Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

E Coli RP 4 37, tanımlanmış uzamsal konsantrasyon gradyanlarına maruz kaldıkları bir kemotaksi cihazına aktarılır. Hazneye giren hücreler, konsantrasyon gradyanının orta noktasıyla karşılaşırlar. Sinyalin bir çekici veya itici olarak algılanmasına bağlı olarak, bakteriler konsantrasyon gradyanı boyunca hızla yukarı veya aşağı doğru hareket ederler.

Merhaba, ben Texas A&M Üniversitesi Moleküler Sistemler Biyoteknolojisi Laboratuvarı ve Kimya Mühendisliği Bölümü'nden Derek Engler. Bugün size, mikroakışkan bir cihazda bakteriyel kemotaksiye yönelik bir inceleme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarlarımızda, E. coli RP 4 37'nin nikel sülfat konsantrasyon gradyanında nasıl göç ettiğini çalışmak için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Akışkan katmanı ve kontrol katmanı, SU-8 kalıptan Polimetilsiloksan veya PDMS'nin replika kalıplama yöntemiyle üretilir. Bu prosedüre başlamak için, PDMS ön polimerini ve çapraz bağlayıcıyı 10'a 1 ağırlık oranında karıştırın.

Hava kabarcıkları giderilene kadar karışımı bir vakumlu desikatörde bir saat boyunca gazdan arındırın. PDMS karışımı hazır olduğunda, SU eight kalıbı bir Petri kabına yerleştirin ve karışımı istenen kalınlığa ulaşacak şekilde SU eight kalıbının üzerine dikkatlice dökün. PDMS'nin kürlenmesi için PDMS ve SU eight kalıbını içeren Petri kabını 80 °C'de iki saat boyunca ısıtın.

İki saat sonra, kürlenmiş PDMS kaplı SU-8 master'ı ısıtıcı plakadan çıkarın ve PDMS kalıbını SU-8 master'dan soyun. İstenen yapı PDMS kalıbın içinde gömülü olacaktır; 20 gauge küt uçlu bir iğne kullanarak gradyan jeneratörü, hücre girişi ve hücre çıkışı için boruların takılacağı dört deliği PDMS kalıba açın. Artık PDMS cihazını bağlamak için cihazı monte etmeye hazırız.

Öncelikle, cam bir mikroskop lamını izopropanol ile temizleyin ve bir Airstream ile kurutun. Ardından, PDMS kalıbı ve cam lamı bir plazma aşındırıcıda yaklaşık 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. PDMS kalıbı cam lam ile temas ettirin. Temas eden lam ve PDMS kalıbı bir ısıtıcı tabla üzerinde 65 °C'de 15 dakika boyunca ısıtın.

PDMS cihazını monte etmek için, mikroskop kurulumuna bağlı olarak gereken uygun uzunlukta tüpü, bir jilet yardımıyla 45 derecelik açıyla kesin. Ardından bir pens kullanarak tüpün bir ucunu, cihazda açılmış olan dört delikten birine yerleştirin.

Tüplerin diğer ucuna küt uçlu 30 gauge iğne göbeği yerleştirin. Tüp ve iğne göbeği yerleştirme işlemini geri kalan tüm delikler için tekrarlayın. Üç mililitrelik bir şırıngaya bir mililitre kemotaksis tamponu veya CB doldurun.

Şırıngadaki havayı çıkarmaya özen gösterin. Bir pipet kullanarak çıkış iğne göbeğine CB ekleyin ve hava kabarcıklarını gidermek için iğne göbeğine hafifçe vurun. Üç mililitrelik şırınganın ucundan az miktarda CB dışarı itin ve şırıngayı, hava hapsetmeden iğne göbeğine bağlayın.

Kalan tüm iğne göbekleri CB ile dolana kadar CB'yi cihazdan geçirin. Bu işlem, hava kabarcıklarının çoğunu gidermelidir. Ardından, iki adet 500 µL'lik şırıngayı, test edilen kemo efektörün uygun konsantrasyonlarını içeren CB ile doldurun.

Yüksek hareketliliğe sahip bakterileri hazırlamak için, şırınganın içeriğinden küçük bir damlayı dışarı itip iğne göbeğindeki sıvı damlalarına temas ettirerek hava kabarcığı oluşumunu önleyin ve ardından şırıngayı takın. Kemotaksis deneyi için, GFP ekspresyon plazmidi içeren e coli RP 4 37'nin gece boyu kültürünü, tripton broth veya TB içinde, 32 °C'de çalkalayarak büyütün. Gece boyu büyütülen bu kültürü, 250 mL'lik bir erlenmeyer flask içindeki 20 mL'lik TB kültürünü 600 nm'de yaklaşık 0,05 optik densiteye ulaşacak şekilde inoküle etmek için kullanın.

Hücreler yaklaşık 0,35 ila 0,45 OD 600 değerine ulaştığında, kültürü 32 degrees Celsius'ta çalkalamalı olarak büyütün. Düşük hızlı santrifüjasyon ile hücreleri hasat edin ve kanalın ortasında beklenilen konsantrasyondaki kemo efektörü içeren CB içerisinde, yaklaşık 0,35 OD 600 olacak şekilde yeniden süspanse edin. Son olarak, GFP eksprese eden canlı hücrelere yaklaşık 0,35 OD 600 değerinde RFP işaretli ölü hücreler ekleyin.

Bu ölü hücreler, herhangi bir migrasyonun akış etkilerinden kaynaklanmadığından emin olmak için dahili bir kontrol görevi görecektir. Hücre süspansiyonu artık kemotaksi deneyi için mikroakışkan cihaza yüklenmeye hazırdır. Kemotaksi deneyine başlamak için, hücre giriş iğnesi göbeğindeki CB'nin bir kısmını boşaltın ve hücre süspansiyonu ile doldurun.

50 µL'lik bir şırıngayı resüspande edilen hücrelerle dikkatlice doldurun. Flagellalar kopabileceği ve bu da motiliteyi azaltacağı için bu işlemi yavaşça yapın. Şırınga içeriğinden küçük bir damla dışarı itip damlayı iğne göbeğindeki sıvıya değdirerek ve şırıngayı takarak, 50 µL'lik şırıngayı daha önce gösterildiği gibi giriş iğne göbeğine bağlayın; cihazı, görüntüleme için yüksek hızlı bir kamerayla donatılmış bir floresan mikroskobun tablasına yerleştirin.

Her iki giriş şırıngasını şırınga pompasına yerleştirin ve gradyan oluşacak ve hücreler tüpler boyunca akacak şekilde akışı başlatın. Hücreler kemotaksi odasına girdikten sonra, sistemin stabilize olması için yaklaşık 20 dakika bekleyin. Görüntüleme yapmadan önce, odanın uzunluğu boyunca farklı konumlardan canlı yeşil ve ölü kırmızı floresan görüntülerini toplayın.

Genellikle her konumda üç saniyelik aralıklarla 100 görüntü toplarız. Elde edilen floresan görüntüler, Image J veya metamorph gibi ticari olarak mevcut herhangi bir görüntü analiz programı veya matlab ile yazılmış basit kodlar kullanılarak analiz edilebilir. Bu örnekte, MATLAB kodlarını kullanacağız.

Belirlenen eşik piksel yoğunluğu üzerinden görüntüdeki arka plan piksellerini kaldırarak ve eşik değerinden düşük yoğunluğa sahip tüm pikselleri temizleyerek başlayın. Bu işlem gürültüyü minimize eder. Analizde, görüntünün merkezini belirlemek için ölü hücrelerin konumunu kullanın.

Bu, hücrelerin kemotaksi odasına girdiği ve herhangi bir göç gerçekleşmemesi durumunda tespit edilecekleri konumu temsil eder. Ardından, görüntüdeki canlı hücreleri bulun, görüntüyü kanallara ayırın ve her kanaldaki canlı hücre sayısını belirleyin. Önceki çalışmamızda, 10 50 µm genişliğindeki kemotaksi odası, her biri yaklaşık 16 µm genişliğinde olan 64 kanala ayrılmıştır.

Bu adımlar tüm görüntüler için tekrarlandıktan sonra, tüm görüntüler genelinde her kanal için toplam hücre sayılarını toplayın. Bu işlem, deney süresi boyunca her kanalda tespit edilen toplam hücre sayısını verir. Göç yönünü temsil eden kemotaktik partisyon katsayısını veya CPC'yi hesaplayın.

Aşağıdaki adımları uygulayarak, ölü hücrelerin yüksek konsantrasyonlu (sağ) veya düşük konsantrasyonlu (sol) taraflarında bulunan her bir hücreye sırasıyla artı bir ve eksi bir çarpanı atayın. Çarpılan tüm değerleri toplayın ve toplam tespit edilen hücre sayısına göre normalize edin. Hücrelerin göçünü kat edilen mesafeye göre ağırlıklandıran kemotaksi, migrasyon katsayısı veya CMC'yi hesaplayın.

Kanal 64'teki en uzak yüksek konsantrasyon konumuna hareket eden bir hücreye artı bir ağırlık faktörü verilirken, yüksek konsantrasyon tarafına yarı yolda hareket eden bir hücreye artı 0.5 ağırlık faktörü verilir. En uzak düşük konsantrasyon konumuna hareket eden bir hücre ise eksi bir ile ağırlıklandırılır. Tüm ağırlıklandırılmış hücre sayılarının toplamı, CMC'yi oluşturmak için hücre sayısına normalize edilir.

Bu grafik, mikroakışkan cihazda floresein izotiyosiyanat kullanılarak oluşturulan lineer bir konsantrasyon gradyanını veya profilini göstermektedir. Konsantrasyon gradyanının oluşumu, bu şekilde mavi ve sarı renkli boyalar kullanılarak gösterilmiştir. Hücre girişi, içinden akış olmaması için kapalı (CA) tutulmuştur ve mavi ile sarı arasında bir renk yelpazesinin oluştuğu görülebilir.

Burada, e coli RP 4 37'nin cihaz içinde 0 ile 100 µM L aspartat veya 0 ile 225 µM nikel sülfat gradyanına maruz bırakıldığı temsilci bir kemotaksi deneyinden alınan yalancı renkli görüntüler yer almaktadır. Canlı yeşil bakterilerin L aspartata doğru veya nikelden uzağa göçü, 30 dakika boyunca her 2,5 saniyede bir görüntülenmiştir. Kırmızıyla gösterilen ölü bakteriler, cihazdaki akış etkileri için kontrol olarak kullanılmıştır.

Gradyan yokluğunda, mikroakışkan cihazdaki RP 4 37'nin uzaysal dağılımı, aspartat gradyanına ve nikel sülfat gradyanına verdiği yanıtla karşılaştırmalı olarak bu grafikte gösterilmiştir. Az önce, nikel sülfat gradyanı altındaki e coli RP 4 37'nin kemotaksisini nasıl izleyeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü uygularken, yüksek motiliteli bir alt popülasyonun kullanılabilmesi için hücrelerin vorteksle karıştırılmasının minimuma indirilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.