Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

Bu protokol, kommensal mikroçevrenin patojen kolonizasyonu üzerindeki etkisini test etmek amacıyla ökaryotik hücrelerin bakterilerle bağımsız olarak kültüre edilmesine olanak tanıyan yeni bir mikroakışkan ko-kültür modelinin kullanımını göstermektedir. Ko-kültür modeli, HeLa hücreleri arasında kommensal e coli biyofilmi geliştirilmesi ve ardından gastrointestinal sistem enfeksiyonundaki olaylar dizisini taklit eden bir sıralama ile kommensal adaya enterohemorajik e coli veya EHEC eklenmesi ile demonstre edilmiştir.

EHEC tarafından epitel hücre kolonizasyonunun ortaya çıkan boyutu floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir. Merhaba, Texas A&M Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü'ndeki moleküler sistem biyoteknolojisi laboratuvarındanım. Bugün size, bakteri ve eCard hücrelerinin, insan gastrointestinal sistemindeki organizasyonu taklit eden bir yöntemle bir mikro cihazda birlikte kültüre edilmesi prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda bu prosedürü, patojenik bakterilerin epitel hücre kolonizasyonunun, kolonizasyon öncesinde gastrointestinal sistemde karşılaştıkları sinyallerden nasıl etkilendiğini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Deneylere başlamadan önce, planlanan deneysel kullanıma göre tasarlanmış ve üretilmiş bir silikon master hazırlayın.

Örneğin, Stanford Microfluidics Foundry, ardından deneysel replika kalıpların oluşturulabileceği tasarlanmış mastarları imal edecektir. Bu protokolde açıklanan üç katmanlı cihaz için ökariyotik hücre kültürü katmanı ve pnömatik katman için iki membran ile bir bakteriyel kanal için kalıplar gereklidir; bakteriyel, pnömatik ve ökariyotik hücre kültürü katmanlarının kanal yükseklikleri sırasıyla 5, 200 ve 100 micrometers'dır. Replika kalıbı hazırlamadan önce, SU eight mastarını bir vakum kaynağına bağlı desikatörde florosiklin buharına maruz bırakın. PDMS kalıbın mastardan kolayca ayrılmasını sağlamak için vakum odasındaki bir kağıt havluya bir damla fluorolane ekleyin ve bir dakika boyunca vakum uygulayın.

Vakumu kaldırın ve florların çökelmesi için 30 dakika bekleyin. Replica kalıplar oluşturmak amacıyla SU-8 master'ı gelecekte kullanmak üzere bir Petri kabında saklayın. PDMS prepolimer ve çapraz bağlayıcıyı 10'a 1 ağırlık oranında hazırlayıp iyice karıştırın; karışımı bir vakum odasında bir saat boyunca degaze edin.

Hava kabarcıklarını gidermek için SU eight master'ı bir Petri kabına yerleştirin ve master üzerine, bir katman için beş gram PDMS ve bakteri katmanı için 30 gram PDMS kullanarak dikkatlice dökün. Hava kabarcıklarını temizlemek için PDMS'i tekrar 10 dakika boyunca vakumlayın. Ardından, PDMS'in eşit bir membran şeklinde yayılması için kalıbı bir dakika boyunca döndürün.

Bu protokolde, ökaryotik hücre kültürü membranı 150 mikrometre kalınlık için 1200 RPM'de, pnömatik membran ise 250 mikrometre kalınlık için 800 RPM'de döndürülür. Döndürme işleminden sonra, döndürülmüş PDMS ve SU eight ana kalıbını içeren Petri kabını, 80 °C'deki ısıtıcı tabla üzerinde bir saat boyunca ısıtmadan önce 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. PDMS'yi kürledikten sonra, PDMS'yi metanol ile ıslatın ve temiz pensler kullanarak SU eight ana kalıplardan dikkatlice ayırın.

Bakteriyel tabakayı bir stereoskop altına yerleştirin ve 20 gauge küt uçlu bir iğne kullanarak üç delik; iki bakteri giriş deliği ve bir çıkış deliği açın. Üç katmanlı cihaz şu sırayla monte edilir: pnömatik tabakanın bakteriyel tabakaya bağlanması, ardından ökaryotik hücre kültürü tabakasının bakteriyel ve pnömatik tabakaların üzerine bağlanması.

Pnömatik membranı ve bakteri tabakasını bir lam üzerine yerleştirin ve 10 standard cubic centimeters per minute veya SCCM oksijen basıncı ile 100 watt radyo frekans veya RF gücünde, bir oksijen plazma odasında 40 saniye boyunca plazmaya maruz bırakın. Membranlara metanol eklemek, tabakaların serbest hareketini kolaylaştırır ve hizalamayı basitleştirir. Oksijen plazma maruziyetinden sonraki 10 dakika içinde, bakteri tabakasını pens ve stereoskop kullanarak bir Petri kabına yerleştirin.

Orta pnömatik membranı, bakteriler için belirlenen giriş ve çıkış deliklerini baz alarak bakteri tabakasıyla hizalayın. Hizalama işleminden sonra, hizalanmış PDMS yapının bulunduğu Petri kabını yapışmayı sağlamak amacıyla 80 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerinde sekiz saat bekletin. Bu işlem tamamlandığında, pnömatik kanalı kontrol etmek için pnömatik tabakaya bir delik açın.

Ardından, ökaryotik hücre kültürü kanalını birleştirilmiş kompozit PDMS cihaza bağlamak için montajdan hizalamaya kadar olan adımları tekrarlayın. Ökaryotik hücre ekimi için kullanılan giriş ve çıkış portlarına delikler açın. Portlara tigon tüpler bağlayın ve 20 milliliter şırınga ile çekerek pnömatik katmanı çalıştırın.

Kompozit PDMS yapıyı ve önceden temizlenmiş bir lamı oksijen plazma odasına yerleştirin. Vakum uygulamadan plazmayı 20 saniye boyunca çalıştırın. Kompozit PDMS yapıyı oksijen plazma odasından çıkarın ve buna 20 mililitrelik bir şırınga bağlayın.

Valfler ile cam arasındaki teması önlemek için vakum oluşturacak şekilde hemen çekin. Bir dakika içinde kaydırın. Plazma maruziyetinden sonra, kompozit PDMS yapıyı camın üzerine nazikçe bastırın.

PDMS cihazını bir ısıtıcı tabla üzerinde 80 °C'de 10 dakika boyunca kürleyin. Bunun ardından, her porta tigon tüpler bağlayın ve cihazı UV altında 15 dakika boyunca sterilize edin. Sonra, 1 mL'lik bir şırıngaya 500 µL steril PBS doldurun ve tüm kalıntıları temizlemek için kanala enjekte edin.

Hava kabarcığı gözlemlenirse, çıkış tüpünü bir einor mikro santrifüj tüpü ile sıkıştırın ve kabarcığı gaz geçirgen PDMS katmanları üzerinden dışarı itmek için hafif basınç uygulayın. Kanalda hava kabarcığı oluşumunu önlemek için pnömatik kanalı steril su ile doldurun.

Pnömatik kanalda hava kabarcığı oluşumunu önlemek için el yapımı bir hava-sıvı basınç dönüştürücü kullanılır. Cam yüzeye ökaryotik hücre ekimine hazırlanmak için, ökaryotik hücre kültürü girişinden hücre kültürü bölgesine 500 µL fibronectin iletin. Bir şırınga kullanarak valfi kapalı tutun ve 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin.

Son olarak, şırınga pompasını kullanarak fazla fibronectin'i bir mililitre büyüme medyumu ile yıkayın. Cihaz artık kommensal bir biyofilm oluşturma deneyi için kullanıma hazırdır; bakterileri M nine minimal medyumu içinde OD 600 değeri yaklaşık bir olacak şekilde seyreltin. Bu örnekte e coli'nin bir laboratuvar suşunu kullandık, ancak herhangi bir patojenik olmayan bakteri suşu kullanılabilir.

Pozitif sıvı basıncı uygulayarak bakteriyel ve ökaryotik hücre kültürü bölgelerini ayıran valfi kapatın. Bir şırınga pompası kullanarak adacıklara yaklaşık 1,0 OD 600 değerinde 0,2 mililitre E. coli aktarın ve bakterilerin 32 °C'de bir saat boyunca tutunmasını sağlayın. İnkübasyondan sonra.

OD 600 değeri yaklaşık 0,05 olan seyreltilmiş bir bakteri süspansiyonunu ve taze M nine minimal besiyerini 12 saat boyunca saatte 0,25 mL hızla perfüze edin. Gevşek şekilde tutunmuş bakterileri uzaklaştırmak ve ökaryotik hücre tutunmasına hazırlık yapmak için, şırınga pompası kullanarak biyofilmi saatte 0,5 mL hızla 0,5 mL taze serumsuz ve antibiyotiksiz DMEM besiyeri ile yıkayın ve biyofili görüntüleyin. Leica T-C-S-S-P five konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın ve MS yazılımı aracılığıyla biyofilm mimarisini görselleştirin.

Bir doku kültürü flaskındaki HeLa hücrelerini tripsinize edin ve resüspend edin. Hücreleri, mililitre başına 5 × 10⁵ hücre ekim yoğunluğunda, toplam 0,1 mL hacme ulaşacak şekilde DMEM ortamında süspande edin. HeLa hücrelerini, bir Pico-Plus şırınga pompası kullanarak dakika başına 2 mL akış hızında cihazın ökaryotik bölgesine aktarın.

Ardından, bir ışık mikroskobu kullanarak, kommensal bakteri bölgesini ökaryotik hücre bölgesinden ayıran valfin, bakteri biyofilminin hücre bölgesinden ayrı kalmasını sağlayacak şekilde tamamen kapalı olduğundan emin olun. Kanal içindeki hücre süspansiyonunun hareketini azaltmak için bir einor mikro santrifüj tüpü kullanarak hücre çıkışını sıkıştırın ve %5 karbondioksitli bir inkübatörde 37 °C'de altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir şırınga pompası kullanarak cihazı 0,5 mL/saat hızında 50 µL DMEM büyüme ortamı ile perfüze edin.

Yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için, HeLa ve kommensal E. coli bölgelerindeki DMEM besiyerini her altı saatte bir yenileyin. HeLa hücrelerini 100 ila 200 EHEC hücresi başına bir HeLa hücresi enfeksiyon çokluğu (MOI) ile enfekte etmek için E. coli O157:H7 veya EHEC'i M9 besiyerinde hazırlayın; gevşekçe yapışmış kommensal bakterileri önceki bölümde açıklandığı gibi yıkayarak uzaklaştırın. Bir şırınga pompası aracılığıyla, saatte 0,25 mL akış hızında, OD 600 değeri yaklaşık 0,1 olan 100 µL seyreltilmiş EHEC süspansiyonunu adalara aktarın.

Bunu takiben, EHEC'in kommensal biyofilmin içinde bulunan sinyallere maruz kalmasını sağlamak için cihazı 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde akış olmadan altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, vakum oluşturmak için bir vakum pompası kullanarak kommensal bakteriyel ve ökaryotik hücre bölgelerini ayıran valfi açın ve valfi altı saat boyunca açık tutun. Bu işlem, kommensal bakteriyel biyofilmdeki HEC'lerin heela hücrelerine maruz kalmasını sağlayacaktır; bunu takiben, 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde altı saat daha inkübe edin.

Üretici talimatlarına göre hazırlanan cihaza canlı-ölü boyasını ekleyin. Helo hücre canlılığını boyamak için, helo hücre ölümünü tahmin etmeye yönelik bir kontrol olarak, 1 mililitrelik bir şırınga kullanarak cihazın ökaryotik bölgesine 0,1 mililitre bekleme çözeltisi enjekte edin. EHEC yokluğunda, önceki üç adımı tekrarlayın ve cihaza steril, serumsuz ve antibiyotiksiz DMEM medyası ekleyin.

EHEC yerine, Zeiss AIOt 200 M floresan mikroskobu ile birden fazla bölgenin görüntüsünü alın ve en az yedi farklı konumdan elde edilen görüntülerdeki yeşil hücreleri sayarak, kırmızı renkli ölü epitel hücreleri arasındaki canlı yeşil epitel hücrelerinin sayısını tahmin edin. Şimdi, deneme katmanı mikroakışkan cihazının bazı temsili görüntülerini göstereceğiz. Bu görüntüde, farklı kültür bölgelerini temsil etmek için inert gıda boyası kullanıyoruz.

Mor boya ökaryotik hücre kültürü bölgesini, yeşil boya ise kommensal bakteriyel biyofilmi temsil etmektedir. Bu görüntüde, bakteriyel bölgedeki mor boyanın çevredeki sarı boyadan farklı olması sayesinde, ökaryotik ve bakteriyel bölgelerin birbirinden ayrı tutulabildiğinin fizibilitesini göstermekteyiz. Yeşil protein eksprese eden kommensal bakteriyel biyofilmin, kırmızı protein eksprese eden patojenik bakteriler tarafından kolonize edilmesi burada gösterilmiştir.

Bu görüntüde gösterildiği gibi, EHEC ve kommensal bakteriler, bakteriyel biyofilmi çevreleyen HeLa hücrelerinden farklıdır. Bakterilerin ve epitel hücrelerin ko-kültürü için kuru tabaka mikro cihazın nasıl kurulacağını ve genellikle bu sinyallerin patojen kolonizasyonu üzerindeki etkisinin nasıl araştırıldığını göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, cihazdaki tüm hava kabarcıklarının giderilmesinin ve bu patojenin uygun çoklu hücre enfeksiyonu oranında kullanılmasının önemli olduğunu unutmayın.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneyinizde başarılar dileriz.