Hawaii Bobteylleri Squid Hemocytes Alınması Euprymna scolopes Ve Simbiyotik ve Non-Simbiyotik Bakteriler bağlılık Gözlem

Yetişkin bobtail kalamarlar tanklarından çıkarıldıktan sonra %2 etanol içeren filtrelenmiş deniz suyu çözeltisi ile anestezi altına alınır. Sefalik kan damarı aracılığıyla kanları alınır. 26,5 gauge'lik bir şırınga ile çekilen hemolenf mavi renkte görünür.

Hemosiyanin varlığı nedeniyle, hemositler istenen konsantrasyona kadar seyreltilir ve sekiz bölmeli bir lam üzerine paylaştırılır. Hemositler lama yapıştıktan sonra, floresan bir boya olan hücre izleyici turuncu (cell tracker orange) ile boyanır ve floresan mikroskobunda görselleştirilebilen GFP etiketli bakterilerle karşı karşıya getirilirler. Merhaba, ben Connecticut Üniversitesi Moleküler ve Hücre Biyolojisi Bölümü'nden Spencer Olm.

Ben NY Home Lab'den Andrew Collins. Bugün size Hawaii bobtail mürekkep balığından hemolenf veya kan çıkarma prosedürünü göstereceğiz. Bu opis'i hazırlıyorsunuz.

Bobtail mürekkep balıkları, Hawaii kıyılarındaki mercan resifleri yakınlarında yaşayan gececil hayvanlardır ve en sevdikleri yiyecek olan karidesleri avlamak için gece dışarı çıktıklarında, simbiyotlarının ürettiği ışığı kendilerini kamufle etmek için kullanırlar. Laboratuvarda, faydalı bakterilerin hayvan dokularını nasıl kolonize ettiğini incelemek için bu ilişkiden yararlanıyoruz. Konakçının doğal bağışıklık sistemi bileşenleri ile biyolüminesans özelliğine sahip bakteri ortağı VIO ide arasındaki etkileşimleri incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü uyguluyoruz.

Öyleyse başlayalım. Hemolenf ekstre etmeden önce, 500 mililitre filtre steril edilmiş yapay deniz suyu içinde taze hazırlanmış %2 etanol çözeltisi içeren bir litrelik bir beherde bir yetişkin mürekkep balığını anestezi edin. 10 dakika sonra, mürekkep balığı yüzer halde görünecek ve dokunmaya aktif olarak tepki vermeyecektir.

Buna rağmen, mantonun hareketiyle belirtilen solunumun devam ettiği ve pigment hücrelerinin aktivitesini gösteren kromatofor aktivitesinin hala gözlemlenmesi gerekir. Beherdeki steril deniz suyu etanol çözeltisinin bir kısmını standart bir balmumu diseksiyon tepsisine dökün ve mürekkepbalığını ventral bölgesi yukarı bakacak şekilde tepsiye daldırın. Standart bir 200 microliter pipet ucu kullanarak, iki göz arasında yer alan ana sefalik kan damarını açığa çıkarmak için huniyi ve mantoyu geriye doğru çekin.

Sefalik kan damarını delmek ve 50 ila 100 microliter veya 10 ila 20 microliter hemolenf çekmek için 26,5 gauge iğneye sahip steril bir şırınga kullanın. Eğer hayvan birden fazla kez donör olarak kullanılacaksa, hemolenfi buz üzerinde steril bir 1,5 milliliter tüpe yerleştirin. Bu adım doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, kalamar kanının koyu mavi görünmesi gerektiğini unutmayın.

Hayvanı canlandırmak için normal deniz suyu tankına yerleştirin, ardından hemolenfi oda sıcaklığında mikrofüjde santrifüj ederek hemositleri çöktürün ve süpernatanı pipetle uzaklaştırın. Yıkama işlemi için hemositleri 500 µL kalamar Ringer çözeltisinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri çöktürmek için tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın.

Son olarak, hemosları ve kalamar ringer solüsyonunu yeniden süspande edin. Hücre konsantrasyonunu bir hemositometre ile belirleyin. Ardından, bir lamın her bir odasına yaklaşık 2000 hücre ekleyin.

Hücrelerin yaklaşık 10 dakika boyunca cama yapışmasını sağlayın. Bu yoğunlukta, hemoslar cam yüzeyde homojen bir monokatman oluşturmalıdır. 28 °C'de orbital çalkalayıcıda bakterileri hazırlarken hemosları buz üzerinde tutun.

Yeşil floresan raporlayıcı gen içeren bir veya daha fazla Vireo bakteri suşunu, deniz suyu triton ortamında orta log fazına kadar büyütün. Bir spektrofotometre kullanarak, hücre yoğunluğunu belirlemek için kültürün 600'deki optik yoğunluğunu ölçün; bakterileri bir santrifüj peletine getirin, süpernatantı atın ve peleti yeniden süspanse edin. Bir mililitre kalamar ringer çözeltisinin içine, bakterileri hemositlere ekleyin.

Her bölmesinde 100.000 bakteri bulunan bölmeli cam lamları kullanın. Lamları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Maksimum bağlanmayı sağlamak için, hemositoplazmayı boyamak amacıyla final konsantrasyonu 0.005% olacak şekilde cell tracker orange ekleyin.

30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 150 µL taze kalamar ringer çözeltisi ile yıkayın. Konfokal mikroskop altında, boyanmış hemositleri ve ilişkili bakterileri inceleyerek hemositin tüm yüzeyindeki bakterileri sayın. Şimdi size, GFP etiketli non-simbiyotik Filio Harvey Eye bakterisi ve doğal kalamar simbiyotu Filio fii ile uyarılmış hemositlerin bazı temsili görüntülerini göstereceğiz.

Burada, herhangi bir bakteri ile uyarılmamış bir hemo bölgesinin görüntüsü yer almaktadır. Hücre kırmızı görünmektedir ve aktive olmuştur. Böylece psödopod benzeri uzantılarını görebilirsiniz.

Hücre, bakteriyel simbiyont *Vibrio fischeri* ile karşı karşıya getirildiğinde, birkaç bakterinin hücre yüzeyine bağlandığı görülür. Ancak, simbiyotik olmayan *Vibrio harveyi* bakterisi hemositlere maruz bırakıldığında, çok daha fazla bakteri bağlanır. Az önce size bir bobtail mürekkepbalığından hemolenf nasıl çıkarılacağını, hemositlerin nasıl izole edileceğini ve bu mürekkepbalığı hücrelerine bakteriyel adezyonun karakterize edilmesi için bunların deneylerde nasıl kullanılacağını gösterdik.

Hemositler lameline yapıştıktan sonra tespit edilerek, bu protokol immünokimya için modifiye edilebilir. Ayrıca, hemositler hayvandan alındıktan sonra R-N-A-D-N-A ve proteinler de ekstraksiyonu yapılabilir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.