Name: Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan ortak kültür modeliyle epitel hücreleri ve bakteriler arasındaki çözünür sinyal etkileşimlerini inceleyin. Bu yöntem, patojen kolonizasyonu ve probiyotik etkileri çalışmak için gastrointestinal koşulları taklit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0.846.453) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R01GM089999) tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Standart SU-8 fotolitografi 1 (Bu video görünmez) kullanılarak silikon ustaların Fabrikasyon. <ol><li> SU-8 "efendileri" (SÜ-8 2050, MicroChem, Newton, MA) bir temiz oda farklı bileşenleri (farklı kalınlıktaki PDMS membranlar, ko-kültür odası) imalatı için. Oluşturmak için standart SU-8 fotolitografi yöntemleri kullanın. Böyle bir ana kalıp herhangi bir mikroimalat tesisi (örneğin, Stanford Mikroakiskan <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">Döküm</a> http://thebigone.stanford.edu/foundry/ imal edilebilir) . </li><li> PDMS çoğaltma önce ana PDMS kolay bırakma kolaylaştırmak için bir vakum kaynağına bağlı bir desikatöre fluorosilane buharı SU-8 ustaları maruz bir kağıt havlu fluorosilane bir damla ekleyin ve bir dakika süreyle vakum uygulamak. Vakum çıkarın ve fluorosilane birikimi için 30 dakika izin verin. SU-8 ana ileride kullanmak üzere kapalı bir kapta tutun. </li></ol> 2. SU-8 master 2 PDMS Replica kalıplama <ol><li> Akışkan katman ve kontrol katmanı SU-8 ustadan PDMS çoğaltma kalıplama yapılır. </li><li> 10:01 ağırlıkça PDMS pre-polimer ve çapraz bağlayıcı karıştırın. 1 saat (ya da hava kabarcıkları PDMS karışımından kaldırılana kadar) için bir desikatöre oranı ve gazını. </li><li> Petri SU-8 ana yerleştirin ve dikkatle SU-8 ustanın üstüne PDMS karışımı dökün. Tekrar Degas PDMS. </li><li> Spin kalıp kalıp etrafında 100μm yeknesak bir PDMS kalınlığı elde etmek için bir dakika için 1200 rpm. </li><li> PDMS tedavi için bir saat PDMS ve 80 SU-8 ana kalıp ° C içeren petri ısıtın. </li><li> Kaldır tedavi PDMS kaplı ocak SU-8 ana. </li><li> SU-8 master PDMS kalıp soyun. </li><li> Iki bakteri girişler, bir çıkış ve bir pnömatik bağlantı noktası için 20 gauge künt uç iğne kullanarak PDMS kalıp dört delik delin. </li></ol> 3. Çok katmanlı PDMS cihazları Bağlar: Bu cihaz üç katmandan ana kanal, orta pnömatik tabakası, ve bakteriler için kanalları içeren bir alt bakteriyel katman içeren bir üst tabaka ile monte edilir. Üç kat aşağıda açıklandığı şekilde monte edilir. <ol><li> Metanol ile PDMS membranlar ıslak ve temiz bir forseps kullanarak SU-8 ana kalıp dikkatle onları soymak. Bir teflon levha üzerine yerleştirin membran. </li><li> Bir oksijen plazma odası pnömatik membran ve akışkan katman yerleştirin. 40 sn (oksijen basıncı 10 sccm, RF güç 100W) için plazma açın. </li><li> Plazma maruz kaldıktan sonra, 10 dakika içinde alt PDMS kanal membran forseps kullanarak hizalayın. Membran ve PDMS katmanları ekleme metanol katmanları serbest dolaşımına yardımcı olur ve hizalamayı kolaylaştırır. Bu durumda, cihaz, metanol buharlar kaçmasına izin için bir gazlı bez parçası üzerinde yer almaktadır. </li><li> 8 saat 80 ° C'de ocak Cure hizalı PDMS katmanları </li><li> Bağ üst kanal birleştirilmiş kompozit PDMS aygıtına 3.4 - pnömatik membran alt tabakası üzerine yapıştırma sonra, adımları 3.2 tekrarlayın. </li></ol> 4. PDMS cihaz 3,4 birleştirmek <ol><li> Ökaryotik hücre ve bakteri ekim için kullanılan giriş ve çıkış delikleri delikler delin. </li><li> Limanlarına Tygon boru (0,01 inç OD) bağlayın ve 20ml bir şırınga ile çekerek pnömatik katmanı işletmek. </li><li> PDMS model ve bir oksijen plazma odasına önceden temizlenmiş cam slayt yerleştirin. Plazma açın vakum uygulamadan 20 sn (oksijen basıncı 20 sccm, RF güç 300W). </li><li> Adanın duvar cam slayt (PDMS) yapıştırma arasındaki temasını önlemek için, hemen bir şırınga cihaza bağlayın ve şırınga çekerek ve bir yerde tutarak vakum uygulamak. </li><li> Camına PDMS modeli (2 dakika içinde) yavaşça basın. </li><li> Cure PDMS cihazı 80 ° C'de 10 dakika. </li></ol> 5. Fibronektin ile cam yüzey Tedavisi <ol><li> UV altında 15 dakika Tygon boru her bağlantı noktasına bağladıktan sonra cihaz sterilize edin. </li><li> Dolgu ve kanal kanal herhangi bir enkaz kaldırmak için steril PBS akışı. Hava kabarcıklarını çıkarmak için, 10 dakika boyunca akışı uygulayın. Hava kabarcıkları gaz geçirgenliği sayesinde kolayca PDMS kaçabilir. </li><li> Pnömatik kanal kanal içinde hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için içine bir renk boya çözüm doldurun. </li><li> Fibronektin 1 mcg / ml cam ökaryotik hücre tohumlama kolaylaştırmak için, cihazın içine tanıtmak ve 37 en az 40 dakika boyunca inkübe ° C </li><li> 1 ml büyüme medya ile aşırı fibronektin yıkayın. </li></ol> 6. Ortakçı E. Oluşumu ve ölçüm coli biyofilm INadalar <ol><li> OD 600 M9 minimal medya commensal bakterilerin (örneğin, E. coli BW25113/pCM18) sulandırınız ~ 1 kapalı odaları / adalarda komensal biyofilm oluşturan. </li><li> Pozitif sıvı basıncı uygulayarak adanın duvar kapatın. Ev yapımı bir hava-sıvı basıncı dönüştürücü kanalda hava kabarcığı oluşumunu önlemek için kullanılır. </li><li> Komensal E. tanıtın coli valf ile adalar içine kapalı ve bakteriler 32 az 1 saat takmak için izin ° C. </li><li> Unattached bakterilerin yıkayın ve 12 saat 0.25mL/hr seyreltik bakteriyel bir süspansiyon (OD 600 ~ 0.05) serpmek. </li><li> Gevşek bağlı bakteri kaldırmak ve ökaryotik hücre eki için hazırlamak için taze DMEM büyüme medya ile biyofilm durulayın. </li><li> Resim Leica TCS SP5 Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (Bannockburn, IL) ve biyofilm mimarisi IMARIS 5 yazılımı kullanarak görselleştirmek kullanarak biyofilm. </li></ol> 7. Bakteriyel adaları 6-8 çevresinde ökaryotik hücrelerin Seeding <ol><li> 5 x 10 5 hücre / mL ekim yoğunluğu için DMEM medya doku kültürü şişesi ve tekrar süspansiyon HeLa hücrelerinde Trypsinize. </li><li> 2 ml / dk Picoplus şırınga pompası (Harvard Apparattus, MA) kullanarak bir akış hızında cihazın içine HeLa hücrelerinde tanıtın. Adanın duvar böylece bakteriyel biyofilm HeLa hücre bölgeden ayrı düşürdü olduğunu emin olun. Bu adım, tohum tekdüzelik tespit edilebilir ve böylece ışık mikroskobu aşamasında yapılmalıdır. </li><li> % 5 CO 2 inkübatör kanal ve 37 6 saat inkübe ° C hücre süspansiyon hareketi azaltmak için hücre çıkışı sıkıştırın. </li><li> Unattached hücreleri çıkarmak için 0.5 ml / saat besi cihazı serpmek. </li><li> Yenile HeLa ve ortakçı E. DMEM medya coli, her 6 saatte bir. </li></ol> 8. Ada ve ökaryotik hücrelerde maruz patojen bakterilerin Giriş <ol><li> E. hazırlayın coli O157: H7 (EHEC) (moi) 100:1 200:1 (EHEC HeLa hücre başına sayısı) bir enfeksiyon çokluğu HeLa hücreleri enfekte. </li><li> Durulayın ve gevşek bağlı komensal bakteri yıkayın. </li><li> Adaları içine seyreltik EHEC süspansiyon (OD 600 ~ 0.1) tanıtmak. </li><li> 37 ° C akışı olmadan 6 saat süreyle% 5 CO2 inkübatör komensal biyofilm sinyallere maruz kalacağı EHEC izin cihaz inkübe edin. </li><li> 6 saat HeLa hücrelerinde komensal adalar EHEC maruz PDMS duvar kaldırın. </li><li> PBS ile kanal durulayın ve Live / Dead kiti (L3224, Invitrogen, CA) kullanılarak canlı ve ölü hücreleri için leke. </li><li> Zeiss Axiovert 200M floresan mikroskop ve görüntü birden çok yerde, canlı ve ölü hücreleri sayısı tahmin ediyoruz. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar 9 GI yolu enfeksiyonları olaylar dizisi HeLa hücrelerinde bir tek tabaka ve ortakçı E. gelişmekte tarafından taklit edildi coli biyofilm önce komensal biyofilm EHEC HeLa hücreleri enfeksiyona maruz. Mikroakışkan ko-kültür modeli imalatı dahil adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 2A, ko-kültür cihaz 3 boyutlu render gösterir . Co-kültür cihaz ökaryotik hücre kültür odası ve bakteriyel adanın iki bölge farklı bir renk boyalar (bakteriyel ada için ökaryotik bölgeler ve yeşil mor) Şekil 2B gösterilmiştir. Şekil 2C renk boyalar kullanarak bakteriyel kültür bölgeleri çevreleyen ökaryotik bölgeden izole fizibilite gösterilen Şekil 3 epitel hücreleri ve bakteriler ko-kültür temsilcisi sonuçlarını gösterir. Şekil 3A komensal biyofilm (yeşil) ada kolonizasyonu EHEC (kırmızı). Şekil 3B, epitel hücreleri ve ortakçı E. yan yana gösterir bakteriyel adada EHEC coli. EHEC ve GFP ifade komensal bakteriler ifade RFP epitel hücreleri, bakteri ada izole fizibilite gösteren, PDMS duvar indirdi adada lokalizedir. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Hücre ekim düzeni ko-kültür modeli. (1) bir ada PDMS duvar oluşturmak için indirilir, ada haline komensal bakteriler tanıtıldı ve fibronektin adanın etrafında aktı. (2) HeLa hücrelerinde adanın çevresindeki bölgelerde numaralı seribaşı. (3) HeLa hücrelerinde izdiham ulaşmak ve komensal biyofilm geliştirmiştir sonra, EHEC adanın içine tanıtıldı. (4) PDMS duvar kaldırdıEHEC için adanın çevresindeki HeLa hücrelerinde açığa kadar. Vanasının Ankastre detayları gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="Şekil 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="Şekil 2BC" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2BC"> Şekil 2: epitel hücreleri ve bakteriler ko-kültür için mikroakışkan bir model . Epitel hücreleri arasında bakteriyel adalar oluşturulması için pnömatik tahrikli yakalama bölgeleri gösteren ko-kültür cihazın (A) Üç boyutlu çevrimiyle. Her bakteriyel ada (1200 mikron çap ve 1000 mm arayla), büyüme ortamı sağlanması ve adanın atık kaldırarak için ayrı bir giriş ve çıkış vardır. (B) renk boya ile farklı bölgeler (epitel hücre bölgesine, bakteriyel adalar) gösteren ko-kültür cihaz Mikrografik. (C), pnömatik yakalama sistem sadakat, pnömatik-aktif bir kanal (mavi) kullanarak PDMS duvar (sol panel) düşürücü, kapalı ada mor boya tanıtan ve 48 saat için etrafında sarı boya akan gösterilir PDMS duvar (sağ panel) ortaya çıktığında, adanın bölgenin çevresindeki sarı boya maruz kalmaktadır. Ölçek çubuğu 500 mikron temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: Co-HeLa hücre ve bakteri kültürü. (A) RFP ifade EHEC ve GFP ifade E. Floresan görüntü coli BW25113 ada. (B) iletilen Yerleşimi, yeşil ve kırmızı floresan görüntüler cihaz. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil eder.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+integrated+passive+valves+and+pumps+for+flexible+polymer+3-dimensional+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems.</a> Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).</li>
<li>Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatically+controllable+flexible+and+polymeric+microfluidic+valve+fabricated+via+in+situ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromech+Microeng%22%5BJournal%5D)">A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development.</a> J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).</li>
<li>Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+multiplexed+control+of+latching+pneumatic+valves+using+microfluidic+logical+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures.</a> Lab Chip. 6, 623-631 (2006).</li>
<li>Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole+is+an+inter-species+biofilm+signal+mediated+by+SdiA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA.</a> BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+with+tunable+topographies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices with tunable topographies.</a> Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).</li>
<li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li>
<li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-Chip%22%5BJournal%5D)">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li>
</ol>

Patojen eki ve kolonizasyon için Konvansiyonel Testler patojenlerin eklenir içine ökaryotik hücrelerin doku kültürü tabak tek tabaka kullanmaktadır. Bu modeller ökaryotik hücreleri üzerinde geliştirilen bir sofrada yemek yiyen bakteri biyofilm dahil değil gibi fizyolojik ilgili değildir. Basit ek ökaryotik hücrelere ön yetişen bir bakteri kültürü biyofilm zamanla gelişecek yüksek yapılar organize olarak bu konformasyon yol açması olası değildir ve neredeyse imkansız değilse kültür ökaryotik hücreler, bakteri varlığı, so...

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>yüksek çözünürlüklü (16.256 dpi) fotolitografi maskesi</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trikloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridekafluorooktil)silan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td>Programlanabilir spin kaplayıcı</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>Maske hizalayıcı</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen plazma aşındırıcı</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canlı/Ölü Canlılık/Sitotoksisite Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

Çözünür sinyal aracılı etkileşimleri araştırılması için epitel hücreleri ve bakteriler mikroakışkan co-kültür

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

Insan gastrointestinal (Gİ) sistem bağırsak epitel hücreleri ve patojen olmayan (ortakçı) bakteri bir arada olduğu benzersiz bir ortam. Patojen komensal katmanında karşılaştığı mikroçevresinin kolonizasyon ölçüde belirlenmesinde önemli olduğu ileri sürülmektedir. Patojen kolonizasyon araştırmak için geçerli kültür yöntemleri de gastrointestinal sistem mikroçevresinin taklit bir şekilde bakteri ve epitel hücreleri birlikte kültür etkinleştirmek gibi bu hipotezi araştırmak için uygun değildir. Burada ökaryotik hücre ve bakteri bağımsız kültür sağlayan bir mikroakışkan ko-kültür modeli tanımlamak ve patojen kolonizasyon komensal mikroçevresinin etkisi test. Komensal gelişmekte olan ko-kültür modeli göstermiştir.<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Enterohemorajik tanıtımı tarafından takip HeLa hücreleri arasındaki biyofilm<em&gt; E. coli</em&gt; Komensal ada (EHEC), gastrointestinal sistem enfeksiyonu olaylar dizisi taklit eden bir dizi.

Bu protokol, eşzamanlı ve lokalize epitel hücreleri ve bakteri kültürü için bir mikroakışkan ortak kültür modeli açıklamaktadır. Bu model, varsayılan probiyotik bakteri suşlarının etkinliğini patogenezinde farklı çözünür moleküler sinyallerin rolünü araştıran gibi ekran için kullanılabilir.

Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

İnsan gastrointestinal (Gİ) kanalı, bağırsak epitel hücreleri ve patojenik olmayan (kommensal) bakterilerin bir arada bulunduğu benzersiz bir ortamdır. Bu ortam...

Bu protokol, kommensal mikroçevrenin patojen kolonizasyonu üzerindeki etkisini test etmek amacıyla ökaryotik hücrelerin bakterilerle bağımsız olarak kültüre edilmesine olanak tanıyan yeni bir mikroakışkan ko-kültür modelinin kullanımını göstermektedir. Ko-kültür modeli, HeLa hücreleri arasında kommensal e coli biyofilmi geliştirilmesi ve ardından gastrointestinal sistem enfeksiyonundaki olaylar dizisini taklit eden bir sıralama ile kommensal adaya enterohemorajik e coli veya EHEC eklenmesi ile demonstre edilmiştir.EHEC tarafından epitel hücre kolonizasyonunun ortaya çıkan boyutu floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir. Merhaba, Texas A&M Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü'ndeki moleküler sistem biyoteknolojisi laboratuvarındanım. Bugün size, bakteri ve eCard hücrelerinin, insan gastrointestinal sistemindeki organizasyonu taklit eden bir yöntemle bir mikro cihazda birlikte kültüre edilmesi prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda bu prosedürü, patojenik bakterilerin epitel hücre kolonizasyonunun, kolonizasyon öncesinde gastrointestinal sistemde karşılaştıkları sinyallerden nasıl etkilendiğini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Deneylere başlamadan önce, planlanan deneysel kullanıma göre tasarlanmış ve üretilmiş bir silikon master hazırlayın.Örneğin, Stanford Microfluidics Foundry, ardından deneysel replika kalıpların oluşturulabileceği tasarlanmış mastarları imal edecektir. Bu protokolde açıklanan üç katmanlı cihaz için ökariyotik hücre kültürü katmanı ve pnömatik katman için iki membran ile bir bakteriyel kanal için kalıplar gereklidir; bakteriyel, pnömatik ve ökariyotik hücre kültürü katmanlarının kanal yükseklikleri sırasıyla 5, 200 ve 100 micrometers'dır. Replika kalıbı hazırlamadan önce, SU eight mastarını bir vakum kaynağına bağlı desikatörde florosiklin buharına maruz bırakın. PDMS kalıbın mastardan kolayca ayrılmasını sağlamak için vakum odasındaki bir kağıt havluya bir damla fluorolane ekleyin ve bir dakika boyunca vakum uygulayın.Vakumu kaldırın ve florların çökelmesi için 30 dakika bekleyin. Replica kalıplar oluşturmak amacıyla SU-8 master'ı gelecekte kullanmak üzere bir Petri kabında saklayın. PDMS prepolimer ve çapraz bağlayıcıyı 10'a 1 ağırlık oranında hazırlayıp iyice karıştırın; karışımı bir vakum odasında bir saat boyunca degaze edin.Hava kabarcıklarını gidermek için SU eight master'ı bir Petri kabına yerleştirin ve master üzerine, bir katman için beş gram PDMS ve bakteri katmanı için 30 gram PDMS kullanarak dikkatlice dökün. Hava kabarcıklarını temizlemek için PDMS'i tekrar 10 dakika boyunca vakumlayın. Ardından, PDMS'in eşit bir membran şeklinde yayılması için kalıbı bir dakika boyunca döndürün.Bu protokolde, ökaryotik hücre kültürü membranı 150 mikrometre kalınlık için 1200 RPM'de, pnömatik membran ise 250 mikrometre kalınlık için 800 RPM'de döndürülür. Döndürme işleminden sonra, döndürülmüş PDMS ve SU eight ana kalıbını içeren Petri kabını, 80 °C'deki ısıtıcı tabla üzerinde bir saat boyunca ısıtmadan önce 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. PDMS'yi kürledikten sonra, PDMS'yi metanol ile ıslatın ve temiz pensler kullanarak SU eight ana kalıplardan dikkatlice ayırın.Bakteriyel tabakayı bir stereoskop altına yerleştirin ve 20 gauge küt uçlu bir iğne kullanarak üç delik; iki bakteri giriş deliği ve bir çıkış deliği açın. Üç katmanlı cihaz şu sırayla monte edilir: pnömatik tabakanın bakteriyel tabakaya bağlanması, ardından ökaryotik hücre kültürü tabakasının bakteriyel ve pnömatik tabakaların üzerine bağlanması.Pnömatik membranı ve bakteri tabakasını bir lam üzerine yerleştirin ve 10 standard cubic centimeters per minute veya SCCM oksijen basıncı ile 100 watt radyo frekans veya RF gücünde, bir oksijen plazma odasında 40 saniye boyunca plazmaya maruz bırakın. Membranlara metanol eklemek, tabakaların serbest hareketini kolaylaştırır ve hizalamayı basitleştirir. Oksijen plazma maruziyetinden sonraki 10 dakika içinde, bakteri tabakasını pens ve stereoskop kullanarak bir Petri kabına yerleştirin.Orta pnömatik membranı, bakteriler için belirlenen giriş ve çıkış deliklerini baz alarak bakteri tabakasıyla hizalayın. Hizalama işleminden sonra, hizalanmış PDMS yapının bulunduğu Petri kabını yapışmayı sağlamak amacıyla 80 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerinde sekiz saat bekletin. Bu işlem tamamlandığında, pnömatik kanalı kontrol etmek için pnömatik tabakaya bir delik açın.Ardından, ökaryotik hücre kültürü kanalını birleştirilmiş kompozit PDMS cihaza bağlamak için montajdan hizalamaya kadar olan adımları tekrarlayın. Ökaryotik hücre ekimi için kullanılan giriş ve çıkış portlarına delikler açın. Portlara tigon tüpler bağlayın ve 20 milliliter şırınga ile çekerek pnömatik katmanı çalıştırın.Kompozit PDMS yapıyı ve önceden temizlenmiş bir lamı oksijen plazma odasına yerleştirin. Vakum uygulamadan plazmayı 20 saniye boyunca çalıştırın. Kompozit PDMS yapıyı oksijen plazma odasından çıkarın ve buna 20 mililitrelik bir şırınga bağlayın.Valfler ile cam arasındaki teması önlemek için vakum oluşturacak şekilde hemen çekin. Bir dakika içinde kaydırın. Plazma maruziyetinden sonra, kompozit PDMS yapıyı camın üzerine nazikçe bastırın.PDMS cihazını bir ısıtıcı tabla üzerinde 80 °C'de 10 dakika boyunca kürleyin. Bunun ardından, her porta tigon tüpler bağlayın ve cihazı UV altında 15 dakika boyunca sterilize edin. Sonra, 1 mL'lik bir şırıngaya 500 µL steril PBS doldurun ve tüm kalıntıları temizlemek için kanala enjekte edin.Hava kabarcığı gözlemlenirse, çıkış tüpünü bir einor mikro santrifüj tüpü ile sıkıştırın ve kabarcığı gaz geçirgen PDMS katmanları üzerinden dışarı itmek için hafif basınç uygulayın. Kanalda hava kabarcığı oluşumunu önlemek için pnömatik kanalı steril su ile doldurun.Pnömatik kanalda hava kabarcığı oluşumunu önlemek için el yapımı bir hava-sıvı basınç dönüştürücü kullanılır. Cam yüzeye ökaryotik hücre ekimine hazırlanmak için, ökaryotik hücre kültürü girişinden hücre kültürü bölgesine 500 µL fibronectin iletin. Bir şırınga kullanarak valfi kapalı tutun ve 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin.Son olarak, şırınga pompasını kullanarak fazla fibronectin'i bir mililitre büyüme medyumu ile yıkayın. Cihaz artık kommensal bir biyofilm oluşturma deneyi için kullanıma hazırdır; bakterileri M nine minimal medyumu içinde OD 600 değeri yaklaşık bir olacak şekilde seyreltin. Bu örnekte e coli'nin bir laboratuvar suşunu kullandık, ancak herhangi bir patojenik olmayan bakteri suşu kullanılabilir.Pozitif sıvı basıncı uygulayarak bakteriyel ve ökaryotik hücre kültürü bölgelerini ayıran valfi kapatın. Bir şırınga pompası kullanarak adacıklara yaklaşık 1,0 OD 600 değerinde 0,2 mililitre E. coli aktarın ve bakterilerin 32 °C'de bir saat boyunca tutunmasını sağlayın. İnkübasyondan sonra.OD 600 değeri yaklaşık 0,05 olan seyreltilmiş bir bakteri süspansiyonunu ve taze M nine minimal besiyerini 12 saat boyunca saatte 0,25 mL hızla perfüze edin. Gevşek şekilde tutunmuş bakterileri uzaklaştırmak ve ökaryotik hücre tutunmasına hazırlık yapmak için, şırınga pompası kullanarak biyofilmi saatte 0,5 mL hızla 0,5 mL taze serumsuz ve antibiyotiksiz DMEM besiyeri ile yıkayın ve biyofili görüntüleyin. Leica T-C-S-S-P five konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın ve MS yazılımı aracılığıyla biyofilm mimarisini görselleştirin.Bir doku kültürü flaskındaki HeLa hücrelerini tripsinize edin ve resüspend edin. Hücreleri, mililitre başına 5 × 10⁵ hücre ekim yoğunluğunda, toplam 0,1 mL hacme ulaşacak şekilde DMEM ortamında süspande edin. HeLa hücrelerini, bir Pico-Plus şırınga pompası kullanarak dakika başına 2 mL akış hızında cihazın ökaryotik bölgesine aktarın.Ardından, bir ışık mikroskobu kullanarak, kommensal bakteri bölgesini ökaryotik hücre bölgesinden ayıran valfin, bakteri biyofilminin hücre bölgesinden ayrı kalmasını sağlayacak şekilde tamamen kapalı olduğundan emin olun. Kanal içindeki hücre süspansiyonunun hareketini azaltmak için bir einor mikro santrifüj tüpü kullanarak hücre çıkışını sıkıştırın ve %5 karbondioksitli bir inkübatörde 37 °C'de altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir şırınga pompası kullanarak cihazı 0,5 mL/saat hızında 50 µL DMEM büyüme ortamı ile perfüze edin.Yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için, HeLa ve kommensal E. coli bölgelerindeki DMEM besiyerini her altı saatte bir yenileyin. HeLa hücrelerini 100 ila 200 EHEC hücresi başına bir HeLa hücresi enfeksiyon çokluğu (MOI) ile enfekte etmek için E. coli O157:H7 veya EHEC'i M9 besiyerinde hazırlayın; gevşekçe yapışmış kommensal bakterileri önceki bölümde açıklandığı gibi yıkayarak uzaklaştırın. Bir şırınga pompası aracılığıyla, saatte 0,25 mL akış hızında, OD 600 değeri yaklaşık 0,1 olan 100 µL seyreltilmiş EHEC süspansiyonunu adalara aktarın.Bunu takiben, EHEC'in kommensal biyofilmin içinde bulunan sinyallere maruz kalmasını sağlamak için cihazı 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde akış olmadan altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, vakum oluşturmak için bir vakum pompası kullanarak kommensal bakteriyel ve ökaryotik hücre bölgelerini ayıran valfi açın ve valfi altı saat boyunca açık tutun. Bu işlem, kommensal bakteriyel biyofilmdeki HEC'lerin heela hücrelerine maruz kalmasını sağlayacaktır; bunu takiben, 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde altı saat daha inkübe edin.Üretici talimatlarına göre hazırlanan cihaza canlı-ölü boyasını ekleyin. Helo hücre canlılığını boyamak için, helo hücre ölümünü tahmin etmeye yönelik bir kontrol olarak, 1 mililitrelik bir şırınga kullanarak cihazın ökaryotik bölgesine 0,1 mililitre bekleme çözeltisi enjekte edin. EHEC yokluğunda, önceki üç adımı tekrarlayın ve cihaza steril, serumsuz ve antibiyotiksiz DMEM medyası ekleyin.EHEC yerine, Zeiss AIOt 200 M floresan mikroskobu ile birden fazla bölgenin görüntüsünü alın ve en az yedi farklı konumdan elde edilen görüntülerdeki yeşil hücreleri sayarak, kırmızı renkli ölü epitel hücreleri arasındaki canlı yeşil epitel hücrelerinin sayısını tahmin edin. Şimdi, deneme katmanı mikroakışkan cihazının bazı temsili görüntülerini göstereceğiz. Bu görüntüde, farklı kültür bölgelerini temsil etmek için inert gıda boyası kullanıyoruz.Mor boya ökaryotik hücre kültürü bölgesini, yeşil boya ise kommensal bakteriyel biyofilmi temsil etmektedir. Bu görüntüde, bakteriyel bölgedeki mor boyanın çevredeki sarı boyadan farklı olması sayesinde, ökaryotik ve bakteriyel bölgelerin birbirinden ayrı tutulabildiğinin fizibilitesini göstermekteyiz. Yeşil protein eksprese eden kommensal bakteriyel biyofilmin, kırmızı protein eksprese eden patojenik bakteriler tarafından kolonize edilmesi burada gösterilmiştir.Bu görüntüde gösterildiği gibi, EHEC ve kommensal bakteriler, bakteriyel biyofilmi çevreleyen HeLa hücrelerinden farklıdır. Bakterilerin ve epitel hücrelerin ko-kültürü için kuru tabaka mikro cihazın nasıl kurulacağını ve genellikle bu sinyallerin patojen kolonizasyonu üzerindeki etkisinin nasıl araştırıldığını göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, cihazdaki tüm hava kabarcıklarının giderilmesinin ve bu patojenin uygun çoklu hücre enfeksiyonu oranında kullanılmasının önemli olduğunu unutmayın.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneyinizde başarılar dileriz.

microfluidic-co-culture-epithelial-cells-bacteria-for-investigating

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

Biz, insan bağırsak-on-a-chip microphysiological sistemi kullanılarak uzun bir süre için bir in vitro protokole ko-kültür bağırsak mikrobiyomları ve bağırsak villi açıklar.

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Biz X x-ray ışınlanmış Caco-2 ve periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) arasındaki çapraz karışma araştırmak için bir protokol mevcut. Protokol Caco-2 ışınlama ve set-up ortak kültür PBMC ile başlar; daha sonra trans-epitel elektriksel direnç düzenli olarak 48 s ve western blot Caco-2 ve PBMC gerçekleştirilen üzerinden ölçülür.

X-ışını arasında çapraz karışma araştırmak için bir ortak kültür yöntemi Caco-2 hücreleri ve PBMC radyasyona maruz

Bu rapor, birden fazla hücrenin yüksek verimli eşleştirme ve mikroskobik analizinin sağlanabileceği tek bir hücre kültürü deneyi kurmak için mikroakışkan çip tabanlı bir yöntem tanımlanmaktadır.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

Bu çalışmada, tanımlanmış akış koşullarında kesme stresi altında farklılaştırılmış insan primer endotel hücrelerinin yüzeyinde üretilen pnömokok komponent dizelerine bağlıpnozyağının mikroskobik takibi açıklanmaktadır. Bu protokol, diferansiyel immünboyama prosedürleri uygulanarak belirli hücre yapılarının ayrıntılı görselleştirilmesi ve bakterilerin sayısallaştırılması için genişletilebilir.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Sunulan protokol, mikroakışkan dinamik kültür kanallarında ve geleneksel sabit kuyu statik kültür odalarında yapışkan hücre tabakası yapısını görselleştirmek için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile falloidin bazlı filamentöz-aktin boyama tekniğinin geliştirilmesini ve kullanımını açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre katmanı akıcılığını, tek katmanlı oluşumu ve katman kalınlığı homojenliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

Fizyolojik Boyutta Bir Mikroakışkan Kültür Cihazında Epitel Hücre Tek Katmanlarının Hazırlanması ve Yapısal Değerlendirilmesi

Bu makale, 3D Flipwell mühendisliğine ve kullanımına rehberlik edecek temel adımları içeren ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Ko-kültür ek yığınlarının nasıl bir araya getirileceğini ve bağırsak mukozal ortamını modellemek için bağırsak bakterileri, bağırsak epiteli ve makrofajların tabakalı katmanlarını birlikte kültürlemek için nasıl kullanılacağını açıklıyor ve gösteriyoruz.

Bakteriyel, Bağırsak ve Bağışıklık Hücrelerinde Toksikolojik ve İmmünomodülatör Tedaviler için Asenkron Sistemler Geliştirmeye Yönelik 3D Flipwell Mühendisliği

Çalışma, doku kök hücresinden türetilen bağırsak organoidleri kullanılarak bakteriyel enfeksiyonun in vitro incelenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, organoidlerin iki boyutta nasıl kültürleneceğini ve farklılaştırılacağını, onları yapışkan-invaziv Escherichia coli ile enfekte edeceğini ve epitel bariyer sızıntısı, enfeksiyon görüntüleme ve epitel RNA yanıtı gibi önemli okumaları nasıl değerlendireceğini açıklar.

Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü

Öğrenin, mikroakışkan ortak kültür modeliyle epitel hücreleri ve bakteriler arasındaki çözünür sinyal etkileşimlerini inceleyin. Bu yöntem, patojen kolonizasyonu ve probiyotik etkileri çalışmak için gastrointestinal koşulları taklit eder.

Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

Daha fazla video keşfet