Gözenekli Ortam Mikrobiyal Ulaştırma incelenmesi için basit mikroakışkan Sistemleri: Mikrodünya Pencere

Eko çip cihazlarının kullanımı ile fiziksel yapıların ve basınç başlıklarının sabit veya değişken tutulabileceğini gösteriyoruz. Yüzey kimyasının, akışkan özelliklerinin veya parçacıkların veya mikropların özelliklerinin etkisi, VIO bakteri türünü ifade eden patojenik olmayan yeşil bir floresan proteini kullanılarak taşıma deneyleri yoluyla sistematik olarak araştırılırken, habitat yapısının, akış koşullarının ve aşı boyutunun temel taşıma olayları üzerindeki önemini gösteriyoruz. Mikroakışkan yazılım, gizli bir dünyanın etkileyici görünümü.

Merhaba, Vanderbilt Üniversitesi Vanderbilt Bütünleştirici Biyosistem Restorasyon Eğitimi Enstitüsü'nden Dimitri Marker'ımız. Ben David Schafer, Viro Laboratuvarları'nda araştırma ve geliştirme mühendisiyim. Merhaba, ben Connecticut Üniversitesi Çevre Bilimi ve Mühendisliği Merkezi'nde Kimyasal Malzemeler ve Biyomoleküler Mühendisliği Bölümü'nden Leslie Sho ve ben de Zebra'dan Dicot'u ekledim.

Bugün size temel çevre bilimi ve mühendislik araştırmaları için modüler mikroakışkan habitat dizileri oluşturmak için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, mikrometre ölçekli yapıların orman ortamındaki mikrobiyal taşıma etkileşimleri üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Mikroakışkan bir cihaz oluşturmanın ilk adımı, bilgisayar destekli bir çizim veya CAD programında cihazın iki boyutlu bir düzenini çizmektir. AutoCAD kullandık, ancak ipucu veya mercan çizimi gibi başka çizim programları da mevcut. Yazılım, tasarımcının fiziksel yapıları makroskopik bir alan boyunca aslına uygun olarak kopyalamasını sağlarken, bireysel özellikler beş mikrondan daha az çözünürlükte tanımlanır.

CAD çiziminden bir fotoğraf maskesi oluşturulur. Massachusetts'in kuzey ucundaki Advanced Reproductions Corporation tarafından üretilen bir krom maskesi kullanıyoruz. Mikroakışkan cihaz üretiminin sonraki birkaç adımı, bir master oluşturmak için temiz bir odada gerçekleşir.

Temiz bir silikon gofret, bir spin kodlayıcıda fotorezist ile kaplanır. İlk olarak, gofret spin kodlayıcı platformuna bağlanır ve gofretin merkezine birkaç gram SU 8 20 25 fotorezist dökülür. Daha sonra gofret, 500 RPM'de ilk 15 saniyelik bir yayılma döngüsü için döndürülür, ardından 35 saniye boyunca 4.000 RPM'lik bir ince kaplama döngüsü izlenir.

Eğirme işleminden sonra, gofret, fazla çözücüyü buharlaştırmak için 95 santigrat derecede 10 dakika boyunca sıcak bir plaka üzerine yerleştirilir. Gofret hazırlamanın son adımı, kenar boncuğunu çıkarmaktır. Bu, gofretin döndürme kodlayıcıya geri döndürülmesi ve kaplanmış gofretin dış kenarına sabit bir SUA kenar hızı sökücü akışı uygulanmasıyla yapılır.

Bir sonraki adım, UV ışığına seçici olarak maruz bırakarak fotorezisti modellemektir. İlk olarak, kaplanmış gofret düz bir yüzeye yerleştirilir ve krom maske doğrudan üstüne yerleştirilir. Rubylith kırmızı maskeleme filmi, desenlerin istenen alanın dışına aktarılmasını engeller.

Daha sonra, santimetre kare başına 300 mili JUUL UV ışığı dozu, bir nokta taşıma sistemi kullanılarak maske aracılığıyla kaplanmış gofrete iletilir. Son olarak, gofret, fotorezistin ışığa maruz kalan bölgelerini çapraz bağlamak ve onları çözünmez hale getirmek için 95 santigrat derecede 15 dakika pişirilir. Master'ı yaratmanın son adımı, fotorezistin çapraz bağlı olmayan bölgelerini çıkarmak ve geride yükseltilmiş kabartma yapıları bırakmaktır.

İlk olarak, gofret bir kez daha spin kodlayıcıya geri gönderilir ve geliştirici çözümü ile kaplanır. Geliştirici, kaplanmış gofret üzerinde yaklaşık beş dakika bırakılır ve daha sonra döndürülür, bu da gofret üzerinde açıkça belirgin bir desen ile sonuçlanır. Kalan herhangi bir kalıntı, eğirme gofretinin üzerine izopropil alkol püskürtülerek yıkanır.

Bu adım için yaklaşık beş ila 10 saniye boyunca 2200 RPM sıkma hızı kullanıyoruz. Son olarak, bitmiş master bir nitrojen gazı akımı kullanılarak kurutulur ve bir cihazın dökümü için gerekli olana kadar bir tabakta saklanır. Silikon elastomer polimetil alan kullanarak mikroakışkan cihazlar üretiyoruz.

İlk olarak, temel malzeme ve sertleştirici madde, 10'a bir ağırlık oranında plastik bir kaba teslim edilir. Daha sonra, karışım karıştırılır. Andy, düşünceli bir AR 100 bakım mikseri kullanarak köpürdü.

Döngü tamamlandığında, sıvı PDMS master'ın üzerine eşit olarak dökülür. Ana ve kürlenmemiş PDMS'yi içeren çanak daha sonra gazı gidermek için bir vakum odasına yerleştirilir. Polimer kabarcıkları neredeyse anında ortaya çıkar.

Gaz giderme, tüm kabarcıklar kaybolana kadar devam eder. Çanak, polimer çapraz bağlanmasına tam olarak izin vermek için en az dört saat boyunca 65 santigrat derecede düz bir fırına yerleştirilir. Daha sonra kürlenmiş PDMS, yeniden kullanılabilir master'dan dikkatlice çıkarılır.

İlk dört kenar bir neşter kullanılarak desenli bölgenin iyice dışında kesilir, cihaz cımbız kullanılarak desenli gofretten soyulur. İstenirse cihazın kenarları makas kullanılarak kesilebilir. Cihazın bir alt bölümü, kalıplanmış PDMS cihazının geri kalanından ayrılabilir.

Daha sonra, PDMS'den erişim delikleri açılır. Küçük bir çardak üzerine monte edilmiş birkaç farklı boyutta ticari olarak temin edilebilen biyopsi zımbaları kullanıyoruz. Pres PDMS çekirdekleri forseps kullanılarak çıkarılır.

Son olarak, kesilmiş ve delinmiş cihaz, izopropil alkol ve köpük uçlu bir polipropilen çubuk kullanılarak temizlenir. Cihaz nitrojen kullanılarak kurutulur ve ardından tüm solvent kalıntılarını gidermek için fırına yerleştirilir. Mikroakışkan bir cihaz yapmanın son adımı, PDMS'yi bir cam slayt alt tabakaya yapıştırmak ve ardından önce sıvı ile doldurmaktır.

PDMS cihazı ve bir cam sürgü, yapıştırma yüzeyi aralıklı olarak bir plazma temizleyiciye yerleştirilir. Bu deneyde bir PDC 32 G herrick plazma temizleyici kullanıyoruz. Vakum kurulduğunda ve mavi mor plazma göründüğünde, 30 saniyelik bir zamanlayıcı ayarlanır.

Plazma jeneratörü kapatıldı. Hazne tekrar basınçlandırılır ve hazneden alınan cihaz ve sürgü ile yapıştırma yüzeyleri temas ettirilir. Aktive edilmiş bileşenleri hazneden çıkarırken, yüzeylerin aktif kalması için hızlı hareket etmek önemlidir.

Hafif basınç, iyi bir yapışma sağlamaya yardımcı olur. Bağın kalitesi forseps ile bir köşeye çekilerek kontrol edilir. Hidrofilik iç kısım daha sonra tampon ortam gibi sulu bir çözelti ile kolayca doldurulabilir veya deiyonize edilebilir.

Su sıvısı, her bir kaynak kuyusuna ve karşılık gelen mikro gözenekli akış hücresinden uygulanır. Tüm hazneler dolduğunda, buharlaşmayı geciktirmeye ve steriliteyi korumaya yardımcı olmak için tüm cihazın üzerine ince bir kürlenmiş PDMS tabakası yerleştirilir. Cihazdaki basınçla çalışan akışı kalibre etmek için, mikro yapılı akış hücrelerini deiyonize su ile önceden yükleyin, sıvı dağıtım arayüzü görevi gören bir akış modülü ve cihazın üstüne steril bir conta yerleştirin.

Bu akış modülü kendi başına kullanılabilir veya plastik şırınga gibi harici bir sıvı içeren rezervuara bağlanabilir. Plastik şırınga veya akış modülü gibi sıvı içeren bir rezervuarı yukarı akış girişine bağlayın. Rezervuardaki sıvının yüksekliğini, aşağı akışın yüksekliğinin üzerinde tutun.

Yukarı akış rezervuarı ile her bir aşağı akış çıkış kuyusu arasındaki yükseklik farkı, cihazlardan geçen akış hızlarını ölçmek için basınçla çalışan akışın itici gücünü tanımlar. Aşağı akış kuyularından düzenli aralıklarla numune toplamak için kör uçlu 25 gauge bir iğne kullanılır. Örneğin, her 15 ila 20 dakikada bir numune topluyoruz ve numuneler arasında geçen gerçek süreyi dikkatlice not ediyoruz.

Şırınganın ağırlığı, numune alınmadan önce ve sonra analitik bir teraziye kaydedilir. Agrega hacmine karşı agrega süresi, ortalama kütle akış hızına eşit eğim ile grafiklendirilir. Giriş rezervuarının çıkış kuyularına karşı geniş kesiti, sıvı cihazlardan geçerken akış hızlarının önemli ölçüde değişmesini önlemeye yardımcı olur, örneklenen hacmi Y ekseninde ve x ekseninde örnekleme süresini çizer.

Çizginin eğimini elde etmek için Excel gibi basit bir grafik programında, ortalama hacimsel akış hızı için eğim kullanılır. Akışı görselleştirmek ve yüzey etkileşimlerini incelemek için karboksi, YG ve düz YG yüzeyli üç mikromolar floresan lateks boncuktan oluşan seyreltik bir çözelti kullanılır. İlk olarak,% 0.01 katı madde konsantrasyonunda deiyonize suda bir boncuk çözeltisi hazırlanır.

Çözelti yukarı akış kuyularına eklenir ve akış modülü zu'ya yeniden bağlanır. Akış boncuk akışı bir saat boyunca görselleştirilir ve MITx BCEB 0 1 3 U monokrom kamera ile donatılmış bir Zeiss AIOt 25 floresan mikroskopta yaklaşık her 10 dakikada bir kaydedilir. Tek tek kareler hızlı bir şekilde art arda yakalanır ve floresan aydınlatmalı ve iletilen ışık aydınlatmalı Image J gibi bir yazılım programı kullanılarak filmlere birleştirilir.

Boncuklar ve yapılar görülebilir. İletilen ışık engellendiğinde, yalnızca parlak floresan boncuklar görünür. Alt yüzey boyunca biriken veya kollektörlere tutturulmuş sabit boncuklar, cihazın her yerinde belirgindir.

Canlı bakteri kullanılarak yapılan deneyler için, Vibrio türü gibi bir kültür, patojenik olmayan yeşil floresan protein ifade eden bir bakteri hazırlanır. İlk olarak, bir stok kültürü derin ücretsiz depolamadan kaldırılır. Steril LB büyüme ortamına sahip bir şişe, stok kültürü ile aşılanır.

Tek kullanımlık bir aşılama döngüsü kullanılarak, şişe, mililitre başına yaklaşık 10 ila dokuzuncu hücre konsantrasyonuna sahip sabit bir faz kültürü ile sonuçlanacak şekilde çalkalanarak gece boyunca inkübe edilir. Uygulamaya bağlı olarak, başlangıçtaki bakteri konsantrasyonu daha kesin bir şekilde ölçülebilir. Steril tampon ile doldurulmuş bir mikroakışkan cihaz hazırlanır.

Daha sonra yukarı akış kuyularındaki steril sıvı boşaltılır ve 20 mikrolitre bakteri kültürü ile değiştirilir. Bir pipet kullanılarak, bakteriler, çıkış kuyucuklarında bir şırınga ile hafif emme kullanılarak cihaza ekilir İnkübasyondan sonra, kuyucuklardaki bakteri miktarı, kolonizasyonu takiben her bir oyuğun floresan yoğunluğunun ölçülmesiyle belirlenebilir. Yukarı akış giriş kuyusu daha önce olduğu gibi boşaltılır ve bin tuzda 25 parça ile yıkanmış tampon ile değiştirilir.

Yapay deniz suyu, 20 ila 40 mikrolitre tampon çözeltisi ile tek tek akış hücrelerini yıkayan bir şırınga ile yukarı akış kuyularına hafif basınç uygulanır. Bu, ilk yıkamadan sonra akış hücresinin mikroakışkan toprak kısmının zayıf hacminin yaklaşık 100 ila 200 katıdır. Bakterilerin gözenekli ortamdan uzun süreli perfüzyonu, tam olarak daha önce gösterildiği gibi akış modülünün kullanılmasıyla sağlanır.

Bakteri büyümesi ve taşınmasının floresan ve beyaz ışık görüntüleri zaman içinde ölçülebilir. Bu deneyde, yedi günlük bir süre boyunca her 15 ila 20 saatte bir, Q görüntüleme mürekkebinden renkli beş soğutmalı CCD kamera ile görüntüler çekiliyor. Cihazlarımız, fiziksel habitat yapısının, protozoaların avlanmasından bakteri sığınağı sağlama üzerindeki etkilerini araştırmak için de kullanılabilir. Açık.

Burada, bakteriler üzerinde otlayan cihazda görülebilen çok daha büyük kirpikli protozoa eulo ile mikro gözenekli bir akış hücresindeki bakteriler bulunmaktadır. Mikroakışkan cihazdaki sıvı akışının analizinde, 40 milimetrelik bir basınç kafası için ortalama akış hızının dakikada 0,71 mikrolitre olduğunu bulduk. Basınç yüksekliğini 60 milimetreye çıkararak, akış hızı orantılı olarak dakikada 1.04 mikrolitreye yükseldi.

Cihazda çeşitli yüzey kimyalarına sahip boncuklar kullanıldığında, cihaz yüzeylerinde daha fazla karboksilatlanmamış boncuk birikimi gözlemliyoruz. Altı ila 10 milimetre çapındaki boncukların daha küçük gözenek açıklıklarında sürüklenme olasılığı çok daha yüksekti. Daha yüksek hidrostatik basıncın neden olduğu daha hızlı akış hızları, eko chipp mikroakışkan cihazında bakteri üremesini analiz etmesi beklendiği gibi, boncuk tutma ve sürüklenme ile sonuçlandı.

Cihazın farklı sektörlerindeki görüntü yoğunluğundaki niteliksel farklılıklara dikkat çekiyoruz. Floresan yoğunluğu, kanaldaki mikrobiyal biyokütle için bir vekil olarak ölçülebilir. Devam eden deneylerde, düşük akış koşullarının sürekli kesme kuvvetlerinin, bu görüntülerde açıkça görüldüğü gibi bakteri agregasyonuna ve sürü oluşumuna neden olduğunu gözlemliyoruz, Size parçacık ölçeğini ölçmek, gözenekli ortamlardan çarpışma taşımacılığı veya mikro yapılı habitatlardaki mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için basit mikroakışkan cihazların nasıl oluşturulacağını ve kullanılacağını gösterdik.

Akış hücrelerini kullanarak çalışmalar yaparken, boncukların kaldırma kuvvetini ve kolloidlerin ve kollektörlerin yüzey kimyasını dikkate almak önemlidir. Mikroakışkan rejime indirgendiğinde, yüzey etkileri gözlemlenen olaylara hakim olabilir. Pratik olarak herhangi bir fiziksel yapı, mikroakışkan akış hücresi tasarımına dahil edilebilir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.