Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri
22 Nisan 2010
Biz toplam bellek altkümelerini rhesus makakların CD4 + ve CD8 + T hücreleri, HIV / AIDS aşısı çalışmaları için ideal bir model gibi ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu için çok renkli flow sitometri yararını göstermektedir.
Bu video, periferik kan mononükleer hücrelerinin veya pbmc'nin uyarılması ve boyanması için bir prosedürü göstermektedir. Çok renkli akış sitometrisi analizi için, tam kandan izole edilen pbmc'den Alec Watts doku kültürü plakalarına yerleştirilir. Hücreler, bir bağışıklık tepkisi oluşturmak için kimyasal veya biyolojik olarak uyarılır.
Stimülasyonu takiben, eksprese edilen yüzey belirteçlerine dayalı olarak hücre tiplerini tanımlamak için bir antikor kokteyli eklenir. Daha sonra hücrelere nüfuz edilir ve hücre içi sitokinlerin ekspresyonunu tespit etmek için farklı bir antikor kokteyli eklenir, hücreler daha sonra pbmc'nin spesifik alt kümeleri için sitokin profillerini belirlemek için gerçeklerle analiz edilir. Merhaba, ben Texas Üniversitesi MB Anderson Kanser Merkezi İmmünoloji Bölümü'nde Dr.Jagan SAS'ın laboratuvarından Amy Courtney.
Merhaba, ben de laboratuvardan Hong o. Bugün size T hücresi yanıtlarının çoklu sitometri analizini göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda Reus Maca'daki hücresel immün yanıtları incelemek için kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Trian Blue Dye dışlama yöntemi ile Reuss Maca'dan pbmc'nin canlı hücre sayılarını belirlemek için bir hemo sitometre kullanarak bu protokole başlayın. Laminer akış başlığı reus'ta çalışma.
Hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresinde 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna spesifik olmayan stimülasyon için hücreleri mililitre başına 10 milyon hücre konsantrasyonunda tam ortamda askıya alın. Daha sonra, toplam hacmi mililitre PMA başına 50 nanogram ve negatif kontrol kuyuları için mililitre CIN başına 50 nanogram nihai konsantrasyon ile 0.2 mililitreye getirmek için PMA ve CIN içeren 100 mikrolitre ortam ekleyin, her birine tek başına 100 mikrolitre tam ortam ekleyin. Hücreleri 1,5 saat sonra nemlendirilmiş% 5 karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede inkübe edin.
Kültüre mililitre başına 10 mikrogramlık bir son konsantrasyonda bir felden A ve 4.5 saat daha inkübe edin. Keçe A, ortamı uzaklaştırmak için stimülasyon santrifüjünü takiben immüno boyama ile görünürlüğü artırmak için altın G aparatındaki trapp sitokinlerine eklenir ve daha sonra düşük hızda 200 mikrolitre soğuk akışlı yıkama, tampon ve santrifüj eklenerek yıkanır. Bu yıkamayı tekrarlayın, ardından 50 mikrolitre akış yıkama tamponunda tekrar gönderin.
Hücreler artık, yeniden süspanse edilen hücrelerin her bir oyuğuna yüzey işaretleyicilerinin ifadesi için boyanmaya hazırdır. Üreticilere ve S talimatlarına göre hazırlanmış bir mikrolitre canlı ölü sabitlenebilir aqua floresan reaktif boya ekleyin. Hücreler kuluçkaya yatarken karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Mikro tüplerde gerçekler için kullanılacak boyama solüsyonlarını hazırlayın. İlk olarak, aşağıdakileri uygun şekilde içerecek şekilde ayakta bir kokteyl hazırlayın. Titre edilmiş floresan etiketli monoklonal antikorlar, anti CD üç PE SCI yedi, anti CD sekiz Alexa 700 anti CD 28, CCP SCI 5.5 başına, anti CD 95 A PC ve anti CD dört Pasifik Mavisi Giriş Yıkama Tamponu.
Daha sonra, her bir floresan konjuge antikorun bir tüpünü tek bir renk lekesi olarak ayrı ayrı hazırlayarak, her bir lekenin diğer dedektörlere yayılma katsayılarını belirlemek için kullanılacak kompanzasyon kontrollerini hazırlayın. Son olarak, ilgilenilen hariç tüm reaktifleri birleştirerek floresan eksi bir veya FMO boyaları hazırlayın. Bu, otofloresan seviyelerini ve tamamen lekeli numunelerde bulunan verileri çoğaltarak pozitif ve negatif bir popülasyon arasındaki sınırı belirlemek için kullanılacaktır.
Hücreler canlı ölü lekede inkübe edildikten sonra, fazla boyayı çıkarmak için soğuk akışlı yıkama tamponu ile bir kez yıkayın, yıkama tamponunu aspire edin. Sonra hazırlanan boyama çözeltilerini ekleyin. Hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Fazla antikoru çıkarmak için lekeli hücreleri soğuk akışlı yıkama tamponu ile yıkayın. Daha sonra en az 10 dakika boyunca 100 mikrolitre BD fiksasyon geçirgenlik solüsyonu ekleyin. Hücreleri, kullanılana kadar 24 saate kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın veya hücre içi sitokinleri etiketlemek için hücre içi sitokinleri etiketlemeye devam edin.
İlk olarak, hücreleri bir X permasının 100 mikrolitresinde geçirin. Yıkama tamponu, hücreler inkübe edilirken karanlıkta dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Boyama antikorlarını, kompanzasyon kontrollerini ve FMO kontrollerini daha önce olduğu gibi bir x perma yıkama tamponunda hazırlayın.
Hücreler 10 dakika inkübe edildikten sonra, aşağı doğru döndürün ve bir x perma yıkama tamponunu çıkarın. Uygun boyama antikorlarını ekleyin. Daha sonra hücreleri ve antikorları, inkübasyonu takiben karanlıkta dört santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.
Hücreleri geçirgenlik çözeltisi ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri sabitlemek için hücreleri DPBS'de% 1 Paraform aldehit içinde tekrar askıya alın. Hücreleri 24 saate kadar kullanılana kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın.
Hücreler boyandıktan sonra, gerçekleri gerçekleştirmek için bir LSR iki akış sitometresi veya camgöbeği bir DP akış sitometresi kullanın. Ardından FlowJo veya benzeri bir yazılım kullanarak verileri analiz edin. Reuss Maca'da PBMC bileşimi faks analizi kullanılarak belirlendi.
Bu şekil, temsili bir hayvandan farklı T hücresi alt kümelerinin analizi için kullanılan geçit şemasını göstermektedir. Lenfositler önce öne doğru saçılma FSC'ye karşı yan saçılma SSC ile kapılı hale getirildi ve daha sonra SSC ve AQUA negatif popülasyona dayalı olarak canlı lenfositler tanımlandı. T hücreleri daha sonra CD üç ekspresyon CD dört pozitif, CD sekiz negatif ve CD dört negatif CD sekiz pozitif popülasyon ile tanımlandı, CD üç pozitif T hücresi popülasyonu da belirlendi.
CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif T hücreleri, CD 28 ve CD 95 ekspresyonu temelinde, naif merkezi bellek ve efektör bellek hücreleri olarak farklı alt gruplara ayrıldı. Bu şekil, Unstimulated ve pma'da interferon gama ve IL iki üretimini göstermektedir. CIN, CD'yi dört pozitif T hücresi ve alt kümelerini uyardı.
Stimülasyonla ortaya çıkan farklı sitokin profillerine dikkat edin. Her alt kümede. Size pbmc'nin çoklu akış sitometri analizini nasıl yapacağınızı göstermeliyiz.
Bu yordamı yaparken, hem tek renk telafisi denetimlerini hem de floresan eksi bir denetimlerini ayarlamayı unutmamak önemlidir. Bu kontrollerin her ikisi de akış sitometrisi verilerinin uygun analizi için gereklidir. Kompanzasyon kontrollerinin seçilmesi hakkında daha fazla bilgi için lütfen yazılı protokolümüze bakın.
Ayrıca, floresan etiketli antikor kullanırken, ışığa maruz kalmaktan korunmak için numunelerin üzerini örtmenin önemli olduğunu lütfen unutmayın. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, çok renkli akış sitometrisi analizi için periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) stimülasyonu ve boyanması prosedürünü göstermektedir. Çalışma, HIV/AIDS aşı araştırmaları için bir model olan rhesus makaklarında CD4+ ve CD8+ T hücresi alt kümelerinin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonuna odaklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Akış Sitometrisi
- HIV/AIDS Araştırmaları
Arka Plan
- HIV/AIDS çalışmalarında model olarak Rhesus makakları kullanılır.
- T hücresi alt kümelerinin anlaşılması, aşı geliştirme süreci için kritik öneme sahiptir.
- Çok renkli akış sitometrisi, bağışıklık hücrelerinin detaylı analizine olanak tanır.
- PBMC'ler, bağışıklık yanıtlarının incelenmesinde temel bileşenlerdir.
Çalışmanın Amacı
- T hücrelerinin toplam ve hafıza alt kümelerini karakterize etmek.
- Detaylı immün profilleme için çok renkli akış sitometrisini kullanmak.
- HIV/AIDS bağlamında immün yanıtların anlaşılmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Tam kandan PBMC izolasyonu.
- PBMC'lerin kimyasal veya biyolojik stimülasyonu.
- Hücre tiplerini ve yüzey belirteçlerini tanımlamak için antikor kokteyllerinin kullanımı.
- Akış sitometrisi kullanılarak sitokin profillerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- Analiz için PBK'ların başarılı bir şekilde stimülasyonu ve boyanması.
- Yüzey belirteçlerine dayanarak spesifik T hücresi alt kümelerinin tanımlanması.
- Hücre içi sitokin ekspresyonunun karakterizasyonu.
- HIV/AIDS ile ilgili bağışıklık tepkilerine dair içgörüler.
Sonuçlar
- Çok renkli akış sitometrisi, T hücresi analizi için etkilidir.
- Rhesus makakları, HIV aşı araştırmaları için değerli bilgiler sağlar.
- T hücresi dinamiklerini anlamak, etkili tedaviler geliştirmek için temel teşkil eder.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektör İçin Yönetici Özeti ve Uygunluk
Çok renkli akış sitometrisi, HIV aşı geliştirme süreci için kritik bir preklinik model olan rhesus makaklarında T-hücre alt kümelerinin hassas fenotipik ve fonksiyonel profillemesini sağlar. Bu yaklaşım, sitokin üreten immün yanıtları nicelleştirerek hedef doğrulamayı destekler ve erken keşif aşamasındaki devam/durdur kararlarına bilgi sağlar. Yöntem, antijene özgü stimülasyonu, tanımlanmış hafıza popülasyonlarındaki ölçülebilir hücre içi sitokin çıktıları ile ilişkilendirerek öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Stimülasyon sonrası CD4+ ve CD8+ T hücresi alt kümelerinde IFN-γ ve IL-2 üretimini ölçerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: İmmün hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizlikleri gidermek için hücre içi sitokin ekspresyonunun kalitatif ve kantitatif ölçümlerini sağlar.
- Bilimsel Değer: Aşılanmış hayvanlardan alınan PBMC örneklerindeki düşük miktarlı antijenle spesifik T hücresi fraksiyonlarının hassas tespiti yoluyla biyolojik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tekrarlanabilir immün profilleme için standart boyama ve stimülasyon protokolleri oluşturarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki iş akışlarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Doğru popülasyon kapılamasını (gating) sağlamak için kompanzasyon kontrolleri ve FMO kontrolleri kullanarak, analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik sorunlarını çözer.
- Bilimsel Değer: Naif, merkezi hafıza ve efektör hafıza T-hücresi alt kümelerinde sitokin profillerinin tespitini mümkün kılarak tarama hazırlığını vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Rhesus makaklarında hücre içi sitokin ölçümlerini HIV patogenezi ve aşı kaynaklı bağışıklık yanıtları ile ilişkilendirerek hastalığın önemini tartışır.
- Operasyonel Değer: PBMC stimülasyon sonuçlarını fonksiyonel T-hücresi karakterizasyonu ile bağlayarak, keşif sürecinden preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Bilimsel Değer: Aşı immünojenite değerlendirmesi için sitokin üretimini fonksiyonel bir okuma olarak kullanarak, öngörücü risk azaltma değerine odaklanır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken dönem immün profillemeden öncü bileşik tanımlamaya kadar keşif sürekliliği içinde yer alarak, enfeksiyöz hastalık modellerinde hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin, PMA/ionomycin veya antijene özgü stimülasyon sonrası belirli T hücresi alt kümelerinde sitokin üretimini nicelleştirerek hipotez testlerini nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Standartlaştırılmış stimülasyon, yüzey ve hücre içi boyama ve PBMC örneklerinin akış sitometrik analizi aracılığıyla assay hazırlığını tanımlar.
- Analitikler: Farklı koşullar ve alt kümeler arasında immün yanıtların karşılaştırılmasına olanak tanıyan IFN-γ ve IL-2 üretim frekansları gibi ölçümleri vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Rhesus makaklarında vaccine kaynaklı T hücresi yanıtlarını, HIV vaccine geliştirmesiyle ilgili fonksiyonel immün profillemeye bağlayarak yöntemi preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi, vaccine adayları ve adjuvan formülasyonları genelinde boylamsal immün izleme için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörücü güven, hedef doğrulaması, T-hücre aracılı immün yanıtlardaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: İmmün profilleme için çok renkli akış sitometrisi analizlerinin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Aşı geliştirme programlarında daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve geç evre biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Preklinik modellerdeki kantitatif sitokin profillerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- Çok renkli immünofenotipleme için akış sitometrisi panel tasarımı, kompanzasyon ve kapılama stratejisi konularında gerekli bilimsel uzmanlık.
- Akış sitometresi (örneğin, LSR II) ve yüksek boyutlu veri analizi için yazılım (örneğin, FlowJo) dahil olmak üzere enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları.
- Laboratuvarlar arası stimülasyon koşulları, antikor titrasyonu ve kontrol kurulumu (tek renkli ve FMO) için ekipler arası standardizasyon gereklilikleri.
- İnsan dışı primat PBMC'leri için stimülasyon konsantrasyonlarının ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonu dahil olmak üzere model sistemler arası adaptasyon değerlendirmeleri.
- Kaynak materyal ile desteklenen pratik sınırlamalar: floresan antikorlar için ışık korumasının gerekliliği ve çok renkli panellerde sızıntıyı (spillover) minimize etmek için dikkatli titrasyon.
