit. </li></ol></li><li> İğne Hazırlanışı: ~ 0.05 mm dış çapı iğne çekin ve konik. (Drummond Bilimsel 3.5 inç kılcal damarlar (sipariş # 3-000-203-G / X), bir Sutter Instrument Co mikropipet çektirmesi ve TEFE Inc beveller.) </li></ol> Bölüm 3: Mikroenjeksiyon <ol><li> DEPC-H 2 O ile iğne enjeksiyon başına 2 nl sunmak için kalibre edin. Biz önden bir gaz tahrik mikroenjektör (Gereç ve Yöntem) kullanarak bizim iğne yükü, ve bir mikrometre kullanarak damla boyutu kalibre. </li><li> RNA iğne içine yükleyin. </li><li> Oosit sıralaması MBSH tampon içeren bir enjeksiyon çanak içine yerleştirin. Biz siyah köpük kauçuk tabakası ile bir çanak microinject. Soluk oosit beyaz bir backgrou iyi öne çıkıyornd. </li><li> 50 nM RNA 2 nl ile her oosit dikkatlice enjekte edilir. </li><li> RNA DEPC-H 2 O ile durulama, iğne ve enjeksiyon için bir sonraki RNA yüklemek boşaltınız . </li></ol> Bölüm 4: Oosit Kültür <ol><li> Oosit iyi steril bir 24 plaka (Sigma Aldrich) yerleştirin. Biz de başına bin oosit kültürü. </li><li> Tamponu çıkarın ve 400 ul O ocyte C ulture M edium ile değiştirin (OCM, Gereç ve Yöntem) ortalama. Kültür plakasına sırasında nemli bir ortam kültürü korumak için ıslak kağıt havlu ile hava geçirmez bir plastik kap içine yerleştirin. </li><li> 18 ° C, 8 ve 48 saat arasında değişen zaman noktaları için oosit inkübe edin. </li></ol> Bölüm 5: Oosit Fixation, Dehidrasyon ve Depolama <ol><li> Ölü oosit Sıralama ve cam şişe hayatta oosit. Biz rutin olarak&gt;% 90 hayatta kalma gözlemlemek. </li><li> MEMFA fiksatif (Gereç ve Yöntem) ve 20 dakika boyunca kaya yerleştirin oosit. Oosit, alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun. </li><li> Fiksatif çıkarılması ve MBSH tampon eşit hacmi değiştirilmesi oosit yıkayın. Toplam iki yıkar bir yıkama için bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Susuz metanol içine oosit Yıkama: <ol class="lalpha"><li> Hacminin yarısını çıkarın, metanol ile değiştirin. </li><li> "" Iki kez adım tekrarlayın. </li><li> Çözüm çıkarın, metanol ile değiştirin. </li><li> Metanol yıkama tekrarlayın. </li></ol></li><li> Oosit resme hazır kadar -20 ° C'de saklanabilir. </li></ol> Bölüm 6: Konfokal Mikroskopi Görüntüleme RNA Yerelleştirme <ol><li> Görüntüleme önce, görüntüleme yüzeyini kaplayan cam bir alt FluoroDish (TEFE A.Ş.) Murray Takas Orta (02:01 benzil benzoat-benzil alkol) ekleyin. </li><li> Dikkatle transfer metanol hacmi en aza indirerek, metanol FluoroDish oosit transfer. </li><li> Ters bir konfokal mikroskop Görüntü (Biz başarıyla Zeiss LSM510 ve Leica TCS SP2). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: floresan Etiketli Transkriptler Mikroenjeksiyon Subselüler RNA Yerelleştirme Görselleştirme Alexa Fluor 546 etiketli A. takiben mikroenjeksiyon, RNA ilk çekirdeğini sınırlıdır B. kültür sekiz saat sonra, bir floresan etiketli kontrolü RNA eşit şekilde görüleceği oosit sitoplazmasında dağıtılan C. Ancak, taşıma makine işe dizileri içeren floresan etiketli RNA oosit (dibe doğru) bitkisel direğe hücre içi lokalizasyonu sürecinde olabilir. Ölçek çubuğu = 50 mm.

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

Brown Üniversitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak laboratuvar hayvanlarında kullanılarak yapılan deneyler yapıldı.

Burada Xenopus oositleri mRNA yerelleştirme görselleştirmek için bir protokol var. Bu yöntem, floresan etiketli RNA transkript kullanarak önceden digoxigenin etiketli transkript ile elde edilen ve in-situ temelli yaklaşımlar (Mowry Melton, 1992, Gautreau ve ark, 1997) daha basit ve daha hızlı daha yüksek sinyal gürültü oranına sahiptir. Bu yöntemi kullanarak, mühendis dizisi mutasyonlar RNA ve hızlı bir şekilde in vivo fonksiyon testi. Ayrıca, ek Alexa UTP fluorophores kullanarak, birden fazla RNA türl...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X Tx tampon <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) </li><li class="none"> 20 mM spermidin-HCl </li></ul> 20x kapak / NTP karışımı <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM ATP </li><li class="none"> 9 mM UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (ppp) G Cap Analog (New England Biolabs) </li></ul> G-50 sütun <ul><li class="none"> Hidrat 5 ml 100 g Sephadex G-50 boncuk (Sigma Aldrich) H 2 O. deiyonize 30 dakika DEPC davranın. ve otoklav. Eksik stok oda sıcaklığında saklayın. Kullanmadan önce, aşağıdaki RNaz ücretsiz çözümleri ekleyin: </li><li class="none"> 0.5 ml 0.2 M EDTA </li><li class="none"> 1 ml 1 M Tris pH: 8.0 </li><li class="none"> 0.5 ml% 20 SDS </li><li class="none"> 4 ° C&#39;de tam G-50 çözüm saklayın </li><li class="none"> Çıkartın ve atın piston 3 ml şırınga (BD Biosciences) ve 15 ml konik tüp (Corning) içine şırınga varil. Cam yünü (bir kuruş yarısı boyutu hakkında bir eklenti) küçük bir miktarı ile şırınga takın. </li><li class="none"> Boncuklar tekrar süspansiyon çalkalanarak tam G-50 çözüm. </li><li class="none"> Boş sütun için 2 ml G-50 çözüm ekleyin. </li><li class="none"> 1 dakika için 1.000 x g benchtop santrifüj Spin. </li><li class="none"> 200 ul DEPC tedavi deiyonize H 2 O, her bir sütun ekleyin. Spin. </li><li class="none"> Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez daha tekrarlayın yıkayın. </li><li class="none"> Yeni bir 15 ml konik tüp şırınga varil çıkarın. </li></ul> Kollajenaz çözüm <ul><li class="none"> Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 75 mg kollajenaz </li><li class="none"> 25 ml 0.1 M KPO 3 + (pH 7.4) </li></ul> MBSH tampon <ul><li class="none"> 88 mM NaCl </li><li class="none"> 1 mM KCl </li><li class="none"> 2.4 mM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0.82 mM MgSO 4 X 2 O 7H </li><li class="none"> 0.33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0.41 mM CaCl 2 X 6H 2 O </li><li class="none"> 10 mM HEPES (pH 7.6) </li></ul> Oosit Kültür Orta <ul><li class="none"> % 50 L15 orta </li><li class="none"> 15 mM HEPES (pH 7.6) </li><li class="none"> 1 mg / ml insülin </li><li class="none"> 100 mg / ml gentamisin </li><li class="none"> 50 U / ml nistatin </li><li class="none"> 50 U / ml penisilin </li><li class="none"> 50 mg / ml streptomisin </li></ul> MEMFA çözümü <ul><li class="none"> 0.1 M MOPS (pH 7.4) </li><li class="none"> 2 mM EGTA </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> % 3.7 formaldehit </li></ul> Bilgisayar RNA verimi <ul><li class="none"> &quot;Giriş&quot; ve standart bir sintilasyon sayacı kullanarak &quot;anonim&quot; örneklerini BGBM belirleyin. </li><li class="none"> dahil = (&quot;dahil&quot;) / (10 x &quot;giriş&quot;) </li><li class="none"> Tipik kuruluş değerleri ~ 0.03 ve 0.10 arasında değişmektedir. </li><li class="none"> Farklı polimerazları için maksimum teorik verir: T3, T7, SP6 - 2.64 mg </li><li class="none"> Reaksiyon verimi mg = (maksimum verim polimeraz kullanılır) X (dahil) </li><li class="none"> Sulandırınız RNA 50 nM = (mikrogram RNA) / 320 / (üsleri RNA uzunluğu) / (5x10 -8) </li><li class="none"> Reaksiyon genellikle verimi ~ 50 nM RNA 50-100 ul. </li></ul>

görselleştirme rna yerelleştirme xenopus oosit

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA lokalizasyonu hücre polarite kurulması korunmuş bir mekanizma. Vg1 mRNA Xenopus laevis oosit ve mekansal Vg1 protein gen ekspresyonu kısıtlamak için eylemler bitkisel direğe lokalize. Bu şekilde dağılımı Vg1 sıkı kontrol gelişmekte olan embriyonun uygun germ tabakası belirtimi için gereklidir. MRNA 3 &#39;UTR RNA dizisi elemanları, Vg1 yerelleştirme elemanı (VLE) gerekli ve doğrudan ulaşım için yeterli. In vivo Vg1 mRNA tanıma ve taşıma çalışma için, basit bir görsel okuma ile trans-faktör yönelik taşıma mekanizmalarının kapsamlı analizini sağlayan bir görüntüleme tekniği geliştirdiler. RNA yerelleştirme görselleştirmek için, floresan etiketli VLE RNA sentez ve bireysel oosit bu transkript microinject. Enjekte edilen RNA taşıma izin oosit kültürü sonra oosit konfokal mikroskobu ile görüntüleme için önce sabit ve kurutulmuş. MRNA yerelleştirme desen Görselleştirme RNA ulaşım tam yol izlenmesi ve cis etkili VLE (Lewis ve ark, 2008 bağlamak transkript ve trans-etkili faktörler içinde unsurları, RNA ulaşım yönlendirmede rolleri tanımlamak için bir okunmasını sağlar Messitt ve ark, 2008). Biz ek RNA ve proteinler (Gagnon ve Mowry, 2009, Messitt ve ark, 2008) ile eş-yerelleştirme yoluyla bu tekniği var ve motor protein ve hücre iskeletinin bozulması ile birlikte prob (Messitt ve ark, 2008) mRNA yerelleştirme altında yatan mekanizmalar.

Görselleştirme<em&gt; In vivo</em&gt; RNA ulaşım floresan etiketli RNA transkript mikroenjeksiyon yapılır<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit, konfokal mikroskobu ile takip.

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

RNA lokalizasyonu, hücre polaritesinin oluşturulmasında korunmuş bir mekanizmadır. Vg1 mRNA'sı, Xenopus laevis oositlerinin vegetal kutbuna lokalize olur ve Vg1 proteininin gen ekspresyonunu uzaysal olarak kısıtlama görevi görür. Gelişen embriyoda germ tabakalarının doğru şekilde belirlenmesi için Vg1 dağılımının bu şekilde sıkı bir kontrol altında tutulması gerekir. mRNA'nın 3' UTR bölgesindeki RNA sekans elementleri olan Vg1 lokalizasyon elementi (VLE), transportu yönlendirmek için gerekli ve yeterlidir. Vg1 mRNA'sının in vivo tanınmasını ve transportunu incelemek amacıyla, basit bir görsel okuma yoluyla trans-faktör yönlü transport mekanizmalarının kapsamlı analizine olanak tanıyan bir görüntüleme tekniği geliştirdik. RNA lokalizasyonunu görselleştirmek için floresan işaretli VLE RNA'sı sentezliyor ve bu transkripti tekil oositlere mikroenjekte ediyoruz. Enjekte edilen RNA'nın transportuna izin vermek için yapılan oosit kültürünün ardından, oositler konfokal mikroskopi ile görüntülenmeden önce fikse edilir veydehidre edilir. mRNA lokalizasyon paternlerinin görselleştirilmesi, RNA transportunun tüm yolağının izlenmesi ve transkript içindeki cis-etkili elementlerin yanı sıra VLE'ye bağlanan trans-etkili faktörlerin RNA transportunu yönlendirmedeki rollerinin belirlenmesi için bir okuma sağlar (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Bu tekniği, ek RNA'lar ve proteinlerle ko-lokalizasyon (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008) ve motor proteinlerin ile sitoskeletin bozulmasıyla (Messitt et al., 2008) kombine ederek mRNA lokalizasyonunun temelindeki mekanizmaları araştırmak üzere geliştirdik.

Bu prosedürde, floresan işaretli RNA transkriptleri XUS oositlerine enjekte edilir ve lokalizasyonları izlenir. İlk olarak, RNA floresan nükleotidler ile işaretlenir.Bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunun ardından RNA, bir mikroenjeksiyon aparatına yüklenir. Oositler bir enjeksiyon kabına yerleştirilir ve dikkatlice mikroenjekte edilir. Son olarak oositler, konfokal mikroskopta görüntüleme yapılmadan önce RNA lokalizasyonunun gerçekleşmesine izin vermek için kültüre edilir.Merhaba, ben Brown Üniversitesi Moleküler Biyoloji, Hücre Biyolojisi ve Biyokimya Bölümü'nden Dr. Kimberly Mallory'nin laboratuvarından James Gagnan. Bugün size Xap oositlerinde hücre altı RNA lokalizasyonunu görselleştirme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, erken omurgalı gelişimi sırasında RNA lokalizasyonu için gerekli olan RNA mimarisini ve protein faktörlerini incelemek amacıyla bu prosedürü kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı şekilde hem radyoaktif hem de floresan işaretli mRNA transkripsiyonunu gerçekleştirin. Kalıp DNA'yı parçalamak için DNase ekleyin ve ardından EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun.Bir G 50 kolonu üzerinden santrifüj ederek birleşmemiş nükleotidleri ve diğer küçük molekülleri uzaklaştırın. Ardından RNA, etanol çöktürme ile konsantre edilir, yıkanır ve yeniden süspanse edilir. Sintilasyon sayımı ile konsantrasyonu belirledikten sonra, RNA'yı 50 nM konsantrasyonuna seyreltin ve beş µL'lik alikotlar halinde -80 °C'de saklayın.Mikroenjeksiyonu gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda, işaretli RNA'nın bir alikotunu çözün ve 70 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin. Ardından, partikülleri uzaklaştırmak için oda sıcaklığında bir mikro santrifüjde maksimum hızda 10 dakika santrifüjleyin ve buz üzerinde muhafaza edin. Sonrasında, 25 mL 3 mg/mL içeren 50 mL'lik konik bir tüp içerisine Xenopus laevis yumurtalığından parçalar izole edin.pH 7.4'de 0.1 molar potasyum fosfat tamponu içindeki kollagenaz. Lotlar arası farklılıklar nedeniyle 18 °C'de nazikçe çalkalayın. Kollagenaz uygulama süresi değişkenlik gösterebilir ve görsel muayene ile dikkatle izlenmelidir.Defoliasyonun sağlandığından emin olmak için 15 dakika boyunca veya oositler yumurtalıktan gözle görülür şekilde ayrılana kadar çalkalamaya devam edin, ardından oositlerin konik tüpün dibine çökmesini bekleyin. Solüsyonu uzaklaştırın ve yerine MBSH tamponu ekleyin. Bu işlemi tekrarlayın; toplamda üç kez olmak üzere iki kez daha yıkayın.Ardından, standart bir ışık mikroskobu altında üçüncü veya dördüncü evredeki CYTES'leri ve MBSH tamponunu manuel olarak ayıklayın. Üçüncü evre sitler tamamen opaktır ancak beyazdır. Dördüncü evre sitler ise biraz daha büyüktür ve pigmentle beneklenmiştir.Hafif şeffaf olan sitler çok genç, tamamen pigmente olmuş veya polarize pigment dağılımı sergileyen sitler ise çok yaşlıdır. Son olarak, üç buçuk inçlik kapilerleri çekerek ve uçlarını eğerek yaklaşık 0,05 milimetre dış çapında iğneler hazırlayıp mikroenjeksiyon için hazır hale getirin. mRNA'lı oositler ve iğneler hazır olduğunda mikroenjeksiyona geçiniz.Enjeksiyon başına iki nanometre iletmek için iğneyi distile su ile kalibre ederek başlayın. İğneyi gaz kontrollü bir mikroenjektör kullanarak doldurun ve damla boyutunu bir mikrometre yardımıyla kalibre edin; kalibrasyondan sonra enjekte edilecek RNA'yı iğneye ön yükleme yapın. Ardından, ayrıştırılmış oositleri MBSH tamponu içeren, tabanında siyah köpük kauçuk katmanı bulunan bir enjeksiyon kabına yerleştirin.Beyaz oositler, siyah bir arka plan önünde belirgin şekilde seçilir. Ardından, her bir oositi 50 nanomolar konsantrasyonda iki litrelik RNA ile dikkatlice enjekte edin. Her oositin yalnızca bir kez enjekte edildiğinden emin olun ve enjeksiyon tamamlandığında iğneyi düzenli olarak tıkanıklığa karşı kontrol edin.Kalan RNA'yı dışarı atın, iğneyi desy suyu ile durulayın ve enjeksiyon için bir sonraki RNA'yı yükleyin. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen sitleri steril bir 24 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın; her kuyucukta bin adede kadar SİT kültüre edilebilir.Tamponu uzaklaştırın ve her kuyucuğa 400 µL cyte kültür ortamı ekleyin. Ardından, kültür süresince nemli bir ortamı korumak için kültür plağını ıslak bir kağıt havlu bulunan plastik bir kabın içine yerleştirin; oositleri, istenen inkübasyon süresinden sonra sekiz ile 48 saat arasında değişen zaman noktaları için 18 °C'de inkübe edin. Enjekte edilen oositlerin inkübasyonundan sonra oositler mikroskopi için hazırlanabilir.Ölü oositleri ayıklayın ve hayatta kalan oositleri cam tüplere yerleştirin. Oositlerin %90'ından fazlasının hayatta kaldığı rutin olarak gözlemlenmektedir. Tampon çözeltiyi M-E-M-F-A fiksatif ile değiştirin ve hücreleri 20 dakika boyunca sallayarak inkübe edin.Fiksasyon süresi tamamlandıktan sonra, fiksasyon sırasında oositleri güneş ışığından koruyun. Fiksatif maddeyi uzaklaştırıp yerine eşit hacimde MBSH tamponu ekleyerek oositleri yıkayın. Toplamda iki yıkama olacak şekilde bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.Ardından, oositleri susuz metanol ile yıkayın. İlk olarak, hacmin yarısını uzaklaştırın ve yerine metanol ekleyin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.Bu yıkama işlemlerinin ardından, çözeltinin tamamını uzaklaştırın ve yerine metanol ekleyin. Bu metanol yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Fikse edilmiş veydehidrate edilmiş oositler, görüntüleme aşamasına kadar -20 °C'de saklanabilir.Görüntüleme öncesinde, görüntüleme yüzeyini kaplamak için cam tabanlı bir WPI fluoro kaba Marie berraklaştırma ortamı ekleyin. Oositleri metanolden fluoro kaba, beraberinde taşınan metanol hacmini minimize ederek dikkatlice aktarın; oositleri ters bir konfokal mikroskopta görüntüleyin, hem Zeiss LSM 510 hem de Aica TCS SP iyi sonuçlar vermektedir. Şimdi, mikroenjeksiyonu takiben gerçekleşen subselüler RNA lokalizasyonuna dair bazı temsili görüntüler göstereceğiz; floresan etiketli kontrolün sekiz saatlik kültürlemesi sonrasında floresan RNA nükleusta görülebilir.RNA, oosit sitoplazmasında homojen olarak dağılmış halde görülebilir. Ancak, taşıma mekanizmasını aktive eden diziler içeren floresan işaretli bir RNA, oositin vejetal polüne doğru gerçekleşen sübsellüler lokalizasyon sürecinde gözlemlenebilir. Az önce, floresan işaretli RNA'ların zapositlere nasıl mikroenjekte edileceğini ve konfokal mikroskopi ile RNA lokalizasyonunun nasıl izleneceğini gösterdik.Bu prosedürü uygularken, kültürün RNA kontaminasyonunu önlemek için DEPC ile işlem görmüş solüsyonlar kullanmak, oositlerinizi antibiyotik içeren OCM'de kültüre etmek ve fotobeyazlamayı önlemek için oositlerinizi mümkün olduğunca güneş ışığından korumak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

visualizing-rna-localization-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon...

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Xenopus embriyonik ektoderm hücre polarite çalışmaları için cazip bir model haline gelmiştir. Bir tahlil floresan proteinlerin hücre içi dağıtım ektoderm hücreler değerlendirilir olduğu açıklanmıştır. Bu protokol adresi sorular sinyal mekansal kontrolü ile ilgili yardımcı olacaktır.

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

Bireyin GFP etiketli proteinlerin ya autofluorescent yapıların canlı görüntüleme için bir...

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

Üretimi<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta Mikrotubul ilişkili RNA&#39;lar tanımak ayıklar

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Xenopus laevis yumurtalarından seyreltilmemiş sitoplazmik ekstraktların hazırlanması ve canlı görüntülenmesi için bir yöntem tanımladık.

Xenopus laevis Dinamik Sitoplazmik Organizasyonu Görselleştirmek için Yumurta Ekstresi Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Yöntemleri

Bu protokol, hücre iskeletinin nükleer şekil ve fare oosit sistemindeki iç zarsız organeller üzerindeki fiziksel etkisini belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. Çerçeve, diğer hücre türlerinde ve bağlamlarında kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

Erken embriyogenezde tek hücrelerde zigotik genom aktivasyonu sırasında yeni başlayan transkripsiyonu görselleştirme yöntemlerini açıklıyoruz.

Erken Embriyoların Tek Hücrelerinde Zigotik Genom Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Öğrenin, Xenopus oositlerine floresan etiketli RNA enjekte ederek konfokal mikroskopi ile RNA taşınmasını görselleştirme yöntemini. Bu teknik, hücre içi RNA dinamiklerini in vivo ortamda izlemek için güçlü bir araç sunar.

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

Daha fazla video keşfet