Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

Bu video makalesinin genel amacı, aşağıdaki iki soruya yanıt vermektir. Birincisi, protein etkileşimleri üzerine yapılan çalışmalar, aslında başka bir proteine bağlanma yeteneğine sahip bir protein örneğinin fraksiyonunu ölçerek daha güvenilir bir şekilde yapılabilir mi? İkincisi, kinetik analiz bize yapı, fonksiyon ilişkilerini nasıl daha iyi anlamamızı sağlayabilir?

Bu soruların her ikisi de, etiket kullanmadan protein etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak tespit eden bir araç olan Corp X 100'ü içeren bir deneyde ele alınacaktır. Bu deney, sığır sistatin B'nin sistin proteaz papain ile etkileşimini inceleyecektir, iki proteinin karmaşık noktalardaki kristal yapısı, etkileşime giren kalıntıların her birinin sistatin B papin etkileşimini nasıl etkilediğini belirlemek için proteaza bağlanmada rol oynayan birkaç kalıntıya işaret eder. Bölgeye yönlendirilmiş mutajenez yoluyla çeşitli sistatin B varyantları üretilir.

Bu tür deneylerde, rekombinant proteinlerin doğru şekilde katlanmaması, toplanmaması veya bozulmaması, yanlış ve tekrarlanamaz sonuçlara yol açması olasılığı her zaman vardır. VIACORE X 100, CFCA olarak kısaltılan kalibrasyonsuz konsantrasyon analizi ile bağlanma için mevcut olan protein fraksiyonunu belirleme yeteneğine sahiptir. Bu yaklaşım, kalibrasyon standartları mevcut olmadığında bile korunan bağlanma aktivitesine sahip protein konsantrasyonunun belirlenmesine izin verir.

CFCA burada sistatin B varyantlarının konsantrasyonunu belirlemek için kullanılacaktır. Bu veriler daha sonra sistatin B varyantlarının Pepin'e bağlanma kinetiğinin belirlenmesinde girdi olarak kullanılacak ve bu da BOR X 100 kullanılarak değerlendirilecektir. Merhaba, ben İsveç'teki GE Healthcare'den CLA gram.

Bugün meslektaşım Eva Pool size BOR X 100 kullanarak yapı fonksiyon ilişkisi analizinin nasıl yapılacağını gösterecek Rekombinant proteinler zaman içinde uygun olmayan katlanma veya gevşek kutu aktivitesi gösterebilir ve bu davranış, toplam konsantrasyon ölçümüne dayanan yöntemlerle tespit edilemez. Bu, kalibrasyonsuz konsantrasyon analizi ile konsantrasyon ölçümlerini takiben yanlış kinetik verilere yol açabilir. BA çekirdek X 100, sistatin B varyantlarının pepan ile etkileşiminin kinetiğini ve afinitesini analiz etmek için kullanılır.

Bu parametreler bağlanma mekanizması hakkında bir fikir verecektir. Deneysel tasarımın kısa bir açıklaması ile başlıyoruz, o yüzden başlayalım. Sistin, proteaz, papin ve inhibitör sistatin B arasındaki etkileşime, kompleks halindeki iki proteinin kristal yapısı tarafından ortaya çıkarılan hidrofobik temaslar hakimdir.

İnhibitör tarafından, temas alanları N ve C terminalleri Ns ve iki saç tokası halkasıdır. Bu çalışmada, her biri dimerizasyonu önlemek amacıyla sistein üçe kadar Suriye mutasyonu içeren dört mutant incelenmiştir Sistatin B.Kristal yapıda ortaya çıkan bağlama dayanarak, lösin 73 glisin histamin 75'e mutasyona uğratılmış ve tirozin 97 alanine dönüştürülmüştür. İki glisin mutasyonu, histidin 75 ve lösin 73 yan zincirlerinin Pepin'e bağlanma için önemini incelemek için tanıtıldı, tirozin kalıntısı, sistatin B'nin C terminali ile Pepin arasındaki etkileşimi araştırmak için alanine mutasyona uğratıldı.

Üç çift mutantın yanı sıra INE üç ila Suriye tek mutantı, Papain S metil popininin katalizör olarak aktif olmayan bir varyantı ile etkileşimleri açısından test edilmiştir. Proteus'un bu katali inaktif formu, aktif yarıkta CYS 25'e bağlı bir metil grubuna sahiptir. Basitleştirmek için, bu varyantı protokol boyunca propan olarak adlandıracağız.

CFCA, oranın analit moleküllerinin yüzeye difüzyonu ile sınırlı olduğu koşullar altında bağlanma hızının ölçülmesine dayanır. Bu, ligandın yüksek immobilizasyon seviyeleri tarafından tercih edilir. İmmobilizasyon prosedürüne başlamadan önce, deneylerde kullanılan HEP tamponunu sol taraftaki tepsiye yerleştirin ve her iki boruyu da yerleştirin.

Ayrıca sağ taraftaki tepsiye boş bir atık şişesi yerleştirin. Ardından, core X 100 yazılımı aracılığıyla cihaz başlatmaya yeni bir sensör alçı beşi yerleştirin ve başlangıç ekranında dock çipi aracı öğesine tıklayın. Yazılımda dokümanı başlat'a tıklayın.

Ardından, başlangıç ekranından CM beşi sansürlemeyi hedefleyerek pape ve immobilizasyonu ayarlamak için immobilizasyon sihirbazını kullanın, diğer seçenekler düğmesine tıklayın, ardından sihirbazları seçin. Bu, kullanılabilir sihirbazların bulunduğu bir pencere görüntüler. İmmobilizasyonu seçin ve ardından yeni düğmeye tıklayın Sağ altta, immobilizasyon sihirbazının ilk ekranı belirir, sensöre kuplaj alçı beşi varsayılandır.

İkinci akış hücresinde hareketsiz hale getirmek için akış hücresi iki altındaki kutuyu işaretleyin. Birinci akış hücresi, aşağıdaki mevcut üç seçenekten referans yüzeyi olarak kullanmak için değiştirilmeden bırakılmıştır. Sağdaki temas süresini belirtin kutusunu işaretleyin, temas süresi olarak değişir, 900 saniyelik bir temas süresi belirtin.

Ardından, yakalama molekülü eğik ligand çözeltisi altındaki immobilizasyon parametrelerini girin. Papain girin. Ardından ileri'ye tıklayın.

Bir sonraki ekran, numune rafının düzenini görüntüler. Birinci konum, ligand papain'in çip yüzeyine nişan alma bağlantısından sonra kalan aktif maddeyi devre dışı bırakmak için kullanılan et etanolamini tutacaktır. Etanolamin çözeltisini ikinci konuma birinci konuma yerleştirin.

Ligand papain papain'i yerleştirin, fazla miktarda metil sülfat içinde saklanır ve 10 milimolar sodyum asetat tamponunda mililitre başına 50 mikrograma atıfta bulunulur. pH 4.5, çift damıtılmış su pipeti ile 85 mikrolitre EDC'yi bir şişeye pipetleyen amin birleştirme kitinden EDC ve NHS birleştirme reaktiflerini yeniden oluşturur. Kapağını kapatın ve üçüncü konuma yerleştirin.

Dördüncü konumdaki NHS için aynı hacmi kullanın. Cihazın bu dosyada ED, C ve NHS'yi karıştırması için beşinci dosyanın büyük harfli ve boş olması gerektiğine dikkat edin. Ayrıca H2O konumundaki yıkama dosyasını taze deiyonize su ile doldurmayı unutmayın.

Raf ekrandaki taslağa göre dolduğunda, numuneleri yükle'ye tıklayın ve rafı cihaza yükleyin. Raf yüklendiğinde, ileri'ye tıklayın. Çalıştırma başlatılmadan önce bir kontrol listesi gösterilir.

Tüm madde işaretlerinin yerine getirildiğinden emin olun. Başlat düğmesine basılarak çalıştırma başlatılır. Çalıştırma, immobilizasyon prosedürü sırasında başlatılır.

Veriler gerçek zamanlı olarak toplanır. İlk olarak, birleştirme reaktifleri enjekte edilir. Daha sonra pape çip yüzeyine bağlanır ve prosedür kalan aktif esterlerin devre dışı bırakılmasıyla sona erer.

Çalıştırmadan sonra, bir iletişim penceresi çalıştırmanın sonucunu özetler. Bu pencerede, immobilizasyon seviyesi görüntülenir. Tüm bağlantı prosedürü yaklaşık 3000 RU hareketsiz hale getirilmiş papain ile sonuçlanmalıdır.

Papain sensör çipine immobilize edildikten sonra, sistatin B mutant örneklerini en az 300 mikrolitrede toplam yaklaşık 10 nanomolar konsantrasyona seyrelterek CFCA analizine başlayın. Seyreltme faktörünü daha sonra tahlil kurulumunda kullanacağımız gibi kaydedin. Tahlil klasörünün konsantrasyon bölümündeki önceki bölümde açıklandığı gibi sihirbaz iletişim kutusunu açarak başlayın.

Kalibrasyonsuz seçeneğini belirleyin, ardından yeni'yi seçin. Sihirbazın ilk ekranı enjeksiyon sırasını gösterir. Burada sensör çipi CM five ve doğrudan immobilizasyon testi yaklaşımı kullanıldığından ayarlar değişmeden kalabilir.

Sonraki ekranda ileri'ye tıklayın. Çalıştırmadan önce onay kutularını prime bırakın ve başlatma döngülerini çalıştırın seçeneğini işaretleyin. Ayrıca, varsayılan başlatma döngüsü sayısını değiştirmeden üçte bırakın.

Çözüm alanının adına heaps buffer girin. Ardından ileri'ye tıklayın. Bir sonraki ekranda, 20 milimolar sodyum hidroksit olan rejenerasyon çözeltisinin adını girin.

Diğer parametreleri değiştirmeden bırakın. Örnek tabloyu görüntülemek için ileri'ye tıklayın. Örnekleri örnek tabloya göre ayarlayın.

Örnek tablodaki her satır iki döngüyle sonuçlanır. Biri dakikada 10 mikrolitre ve diğeri dakikada 100 mikrolitre akış hızına sahip. Çalıştırmayı boş bir çubukla başlatın.

Ardından 20 santigrat derecede seyreltme faktörü difüzyon katsayısı ve moleküler ağırlık adını girin. Her mutant için difüzyon katsayısı, ürün web sitesindeki web aracı kullanılarak hesaplanabilir. Yazılımın destek gezgininde bu araca bir bağlantı sağlanır.

Her örneğin çalıştırılması ve çoğaltılması önerildiğinden, tablonun tamamını boş satırdan son örneğe kopyalayın ve tablonun en altına yapıştırın. Devam etmek için ileri'ye tıklayın. Bir sonraki ekranda numune rafı görüntülenir.

Numuneleri ve reaktifleri, yazılım tarafından belirtilen düzene göre rafa yerleştirin. Yükle s'ye basarak rafı cihaza yükleyinamples düğmesine basın. Ardından ileri'ye tıklayın.

Numuneleri yükledikten sonra, bir kontrol listesi içeren bir hatırlatma ekranı görüntülenir. Her şeyi kontrol ettiğinizden emin olun ve ardından başlat'a basın. Veriler, çalışma sırasında gerçek zamanlı olarak toplanır.

Çalıştırma tamamlandığında, toplanan verileri görüntüleyen pencereyi kapatın. Ana pencerede yeni bir sonuç öğesinin göründüğünü gözlemleyin. Verilerden konsantrasyonları hesaplamak için yeni sonuç öğesini seçin ve düğmesine tıklayın.

Çekirdek X 100 ile değerlendirin. Değerlendirme yazılımı, araç çubuğundan toplanan tüm verileri görüntülemeye başlar, konsantrasyon analizini seçer ve ardından menüden ücretsiz kalibrasyon yapılır. İlk pencerede, analize dahil edilecek verileri seçin.

Tüm örneklerin verilerini görüntülemek için listeyi kaydırın ve görünüm listesinde adım adım ilerleyin. Herhangi bir veriyi hariç tutmak istiyorsanız, onay işaretini listeden kaldırın. Hesaplamayı başlatmak için ileri'ye tıklayın.

CFCA etkileşim modeli, uygulama tamamlandığında deneysel verilere otomatik olarak uydurulur, sonuçlar sonuç penceresinde her numune için rapor edilir. Tablodaki ilgili satırı seçerek her numune için bağlantı parçalarında adım adım ilerleyin. Ölçülen konsantrasyon adı verilen sütun, analiz edilen numunedeki konsantrasyonu gösterir.

Orijinal numunedeki konsantrasyon, daha önce girilen seyreltme faktörü kullanılarak hesaplanır ve bittiğinde hesaplanan konsantrasyon sütununda gösterilir, sonucu kaydetmek için bitir'e tıklayın. Artık CFCA analizinden proteinlerin konsantrasyonlarını bildiğimize göre, sonraki kinetik ölçümlerimiz için mükemmel bir temele sahibiz. Kinetik analiz şimdi bağlanma mekanizması için anahtar amino asit kalıntılarının önemini anlamamıza yardımcı olacaktır.

Kinetik analizin kurulumuyla başlayalım. Kinetik analiz, yeni bir sensör çipi CM five'ın başlangıç ekranındaki cihaza yerleştirilmesiyle başlar. Kinetiğin benzeşimi için bir tahlil iş akışı oluşturmayı seçin.

Sol üst köşede, ligand ile ilgili bilgilerin girildiği bir diyalog penceresi belirir. Ligand isim kutusuna papain adını girin ve tür türleri listesinden başka bir protein seçin. Ardından, sunulan iki alternatif ligand bağlantı yaklaşımından CM beş sensör çipi kullanarak ligandı kovalent olarak hareketsiz hale getirin, önerilen tahlil iş akışı artık pencerenin sağ tarafında özetlenmiştir.

Bir immobilizasyon adımı ile başlar ve ardından bir tahlil adımı gelir. Devam etmek için devam tuşuna basın. Bir ad girip kaydet'e basarak tahlil iş akışını istendiği gibi kaydedin.

Yazılım artık tahlil iş akışını her adımla ilişkili düğmelerle özetliyor. Sensör yüzeyi hazırlığının ilk adımı, bir mobilizasyon pH'ı bulmaktır. Bu pH bilindiğinden, beliren iletişim kutusunda bilinen değeri girin'e basın.

Arabellek adını, asetat ve pH 4.5'i girin ve kaydet'i seçin. Tahlil iş akışı artık bu adımın tamamlandığını belirtmek için yeşil bir onay işaretiyle güncellenmiştir. Şimdi hareketsiz hale getirme zamanı, hareketsiz hale getirilen adımda çalıştır düğmesine basın.

Bu, CFCA analizi için propan ve immobilizasyon için kullanılanla aynı sihirbazı ortaya çıkarır, kinetik analiz için papinin immobilizasyonu burada da aynı şekilde kurulur, ancak daha az süre için daha seyreltik bir çözelti enjekte edilir. Bu, sistatinin bağlanma oranlarının mutantlar olduğu durumlardan kaçınmak için daha az papini hareketsiz hale getirmek içindir, böylece kinetik veriler izole olarak ölçülebilir. Ligandın adı ve immobilizasyon pH'ı tahlil iş akışında önceki adımlarda girildiğinden, bunların her ikisi de burada önceden ayarlanmıştır.

Gerekli olan tek güncelleme, iletişim süresi için 50 saniyedir. İmmobilizasyon daha sonra daha önce gösterildiği gibi devam eder. İmmobilizasyon seviyesinden sonra beklenen bağlanma 50 R ru'dur.

Çalıştır düğmesinin yanındaki yeşil onay işareti, immobilizasyonun tamamlandığını gösterir. Ardından, adımdaki iş akışına rejenerasyon çözümünü girin. Görüntülenen iletişim kutusunda bilinen değerleri girin'e tıklayarak rejenerasyon koşullarını bulun.

Rejenerasyon solüsyonunu ve temas süresini girin. Ardından kaydet'i tıklayın. Artık ligand hareketsiz hale getirildiğine ve rejenerasyon koşullarına girildiğine göre, her şey çalıştırma kinetiği Afinite tahlil kutusunda kinetik veriler üretecek şekilde ayarlanmıştır, kinetiğin ilk adımı olan çalıştır düğmesine basın.

Affinity sihirbazı, burada kullanılan tek döngü kinetiği için her döngünün enjeksiyon sırasını ana hatlarıyla belirtir, hiçbir şeyi değiştirmeye gerek yoktur. Devam etmek için ileri'ye tıklayın. Bir sonraki adımda, çalıştırmadan önce sistemin hazırlandığını gösteren varsayılan ayarları koruyun.

Talaş yüzeyini dengelemek için bir başlatma döngüsü çalıştırmayı seçin. Ardından, numune için enjeksiyon parametrelerini tanımlayın. Rejenerasyon çözümü daha önce belirtildiğinden ve ayar önceden tanımlandığından, ekrandaki parametrelerin hiçbirini değiştirmeye gerek yoktur.

Sonrakine tıkla. Son olarak, örnekleri belirtin. Her mutant varyant için biri boş, diğeri örnek olmak üzere iki satır girin.

En yüksek konsantrasyon parametresi sıfıra ayarlanarak boş bir döngü gösterilir. İki. Sistatin B varyantları her koşuya sığdırılabilir. Her mutant için moleküler ağırlık, en yüksek konsantrasyon ve seyreltme faktörünü girin, ileri'ye basın.

Aşağıdaki ekranda, numune rafı ana hatlarıyla belirtilmiştir. Protein numunelerinin bir seyreltme serisini hazırlayın ve kapaklı şişeleri rafa yerleştirin Ekranda belirtildiği gibi, tamponlu bir şişe 13 pozisyonuna yerleştirilir ve rejenerasyon solüsyonu içeren bir flakon 14 pozisyonuna yerleştirilir. Su konumunu temiz suyla doldurduğunuzdan emin olun.

Rafı makineye yerleştirin ve numuneleri yükle düğmesine basarak numuneleri yükleyin ve ileri'ye tıklayın. Daha önce olduğu gibi, denemeyi çalıştırmaya devam etmeden önce başlat düğmesine basarak son bir kontrol gerçekleştirin etkileşim verileri gerçek zamanlı olarak görünür. Çalıştırma bittiğinde, kalan sistatin B varyantlarını az önce gösterildiği gibi hemen çalıştırmaya devam edin.

Kalan sistatin B varyantları art arda çalıştırılırsa, adımdaki ilgili onay kutularının işaretini kaldırarak ana adımı ve başlatma döngüsünü atlayın. Her çalıştırma tamamlandığında linkten verilere ulaşılabilir. Tüm sonuçlar tahlil iş akışında.

Bu iş akışı içinde oluşturulan tüm sonuçları içeren bir iletişim penceresi görüntülenir. Kinetik hız sabitlerini hesaplamak için, değerlendirilecek sonucu seçin ve tüm toplu verileri görüntüleyen bir çekirdek X 100 değerlendirme yazılımı yeniden başlatıldığında değerlendir'e basın. Araç çubuğu menüsünden kinetik benzeşimini seçin.

İlk ekranda, değerlendirme için sistein üç ila Suriye mutantı seçilir. Bu mutanttan gelen veriler, bu mutant için gerçekleştirilen boş çalışma ile birlikte görüntülenir ve tıklanarak devam edilir. Önümüzdeki. Sonraki ekranda, örnekle çalıştırmadan çıkarılan boş çalıştırmanın bulunduğu veriler gösterilir.

Kinetik düğmesine tıklayarak kinetiği değerlendirmeyi seçin. Şimdi verileri bire bir etkileşim modeline sığdırmayı seçin. Sığdır düğmesine tıklandığında, uyum hesaplandığı gibi ekranda görüntülenir.

Hazır olduğunda, kalite kontrolleri otomatik olarak uygulanır ve alt kısımda vurgulanır. Kalite kontrol öğelerini inceleyin ve ardından sensör gramlarının yeterli eğrilik gösterdiğinden emin olmak için sensör gram verilerine bakın. Ayrıca, toplanan veriler ile takılan model arasındaki farkları gösteren artık çizime bir göz atın.

Sistematik ve rastgele olmayan sapmalara dikkat edin. Bu uyum kabul edilebilir. Şimdi rapor sekmesindeki kinetik verilere bir göz atın.

İlişkilendirme hızı sabiti, ayrışma hızı sabiti ve denge ayrışma sabiti. İşiniz bittiğinde, bitir'e basın, diğer tüm mutantlar için aynı prosedürü tekrarlayın. İşte incelenen farklı sistatin B varyantları için CFCA analizinin temsili sonuçları.

Spesifik bağlanma konsantrasyonu verileri, dakikada 10 ve 100 mikrolitre akış hızlarında elde edilen sensör gramlarından çıkarılır. İki 80 ölçümü ile belirlenen konsantrasyonu CFCA tarafından belirlenen konsantrasyonla karşılaştırırken, çoğu durumda proteinin lösin 73 glisin varyantı için tamamen aktif olmasına rağmen, aktif protein fraksiyonunun çok düşük olduğu açıktır. Pepin'e bağlanan sistatin B varyantlarının kinetiği, tek döngü kinetiği kullanılarak belirlenir.

Sensör gramları, siyah ile kaplanmış bire bir etkileşim modeli için boş ve referans çıkarılmış verileri kinetik ile gösterir. Lösin 73 varyantı için CFCA tarafından ölçülen spesifik bağlanma konsantrasyonu, iki 80 ölçümü ile belirlenen toplam protein konsantrasyonunun sadece yaklaşık% 10'udur. Kinetik parametrelerin hesaplanmasında doğru konsantrasyon kullanıldığında, Lucien 73 için ilişkilendirme oranının diğer varyantlarınkine benzer olduğu anlaşılır.

Mutantların birleşme oranları, vahşi tip proteininkiyle karşılaştırılabilir olsa da, mutantların ayrışma hızı sabiti, denge ayrışma sabitinde karşılık gelen bir artışla birlikte, iki büyüklük sırasına yakın daha yüksek olabilir. İndirgenmiş afiniteler esas olarak artan ayrışma oranlarına bağlıdır, bu da sistatin B'nin hem ikinci bağlanma döngüsünün hem de C terminal ucunun, kompleks oluşturulduktan sonra inhibitörü enzime bağlı tutarak bağlanma afinitesine katkıda bulunduğunu gösterir, kalibrasyon serbest konsantrasyon analizinin kullanılması bu sonuç için gerekliydi çünkü mutantlardan birinin çok düşük bir bağlanma aktivitesine sahip olduğu ortaya çıktı, Meslektaşım Pol şimdi size yapılandırılmış bir fonksiyon etüdünde bi core X 100'ün nasıl kullanılacağını gösterdi. Bu deneyleri gerçekleştirirken, hem konsantrasyon hem de kinetik analizin aynı bağlanma prosedürüne dayanmasına rağmen, deney koşullarının oldukça farklı olduğunu hatırlamak önemlidir.