Gözenekli Ortam Mikrobiyal Ulaştırma incelenmesi için basit mikroakışkan Sistemleri: Mikrodünya Pencere

Eco chip cihazlarının kullanımıyla, fiziksel yapıların ve basınç yüksekliklerinin sabit tutulabileceğini veya değiştirilebileceğini gösteriyoruz. Patojenik olmayan ve yeşil floresan protein eksprese eden bir VIO bakteri suşu kullanılarak gerçekleştirilen taşıma deneyleri aracılığıyla yüzey kimyasının, akışkan özelliklerinin veya partiküllerin ya da mikropların karakteristiklerinin etkisi sistematik olarak incelenirken; habitat yapısının, akış koşullarının ve inokülum boyutunun temel taşıma fenomenleri üzerindeki önemini örneklendiriyoruz. Mikroakışkan yazılımı, gizli bir dünyanın etkileyici bir görünümünü sunmaktadır.

Merhaba, ben Vanderbilt Üniversitesi'ndeki Vanderbilt Bütünsel Biyosistem Restorasyon Eğitimi Enstitüsü'nden Dimitri Marker. Ben de Viro Laboratuvarları'nda araştırma ve geliştirme mühendisi olan David Schafer. Merhaba, ben Connecticut Üniversitesi'ndeki Çevre Bilimi ve Mühendisliği Merkezi, Kimyasal Malzemeler ve Biyomoleküler Mühendisliği Bölümü'nden Leslie Sho. Ve ben de yine Zebra'dan added Dicot.

Bugün size temel çevre bilimi ve mühendisliği araştırmaları için modüler mikroakışkan habitat dizileri oluşturma prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, orman ortamlarındaki mikrobiyal taşıma etkileşimleri üzerinde mikrometre ölçekli yapıların etkilerini incelemek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.

Bir mikroakışkan cihaz oluşturmanın ilk adımı, cihazın iki boyutlu yerleşim planını bilgisayar destekli çizim veya CAD programında çizmektir. Biz AutoCAD kullandık, ancak Clue-in veya CorelDRAW gibi diğer çizim programları da mevcuttur. Yazılım, tasarımcının makroskobik bir alan boyunca fiziksel yapıları aslına uygun şekilde kopyalamasına olanak tanırken, bireysel özellikler beş mikrondan daha düşük bir çözünürlükte tanımlanır.

CAD çiziminden hareketle bir fotoğraf maskesi oluşturulur. Massachusetts'in kuzey ucunda bulunan Advanced Reproductions Corporation tarafından üretilen bir krom maske kullanıyoruz. Mikroakışkan cihaz üretiminin sonraki birkaç adımı, bir master oluşturmak için temiz oda içerisinde gerçekleştirilir.

Temiz bir silikon wafer, bir spin kaplayıcıda fotoresist ile kaplanır. İlk olarak, wafer spin kaplayıcı platformuna sabitlenir ve wafer'ın merkezine birkaç gram SU 8 20 25 fotoresist dökülür. Ardından wafer, başlangıçta 500 RPM hızda 15 saniyelik bir yayılma döngüsü ve ardından 4, 000 RPM hızda 35 saniyelik bir ince kaplama döngüsü için döndürülür.

Spin kaplama işleminden sonra, fazla solventin uçurulması için wafer 95 °C'deki bir sıcak plakaya 10 dakika boyunca yerleştirilir. Wafer hazırlama aşamasındaki son adım, kenar boncuğunun (edge bead) temizlenmesidir. Bu işlem, wafer'ın tekrar spin kaplayıcıya yerleştirilmesi ve kaplanmış wafer'ın dış kenarına sürekli bir SUA kenar temizleyici akışı uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Bir sonraki adım, fotoresistin UV ışığına seçici maruziyeti ile desenlenmesidir. İlk olarak, kaplanmış wafer düz bir yüzeye yerleştirilir ve krom maske doğrudan üzerine konur. Rubylith kırmızı maskeleme filmi, istenen alanın dışındaki desenlerin aktarılmasını engeller.

Ardından, kaplanmış gofret üzerine maske aracılığıyla bir nokta taşıma sistemi kullanılarak santimetrekare başına 300 mJ UV ışığı dozu uygulanır. Son olarak, fotodirencin ışığa maruz kalan bölgelerini çapraz bağlayarak çözünmez hale getirmek için gofret 95 °C'de 15 dakika boyunca pişirilir. Ana kalıbın oluşturulmasındaki son adım, fotodirencin çapraz bağlanmamış bölgelerinin uzaklaştırılarak geride yükseltilmiş rölyef yapılarının bırakılmasıdır.

İlk olarak, gofret bir kez daha spin kodlayıcıya yerleştirilir ve geliştirici solüsyon ile kaplanır. Geliştirici, kaplanmış gofret üzerinde yaklaşık beş dakika bekletilir ve ardından spinleme ile uzaklaştırılır; böylece gofret üzerinde belirgin bir desen oluşur. Kalan tüm kalıntılar, dönen gofretin üzerine izopropil alkol püskürtülerek yıkanır.

Bu adım için yaklaşık beş ila 10 saniye boyunca 2200 RPM döndürme hızı kullanıyoruz. Son olarak, tamamlanan kalıp bir nitrojen gaz akımı kullanılarak kurutulur ve bir cihaz dökümü için gerekli olana kadar bir kapta saklanır. Mikroakışkan cihazları, silikon elastomer polimetilsiloksan kullanarak üretiyoruz.

İlk olarak, baz malzeme ve kürleme ajanı 10'a bir ağırlık oranında plastik bir kaba aktarılır. Ardından karışım karıştırılır. Andy, Thinky AR 100 kondisyonlama karıştırıcı kullanarak kabarcıkları giderdi.

Döngü tamamlandığında, sıvı PDMS master üzerine eşit şekilde dökülür. Master ve kürlenmemiş PDMS'yi içeren kap, ardından gaz giderme işlemi için bir vakum odasına yerleştirilir. Polimer kabarcıkları neredeyse anında ortaya çıkar.

Gaz giderme işlemi, tüm kabarcıklar kaybolana kadar devam eder. Polimer çapraz bağlanmasının tam olarak gerçekleşmesi için kap, 65 °C sıcaklıktaki düz bir fırında en az dört saat bekletilir. Ardından, kürlenmiş PDMS, yeniden kullanılabilir kalıptan dikkatlice çıkarılır.

Önce ilk dört kenar, desenli bölgenin iyice dışından bir skalpel kullanılarak kesilir ve ardından cihaz, cımbız yardımıyla desenli gofretten soyulur. İstenirse cihazın kenarları makasla düzeltilebilir. Cihazın bir alt bölümü, kalıplanmış PDMS cihazının geri kalanından ayrılabilir.

Ardından, PDMS üzerinden erişim delikleri açılır. Farklı boyutlarda ticari olarak temin edilebilen ve küçük bir mil üzerine monte edilmiş biyopsi punchları kullanılır. Basınçlı PDMS çekirdekler pens yardımıyla çıkarılır.

Son olarak, kenarları düzeltilmiş ve delikleri açılmış cihaz, izopropil alkol ve köpük uçlu polipropilen bir sürücü kullanılarak temizlenir. Cihaz, azot ile kurutulur ve ardından solvent kalıntılarını tamamen gidermek için fırına yerleştirilir. Bir mikroakışkan cihaz yapımındaki son adım, PDMS'nin bir cam lam tabanına bağlanması ve ardından cihazın önce sıvı ile doldurulmasıdır.

PDMS cihaz ve bir lam, yapıştırma yüzeyleri yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyiciye yerleştirilir. Bu deneyde, PDC 32 G herrick plazma temizleyici kullanıyoruz. Vakum sağlandığında ve mavi-mor plazma görünür olduğunda, zamanlayıcı 30 saniyeye ayarlanır.

Plazma jeneratörü kapatılır. Oda yeniden basınçlandırılır; cihaz ve sürgü odadan çıkarılır ve yapıştırma yüzeyleri birbiriyle temas ettirilir. Aktive edilmiş bileşenler odadan çıkarılırken, yüzeylerin aktive kalması için hızlı hareket etmek önemlidir.

Hafifçe baskı uygulamak, iyi bir yapışma sağlanmasına yardımcı olur. Yapışmanın kalitesi, bir köşeden pensle çekilerek kontrol edilir. Ardından, hidrofilik iç kısım; tampon ortam veya deiyonize su gibi sulu bir çözelti ile kolayca doldurulabilir.

Her bir kaynak kuyucuğuna ve ilgili mikrogözenekli akış hücresine su iletilir. Tüm odalar dolduğunda, buharlaşmayı geciktirmek ve steriliteyi korumak için cihazın tamamının üzerine kürlenmiş ince bir PDMS tabakası yerleştirilir. Cihazdaki basınç güdümlü akışı kalibre etmek için mikroyapılı akış hücrelerini deiyonize su ile önceden doldurun ve cihazın üzerine sıvı iletim arayüzü ve steril bir sızdırmazlık görevi gören bir akış modülü yerleştirin.

Bu akış modülü tek başına kullanılabileceği gibi plastik şırınga gibi harici bir sıvı içeren rezervuara da bağlanabilir. Plastik şırınga gibi sıvı içeren bir rezervuarı veya akış modülünü üst akış girişine bağlayın. Rezervuardaki sıvı yüksekliğini, alt akış yüksekliğinin üzerinde tutun.

Yukarı akış rezervuarı ile her bir aşağı akış çıkış kuyusu arasındaki yükseklik farkı, cihazlar üzerinden geçen akış hızlarını belirlemek için basınç güdümlü akışın itici kuvvetini tanımlar. Aşağı akış kuyularından düzenli aralıklarla örnek toplamak için küt uçlu 25 gauge iğne kullanılır. Örneğin, örnekler arasındaki gerçek geçen süreyi dikkatle kaydederek her 15 ila 20 dakikada bir örnek topluyoruz.

Şırınganın ağırlığı, örnekleme öncesi ve sonrasında analitik bir terazide kaydedilir. Toplam hacme karşı toplam zaman grafiği çizilir ve eğim, ortalama kütle akış hızına eşit olur. Giriş rezervuarının geniş kesit alanı, çıkış kuyucuklarına kıyasla, akışkan cihazlar boyunca hareket ederken akış hızlarının önemli ölçüde değişmesini önlemeye yardımcı olur; örneklenen hacim Y ekseninde, örnekleme zamanı ise X ekseninde olacak şekilde grafiğe dökülür.

Doğrunun eğimini elde etmek için Excel gibi basit bir grafikleme programında, eğim ortalama hacimsel akış hızı için kullanılır. Akışı görselleştirmek ve yüzey etkileşimlerini incelemek için karboksilli, YG ve düz YG yüzeyli üç mikromolar floresan lateks boncukların seyreltik bir çözeltisi kullanılır. İlk olarak, deiyonize su içerisinde %0,01 katı konsantrasyonunda bir boncuk çözeltisi hazırlanır.

Çözelti yukarı akış kuyucuklarına eklenir ve akış modülü zu'ya yeniden takılır. Boncuk akışı bir saat boyunca gözlemlenir ve MITx BCEB 0 1 3 U monokrom kamera ile donatılmış bir Zeiss AIOt 25 floresan mikroskobunda yaklaşık her 10 dakikada bir kaydedilir. Ayrı kareler hızlı ardışık çekimlerle yakalanır ve floresan aydınlatma ile iletim ışığı aydınlatması kullanılarak Image J gibi bir yazılım programı ile videolara dönüştürülür.

Hem boncuklar hem de yapılar görünür durumdadır. Geçirgen ışık engellendiğinde, yalnızca parlak floresan boncuklar görünür. Cihaz boyunca, alt yüzey boyunca çökmüş veya toplayıcılara tutunmuş durağan boncuklar belirgindir.

Canlı bakteri kullanılan deneyler için, Vibrio türleri gibi, patojenik olmayan ve yeşil floresan protein eksprese eden bir bakteri kültürü hazırlanır. İlk olarak, stok kültür derin dondurucudan çıkarılır. Steril LB büyüme ortamı içeren bir erlen, stok kültür ile inoküle edilir.

Tek kullanımlık bir ekim özesi kullanılarak, yaklaşık 10⁹ hücre/mL konsantrasyonda stasyoner faz kültür elde etmek amacıyla erlenmayer çalkalamalı inkübatörde gece boyunca inkübe edilir. Uygulamaya bağlı olarak, bakterilerin başlangıç konsantrasyonu daha kesin bir şekilde belirlenebilir. Steril tamponla doldurulmuş bir mikroakışkan cihaz hazırlanır.

Ardından, akış yukarı kuyucuklardaki steril sıvı boşaltılır ve yerine 20 µL bakteri kültürü eklenir. Bir pipet kullanılarak, çıkış kuyucuklarına bir şırınga ile hafif emme uygulanarak bakteriler cihaza ekilir. İnkübasyonun ardından, kuyucuklardaki bakteri miktarı, kolonizasyonu takiben her bir kuyucuğun floresan yoğunluğu ölçülerek belirlenebilir. Akış yukarı giriş kuyucuğu daha önce olduğu gibi boşaltılır ve yerine 25 ppt tuz içeren tampon çözelti ile yıkanır.

Yapay deniz suyu, bir şırınga yardımıyla akış hücrelerini 20 ila 40 µL tampon çözelti ile tek tek yıkayarak üst akış kuyucuklarına hafif bir basınçla uygulanır. Bu miktar, ilk yıkamadan sonra akış hücresinin mikroakışkan toprak kısmının gözenek hacminin yaklaşık 100 ila 200 katıdır. Bakterilerin gözenekli ortamlardan uzun süreli perfüzyonu, daha önce gösterildiği şekilde akış modülü kullanılarak gerçekleştirilir.

Bakteriyel büyüme ve transportun floresan ve beyaz ışık görüntüleri zaman içinde ölçülebilir. Bu deneyde, Q imaging ink firmasından alınan renkli beş soğutmalı CCD kamera ile yedi günlük bir süre boyunca her 15 ila 20 saatte bir görüntüler alınır. Cihazlarımız, fiziksel habitat yapısının bakterilere protozoalar tarafından avlanmaya karşı sığınak sağlama etkilerini incelemek için de kullanılabilir.

Burada, mikrogözenekli bir akış hücresi içindeki bakteriler ve cihazda bu bakterilerle beslenen, çok daha büyük silli protozoon eulo görülmektedir. Mikroakışkan cihazdaki sıvı akışının analizinde, 40 milimetrelik bir basınç yüksekliği için ortalama akış hızının dakikada 0.71 mikrolitre olduğu saptanmıştır. Basınç yüksekliği 60 milimetreye çıkarıldığında, akış hızı orantılı olarak dakikada 1.04 mikrolitreye yükselmiştir.

Cihazda çeşitli yüzey kimyalarına sahip boncuklar kullanıldığında, cihaz yüzeylerinde karboksilenmemiş boncukların daha fazla biriktiği gözlemlenmiştir. Çapı 6 ila 10 milimetre olan boncukların, daha küçük gözenek açıklıklarına kapılma olasılığı çok daha yüksekken, daha yüksek hidrostatik basıncın neden olduğu daha hızlı akış hızları, eco chipp mikroakışkan cihazında bakteriyel büyümenin analiz edilmesinde beklendiği üzere, boncuk tutulumunda ve kapılmasında azalmaya yol açmıştır.

Cihazın farklı sektörlerindeki görüntü yoğunluğunda nitel farklar olduğunu gözlemliyoruz. Floresans yoğunluğu, kanaldaki mikrobiyal biyokütle için bir vekil parametre olarak nicelendirilebilir. Devam eden deneylerde, düşük akış koşullarının sürekli kayma kuvvetlerinin, bu görüntülerde belirgin olduğu üzere, bakteriyel agregasyona ve flok oluşumuna neden olduğunu gözlemliyoruz. Az önce size parçacık ölçeğini ölçmek, gözenekli ortamlarda çarpışmalı taşınımı incelemek veya mikro yapılı habitatlardaki mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için basit mikroakışkan cihazların nasıl oluşturulacağını ve kullanılacağını gösterdik.

Akış hücreleri kullanılarak yapılan çalışmalarda, boncukların kaldırma kuvvetini, kolloidlerin ve toplayıcıların yüzey kimyasını dikkate almak önemlidir. Mikroakışkan rejime ölçekleme yapıldığında, yüzey etkileri gözlemlenen fenomenlere baskın gelebilir. Pratik olarak hemen her fiziksel yapı, mikroakışkan akış hücresi tasarımına dahil edilebilir.

İşte hepsi bu. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.