Name: Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Öğrenin, Rhesus makak maymunlarında çok renkli akış sitometrisi ile CD4+ ve CD8+ T hücre alt kümelerinin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu. Bu yöntem, HIV/AIDS aşı araştırmalarında hücresel bağışıklık yanıtlarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Pramod Nehete makak kan ve PBMC örnekleri ve Bayan Bharti Nehete Bu çalışma kısmen, NIH hibe AI 46.969 fonları tarafından desteklenen ve tüm hücre kültür ortamı, Merkez Medya Laboratuvarı tarafından üretildi, NIH hibe CA tarafından finanse edilmektedir 16.672.

1) Hücre hazırlık ve antijenik stimülasyon, 2) Yüzey işaretleyici boyama, 3) Hücre içi sitokin boyama ve 4) Flow sitometri: toplam yanı sıra T hücrelerinin hafıza altkümelerini ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel analizler için prosedürler dört bölüme ayrılabilir. analiz eder. 1. Hücre hazırlık ve antijenik stimülasyon <ol><li> Her ikisi de taze olarak izole yanı sıra periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) cryo korunmuş bu protokolü kullanılmıştır. PBMC Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) kullanarak yoğunluk gradiyenti sedimantasyon Rhesus makak heparinize veya sitratlı venöz kan örneklerinden izole edildi. PBMC alikotları% 90 FCS saklandı ve sıvı azot içinde% 10 DMSO. </li><li> Cryo korunmuş PBMC kullanırken, dondurulmuş hücre şişeleri sıvı azot çıkarıldı ve hızla dondurma orta ve kaldırmak için RPMI-1640 (HyClone laboratuarlar, logan, UT) ile yıkanır, hafifçe karıştırılır, 37 C su banyosu içinde çözülmüş eksiksiz bir medya yeniden askıya [CM;% 10 ile RPMI-1640 ek ısı inaktive FCS (HyClone laboratuarlar), 2mm L-glutamin (Sigma-Aldrich), 100U/ml penisilin / streptomisin (Invitrogen) ve 6 kültür - iyi doku kültürü plakaları gecede 37 ° ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 atmosfer. Ertesi sabah, canlı hücre sayıları tripan mavi boya dışlama yöntemi ile tespit edildi ve CM yeniden askıya. </li><li> (A) phorbol 12-miristat ile non-spesifik uyarılması için hücrelerin sitokin analizleri takip karşı non-spesifik antijen-spesifik stimülasyon için farklı tedavi edildi: 13-asetat (PMA) ve Ionomycin (I) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 0.1ml bir birim hücreler aynı hacimde (1.0 x 10 6 hücre / kuyu), 96 iyi doku kültürü tabak (BD Biosciences Franklin, göl, NJ) bireysel kuyularda kaplama . PMA ve Ionomycin sırasıyla 50ng/ml ve 500ng/ml son bir konsantrasyonda kullanılmıştır. 96-iyi doku kültürü plaka için son toplam hacmi 0.2ml/well: (b), hacmi 1.0 ml antijen spesifik stimülasyon 1.0 x 10 6 hücre 24-iyi doku kültürü plakaları bireysel kuyuları (BD Biosciences kaplama modifikasyonu 9 ile daha önce açıklandığı gibi, kuyuların önceden tedavi edildi Franklin göl, NJ ). Kısaca, 24 kuyu doku kültürü plakaları, 4 50mm Tris çözüm 2.5 mikrogram / ml / iyi keçi anti-fare IgG (H + L) (Kierkegaard ve Perry Laboratuvarı, Gaithersburg, MD) (pH 8.6) ile kaplandı ° C geceleme. Plakalar steril PBS ve co-uyarıcı mAb CD49d, klon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) ile iki kez yıkandı Ertesi sabah, 10 mg / ml 37 az bir saat inkübe eklendi / iyi takip ° C Inkübasyondan sonra, plakaları oda sıcaklığında steril PBS ile iki kez yıkanır. Altı HIV zarf peptidler 8 kokteyli dahil olmak üzere, faiz antijenleri (her peptid 10μg/ml bir final konsantrasyon eklenmiştir. Yalnız CM hücreleri ile Ek kuyular negatif kontrol olarak hazırlanmıştır. Son 24 her bir kuyu için toplam hacmi -iyi doku kültürü plakası 1.0 ml. </li><li> Hücreler 37 az 6 saat kültüre edildi ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 atmosfer. Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) stimülasyon son 4.5 saat 10μg/ml kültür eklendi. Daha sonra, hücreler 5 ml polipropilen tüpler transfer ve ile yıkanır edildi soğuk (4 ° C) akış yıkama tamponu (Dulbecco'nun PBS (DPBS, Ca 2 / Mg 2-ücretsiz; Life teknolojileri, Rockville, MD) 2% ısı ile inaktive FCS) ve daha sonra çeşitli floresan etiketli antikorlar ile boyanarak için işlenmiş. </li></ol> 2. Boyama İmmünofloresan yüzey belirteçleri <ol><li> Uyarılmış hücreler ilk 4 ölü / canlı 1ul tamir edilebilir su floresan reaktif boya ile boyandı ° C 30 dakika boyunca karanlık, soğuk akış yıkama tamponu ile bir kez yıkanır. </li><li> Sonra, aşağıdaki uygun titre floresan etiketli anti-CD3 monoklonal antikorlar hücrelere ilave edildi: PE-Cy7 (SP34-2), anti-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anti-CD28 PerCP cy5.5 (L293) , anti-CD95 APC (DX2) ve anti-CD4 pasifik mavi (OKT4) eBioscience (San Diego, CA), CD4 dışında BD Biosciences (Franklin göl, NJ) tüm pasifik mavi (OKT4). Hücreler, karanlıkta 30 dakika 4 ° C inkübe edildi. </li><li> Her deney için tazminat kontrolleri ve floresan eksi bir (FMO) hem 10,11 kullanılmıştır kontrol eder. Tazminat kontrolleri her bireyin diğer dedektörlerin içine leke yayılma coeffecients belirlemek için kullanılmıştır. Tazminat kontroller için komple bir set, maymun bir hücre süspansiyonları içeren tüplerde floresan konjuge mAb ile tek renk lekeleri gibi ayrı ayrı boyandı. FMO tüm reaktiflerin ancak bir ilgi içeren çok renkli boyama kombinasyonu ve bir olumlu arasındaki sınırı belirlemek için kullanılırnd oto-floresan seviyesi ve veri çoğaltma negatif nüfus tamamen lekeli örnek mevcut. </li><li> Vitray hücreler daha sonra soğuk akış yıkama tamponu ile yıkanır ve tespiti / permeabilization solüsyonu (BD Biosciences, San Jose, CA) sabit (Bu aşamada hücreler bir gecede 4 saklanabilir ° C karanlıkta) en az 10 dakika hücre içi sitokin boyama işlemini gerçekleştirmeden önce. </li></ol> 3. Hücre içi sitokin boyama <ol><li> Sabit hücreleri akış yıkama tamponu ile yıkanır ve daha sonra Perm / tampon yıkayın (BD Biosciences, San Jose, CA), üreticinin talimatlarına göre eklendi. Kısaca, hücreler 0.1ml 1X Perm / 4 10 dakika boyunca tampon yıkayın ° C karanlıkta inkübe edildi. </li><li> Daha sonra, hücreleri ile inkübe edildi uygun titre FITC etiketli anti-IFN-γ (B27) ve PE-etiketli 4 60 dakika anti-IL-2 (MQ1 17H12) ° C karanlıkta. </li><li> Ardından hücreler permeabilization çözümü ile iki kez daha yıkandı </li><li> En son yıkama aşamasından sonra, hücreler DPBS% 1 paraformaldehid yeniden askıya alan ve 24 saat içinde Flow sitometri analizi tabi. </li></ol> 4. Flow sitometri analizi <ol><li> Veya Mavi ADP (Dako, Carpinteria, CA); boyanan hücreler bir LSR II akış sitometresi (San Jose, CA BD Biosciences) satın alındı. FACS veriler FlowJo yazılımı (Tree Star, Ashland, OR) kullanılarak analiz edildi. </li><li> Şekil. 1 farklı T hücre alt grupları temsil eden bir hayvan analizleri için kullanılan yolluk şeması gösterir. Lenfositler forward scatter (FSC) karşı tarafında dağılım (SSC) ile ilk kapılı ve sonra canlı lenfositleri SSC ve aqua-negatif nüfus dayalı tespit edilmiştir. CD3 içinde daha sonra T hücreleri, CD4 tespit + CD8-(CD4 + T hücreleri olumlu) takip CD3 ifade tarafından tanımlanır ve CD4-CD8 + (CD8 + T hücreleri) popülasyonları + T hücre popülasyonunun. CD4 + ve CD8 + T hücreleri daha naif (Tn, CD28 + CD95-), merkezi bellek (Tcm, CD28 + CD95 +) ve efektör bellek (TEM, CD28-CD95 +) hücreler olarak olarak CD28 ve CD95 ifade temelinde farklı alt içine ayırt edildi 5, 10, edebiyat nitelendirdi. </li><li> Şekil. 2 CD4 + ve CD8 + T hücreleri farklı alt PMA ve ionomycin (PMA + I) ile stimülasyon yanıt sitokin üretimi açısından fonksiyonel kapasite (INF-γ ve / veya IL-2) için nasıl değerlendirildi gösterir. </li></ol> 5. Temsilcisi FACS verileri Rhesus makakların hücre kompozisyon FACS analizi kullanılarak tespit edildi. Şekil 1 temsilcisi hayvan farklı T hücre alt analizler için kullanılan yolluk şeması gösterir. Lenfositler forward scatter (FSC) karşı tarafında dağılım (SSC) ile ilk kapılı ve sonra canlı lenfositleri SSC ve aqua-negatif nüfus dayalı tespit edilmiştir. T hücreleri daha sonra CD3 ifade tarafından tespit edildi. CD3 CD4 + CD8-(CD4 + T hücreleri) ve CD4-CD8 + (CD8 + T hücreleri) popülasyonları içinde + T hücre popülasyonunun da tespit edilmiştir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, CD4 + ve CD8 + T hücreleri daha naif (Tn, CD28 + CD95-), merkezi bellek (Tcm, CD28 + CD95 +) ve efektör bellek (TEM, CD28 ve CD95 ifade temelinde farklı alt içine ayırt edildi CD28-CD95 +) hücreler. Şekil 2A INF-γ gösterir ve unstimulated ve PMA / ionomycin uyarılmış CD4 + T hücreleri ve alt kümeleri, ve Şekil 2B IL-2 üretimi INF-γ ve unstimulated ve PMA / ionomycin CD8 uyarılmış + T hücreleri IL-2 üretimi gösterir, ve alt kümeleri stimülasyonu ile farklı sitokin profillerinin her alt unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0"> Şekil 1: Ayırıcı strateji rhesus macqaues PBMC kompozisyon akım sitometri analizi için kullanılır. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2atmb.jpg" alt="Şekil 2a" border="0"> <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2btmb.jpg" alt="Şekil 2b" border="0"> Şekil 2. (A) toplam CD4 + T hücreleri ve altkümelerini. Sitokin üretimi profili (B) toplam CD8 + T hücreleri ve altkümelerini Sitokin üretimi profili. Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2a.jpg">buraya tıklayın</a> 2a daha büyük bir sürümünü görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2b.jpg">buraya ya da</a> daha büyük bir şekil 2b sürümü için.

<ol><li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li>
<li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+CD8%2B+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li>
<li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li>
<li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li>
<li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li>
<li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li>
<li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Primatol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li>
<li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4%2B+T+cell+responses+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li>
<li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13-parameter+flow+cytometry%3A+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype%2C+function%2C+and+T-cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
</ol>

Çözüm ve Tamponlar <ul><li> Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> RPMI-1640 ortamı (HyClone laboratuarlar, Logan, UT) </li><li> Fetal sığır serumu (FBS), (HyClone laboratuarlar, Logan, UT) </li><li> L-glutamin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> Penisilin / streptomisin (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tripan mavi reaktifi (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> 50 mM Tris, pH 8.6, 4 süzülür ve mağaza ° C </li><li> Dulbecco&#39;nun PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life teknolojileri, Rockville, MD) </li><li> Akış yıkama tamponu:% 2 FBS ile DPBS takviyesi, 4 mağaza ° C </li><li> BD Cytofix / Cytoperm Sabitleme / Permeabilization Çözüm Seti (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Etkinleştirme ajanlar <ul><li> Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> Ionomycin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> Kostimülatör mAb CD49d, klon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> Affinity saflaştırılmış antikor F (ab) 2 parçaları Keçi anti-fare IgG (H + L) (Kierkegaard ve Perry Laboratuvarı, Gaithersburg, MD) </li><li> Belirli aktivasyon ajanlar peptid havuzları, tek peptid, veya tam protein içerebilir </li></ul> Sitokin salgılanması inhibitörleri <ul><li> Brefedin A (Lisans, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> Golgi Tak (San Jose, CA BD Biosciences) alternatif olarak kullanılabilir </li></ul> Antikorlar <ul><li> Ölü / Canlı tamir edilebilir su floresan leke kiti (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD4 pasifik mavi (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA) </li><li> CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD28 PerCP cy5.5 (L293), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IL-2, PE (MQ1 17H12), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul>

rhesus makak maymunlarının hücresel bağışıklık tepkisi multicolor sitometrisi analizleri

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Rhesus makak modeli şu anda aşılar ve tedaviler geliştirilmesi için mevcut en iyi patogenezinde anlamak için saygı ile HIV-AIDS modeli gibi<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Burada, hücresel immün yanıtları detaylı fenotipik ve fonksiyonel analiz, özellikle CD4 tarafından hücre içi sitokin üretimi + ve CD8 + T hücrelerinin yanı sıra bireysel bellek alt kümeleri için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz hem CD4 interferon gamma üretimi için kesin nicel ve nitel önlemler (INF) ve interlökin (IL) -2 elde + ve CD8 + T hücreleri PMA artı ionomycin (PMA + I) ile uyarılan Rhesus makak PBMC. Sitokin profilleri bellek hücreleri farklı alt farklı. Ayrıca, bu protokol antijen spesifik CD4 bile küçük kesirleri göstermek için bize hassasiyet + ve CD8 + T hücre alt grupları, laboratuvarda geliştirilen bir HIV zarf peptid kokteyl aşısı ile aşılanan rhesus makakların PBMC örnekleri içinde. Çok renkli akım sitometri tekniği, tam olarak T hücreleri farklı popülasyonlar tanımlamak için güçlü bir araçtır<sup&gt; 4,5</sup&gt; Sitokin üreten yeteneği ile<sup&gt; 6</sup&gt;, Non-spesifik veya antijen spesifik uyarılmasını takiben<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

Biz toplam bellek altkümelerini rhesus makakların CD4 + ve CD8 + T hücreleri, HIV / AIDS aşısı çalışmaları için ideal bir model gibi ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu için çok renkli flow sitometri yararını göstermektedir.

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

Rhesus makak modeli, hem patogenezin anlaşılması hem de geliştirme açısından şu an için HIV-AIDS için mevcut olan en iyi modeldir...

Bu video, periferik kan mononükleer hücrelerinin veya pbmc'lerin stimülasyonu ve boyanması prosedürünü göstermektedir. Çok renkli akış sitometrisi analizi için, tam kandan izole edilen pbmc'ler doku kültürü plaklarına yerleştirilir. Hücreler, bir bağışıklık yanıtı oluşturmak için kimyasal veya biyolojik olarak stimüle edilir.Stimülasyonun ardından, eksprese edilen yüzey belirteçlerine göre hücre tiplerini tanımlamak için bir antikor kokteyli eklenir. Ardından hücreler permeabilize edilir ve hücre içi sitokin ekspresyonunu saptamak için farklı bir antikor kokteyli eklenir; sonrasında, PBMC'lerin spesifik alt kümeleri için sitokin profillerini belirlemek amacıyla hücreler akış sitometrisi ile analiz edilir. Merhaba, ben Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi İmmünoloji Bölümü'nde Dr. Jagan SAS'ın laboratuvarından Amy Courtney.Merhaba, ben de laboratuvardan Hong. Bugün size T-hücre yanıtlarının çok renkli sitometri analizini göstereceğiz. Laboratuvarımızda, Rhesus Macaca'lardaki hücresel bağışıklık yanıtlarını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Trian Blue boya dışlama yöntemini kullanarak, Reuss Maca'dan alınan pbmc'lerin canlı hücre sayısını belirlemek için bir hemo sitometre kullanarak bu protokole başlayın. İşlemleri laminar akışlı bir kabinde gerçekleştirin reus.Spesifik olmayan stimülasyon için hücreleri, 96 kuyucuklu doku kültürü plağının her kuyucuğuna 100 mikrolitre hücre süspansiyonu gelecek şekilde, mililitre başına 10 milyon hücre konsantrasyonunda komple medyuma süspande edin. Ardından, toplam hacmi 0,2 mililitreye tamamlamak için, final konsantrasyonu 50 nanogram/ml PMA ve 500 nanogram/ml CIN olacak şekilde PMA ve CIN içeren 100 mikrolitre medyum ekleyin; negatif kontrol kuyucuklarına ise her birine sadece 100 mikrolitre komple medyum ekleyin. Hücreleri, nemlendirilmiş %5 karbondioksit atmosferinde, 37 °C'de 1,5 saat boyunca inkübe edin.Kültüre, nihai konsantrasyonu 10 µg/mL olacak şekilde felden A ekleyin ve 4,5 saat daha inkübe edin. Felden A, immün boyama ile görünürlüğü artırmak için gold G cihazındaki trapp sitokinlerine eklenir; stimülasyon sonrası ortamı uzaklaştırmak için santrifüjleyin ve ardından 200 µL soğuk akış yıkama tamponu ekleyip düşük hızda santrifüjleyerek yıkayın. Bu yıkama işlemini tekrarlayın, ardından 50 µL akış yıkama tamponu içerisinde yeniden süspande edin.Hücreler artık, yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücrelerin bulunduğu her bir kuyucuğa yüzey markerlerinin ekspresyonu için boyanmaya hazırdır. Üretici talimatlarına göre hazırlanan bir mikrolitre canlı-ölü sabitlenebilir aqua floresan reaktif boya ekleyin. Hücreler inkübe olurken, karanlıkta dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca inkübe edin.Mikro tüpler içerisinde, hücreler için kullanılacak boyama solüsyonlarını hazırlayın. İlk olarak, uygun miktarlarda şunları içeren bir boyama kokteyli hazırlayın: Titre edilmiş floresan işaretli monoklonal antikorlar; anti CD3 PE SCI 7, anti CD8 Alexa 700, anti CD28 per CCP SCI 5.5, anti CD95 APC ve anti CD4 Pacific Blue; Flow Wash Buffer.Ardından, her bir floresan konjuge antikorun tek başına tek renkli boyama olarak hazırlandığı tüplerle, her bir boyanın diğer dedektörlere olan taşma katsayılarını belirlemek için kullanılacak kompanzasyon kontrollerini hazırlayın. Son olarak, ilgilenilen reaktif dışındaki tüm reajenleri birleştirerek floresan eksi bir veya FMO boyamalarını hazırlayın. Bu işlem, tam boyanmış örneklerdeki verileri ve otofloresans seviyelerini tekrarlayarak, pozitif ve negatif popülasyon arasındaki sınırı belirlemek için kullanılacaktır.Hücreler canlı-ölü boyasında inkübe edildikten sonra, fazla boyayı uzaklaştırmak için onları bir kez soğuk akış yıkama tamponu ile yıkayın ve yıkama tamponunu aspire edin. Ardından hazırlanan boyama çözeltilerini ekleyin. Hücreleri dört derece Celsius'ta, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.Fazla antikorları uzaklaştırmak için boyanmış hücreleri soğuk akış yıkama tamponu ile yıkayın. Ardından 100 µL BD fiksasyon permeasyon çözeltisi ekleyerek en az 10 dakika bekletin. Hücreleri, kullanılana kadar karanlıkta, dört °C'de 24 saate kadar saklayın veya hücre içi sitokinleri işaretlemek için hücre içi sitokin markalama adımına geçin.Öncelikle hücreleri 100 µL 1X perm yıkama tamponu ile permeabilize edin. Hücreler inkübe olurken 4 °C'de, karanlıkta 10 dakika boyunca bekletin. Boyama antikorlarını, kompanzasyon kontrollerini ve FMO kontrollerini, daha önce yapıldığı gibi 1X perm yıkama tamponu içinde hazırlayın.Hücreler 10 dakika inkübe edildikten sonra, santrifüjle çöktürün ve 1x perm yıkama tamponunu uzaklaştırın. Uygun boyama antikorlarını ekleyin. Ardından, hücreleri ve antikorları 4 °C'de, karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe edin.Hücreleri permeasyon solüsyonu ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri sabitlemek için DPBS içinde %1 paraformaldehitte yeniden süspande edin. Hücreleri, kullanılana kadar 24 saate kadar dört derece Celsius'ta, karanlıkta saklayın.Hücreler boyandıktan sonra, FACS analizi gerçekleştirmek için bir LSR II akış sitometresi veya CytoDP akış sitometresi kullanın. Ardından verileri FlowJo veya benzeri bir yazılım kullanarak analiz edin. Rhesus maca'daki PBMC kompozisyonu, FACS analizi kullanılarak belirlenmiştir.Bu şekil, temsilci bir hayvandan alınan farklı T hücresi alt kümelerinin analizi için kullanılan kapılama şemasını göstermektedir. Lenfositler önce ileri saçılım FSC'ye karşı yan saçılım SSC üzerinden kapılanmış, ardından canlı lenfositler SSC ve AQUA negatif popülasyona göre belirlenmiştir. Daha sonra T hücreleri CD3 ekspresyonu ile tanımlanmış; CD3 pozitif T hücresi popülasyonu içerisinde CD4 pozitif, CD8 negatif ve CD4 negatif, CD8 pozitif popülasyonlar da belirlenmiştir.CD4 pozitif ve CD8 pozitif T hücreleri, CD28 ve CD95 ekspresyonuna dayalı olarak naive, merkezi bellek ve efektör bellek hücreleri şeklinde farklı alt kümelere ayrılmıştır. Bu şekil, uyarılmamış ve PMA/ionofor ile uyarılmış CD4 pozitif T hücreleri ve alt kümelerindeki interferon gamma ve IL-2 üretimini göstermektedir.Stimülasyonla ortaya çıkan belirgin sitokin profillerine dikkat edin. Her alt kümede. Size pbmc'lerin çok renkli akış sitometrisi analizinin nasıl yapılacağını göstermeliyiz.Bu prosedürü uygularken, hem tek renkli kompanzasyon kontrollerinin hem de floresan eksiltmeli (FMO) kontrollerin hazırlandığını hatırlamak önemlidir. Akış sitometrisi verilerinin doğru analizi için bu iki kontrolün de gereklidir. Kompanzasyon kontrollerinin seçimi hakkında daha fazla bilgi için lütfen yazılı protokolümüze bakınız.Ayrıca, floresan işaretli antikor kullanırken, örnekleri ışık maruziyetinden korumak için üzerlerini örtmenin önemli olduğunu lütfen unutmayın. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

multicolor-flow-cytometry-analyses-cellular-immune-response-rhesus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) CD4+ ve CD8+ T hücrelerini, γδ T hücrelerini, B hücrelerini, doğal öldürücü (NK) hücreleri ve monositleri tanımlamak için iki florokrom kullanan akış sitometrisi tabanlı bir teknik gösterilmektedir. Hücrelerin yüzey belirteçlerine karşı florokrom konjuge antikorlarla inkübe edilmesinin ardından, hücre alt kümeleri optimal bir akış sitometrik geçit stratejisi kullanılarak tanımlanır.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde İmmün Hücre Alt Kümelerini Tanımlamak için Bir Akış Sitometrisi Testi

Bağışıklık yetkili sıçanların plevra boşluğuna II-45 mezotelyoma hücrelerin nakledilmesi ile plevra malign mezotelyoma ortotopik sıçan modelinin üretimi sunulmuştur. Bir akış sitometrik yöntemi de tanımlanan bir 25 ul kan örneğinden, bu hayvanlarda, yedi immün hücre alt analiz etmek.

II-45 singenik Rat Mezotelyoma Modelinde Ortotopik Yerleştirilmesi ve Periferik Bağışıklık Hücre İzleme

Burada, AIDS virüsü karşısında Rhesus macaque CD8 + T hücreleri, numaralandırma ve karakterize etmek için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu makale, HIV immünoloji alanında değil, aynı zamanda CD8 + T hücre yanıtları hastalık sonucunu etkileyebilecek bilinen biyomedikal araştırmanın diğer bölgelerine sadece yararlıdır.

Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi + Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Açıklanan 96 genlerin ifade quantitate için bir metodoloji olduğunu ve 18 yüzey proteinler tarafından tek hücreleri ex vivodifferentially tanımlanması için izin, genler ve proteinler kandan hücrelere göre virüs enfeksiyonlu hücrelerdeki dile getirdi. Yaklaşım+ T çalışma SIV-enfekte CD4 için uyguladığımız rhesus makak izole hücreler.

Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden

Burada, yalıtım ve CD4 karakterizasyonu için bir protokol+ T hücre alt kümeleri insan periferik kandan açıklanmıştır. Saf CD4+ T-hücreleri tarafından akış sitometresi T foliküler yardımcı hücresi alt kümeleri oranlarını belirlemek için analiz.

CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Bu çalışmada FcγR etkinleştirilmesinden kaynaklanan Reaktif oksijen türleri (ROS) üretim algılamak için Akış Sitometresi kullanımını gösterir. Bu yöntem değişiklikleri antimikrobiyal ve fagositler yanıt bağışıklık kompleksleri, opsonized mikroorganizmalar veya doğrudan FcγR cross-linking fonksiyonlu Redoks değerlendirmek için kullanılabilir.

Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim

Burada, murine dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde hem ekstra hem de hücre içi boyama tahlilleri kullanarak monosit/makrofaj ve T hücrealt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı ve tekrarlanabilir akış sitometri protokolünü tanımladık ve murine osteoartritin yerleşik bir cerrahi modelini kullanıyoruz.

Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Öğrenin, Rhesus makak maymunlarında çok renkli akış sitometrisi ile CD4+ ve CD8+ T hücre alt kümelerinin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu. Bu yöntem, HIV/AIDS aşı araştırmalarında hücresel bağışıklık yanıtlarını anlamak için değerlidir.

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

Daha fazla video keşfet