Name: Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Öğrenin mikroakışkan cihaz kullanarak E. coli RP 4 37 bakterilerinin kemotaksis davranışlarını incelemeyi. Bu yöntem, bakterilerin kimyasal uyaranlara yanıtını ve hareket mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0.846.453) tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Standart SU-8 fotolitografi 1 (Bu video görünmez) kullanılarak silikon ustaların Fabrikasyon. <ol><li> Mikroakışkan ağ ve kemotaksis odasına içeren PDMS kalıp imalatı için SU-8 "master" (SÜ-8 2025, MicroChem, Newton, MA) oluşturmak için standart SU-8 fotolitografi yöntemleri kullanın. Böyle bir ana kalıp herhangi bir mikroimalat tesisi (örneğin, Stanford Mikroakiskan <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">Döküm</a> http://thebigone.stanford.edu/foundry/ imal edilebilir) . </li><li> PDMS çoğaltma önce ana PDMS kolay bırakma kolaylaştırmak için bir vakum kaynağına bağlı bir desikatöre fluorosilane buhar SU-8 master ortaya bir kağıt havlu fluorosilane bir damla ekleyin ve bir dakika süreyle vakum uygulamak. Vakum çıkarın ve fluorosilane birikimi için 30 dakika izin verin. SU-8 ana ileride kullanmak üzere kapalı bir kapta tutun. </li></ol> 2. SU-8 ustadan PDMS Replica kalıplama: akışkan katman ve kontrol katmanı SU-8 master PDMS çoğaltma kalıplama yapılır. <ol><li> 10:01 ağırlıkça PDMS pre-polimer ve çapraz bağlayıcı karıştırın. 1 saat (ya da hava kabarcıkları PDMS karışımından kaldırılana kadar) bir desikatöre oranı ve gazını. </li><li> Petri SU-8 ana yerleştirin ve dikkatli bir şekilde istenilen kalınlıkta SU-8 ustanın üstüne PDMS karışımı dökün. </li><li> PDMS ve 80 ° C iki saat PDMS tedavi SU-8 ana kalıp içeren petri ısıtın. </li><li> Kaldır tedavi PDMS-kapalı ocak SU-8 master ve SU-8 master PDMS kalıp kabuğu. İstenen yapı PDMS kalıp içinde gömülü olacaktır. </li><li> 20 gauge künt uç iğne kullanarak degrade jeneratör ve hücre giriş boru PDMS kalıp delgeç. </li></ol> 3. PDMS cihazları Bağlar: <ol><li> Izopropanol ve azot veya hava akımı ile kuru bir cam mikroskop lamı temizleyin. </li><li> PDMS ve bir plazma temizleyici oksijen plazma cam slayt Açığa. </li><li> Cam slayt ile temas PDMS kalıp getirin. Temas slayt ve PDMS kalıp Isı 65 ° C 15 dk. </li></ol> 4. PDMS cihaz Montaj <ol><li> Bir jilet kullanarak boru kesme, 45 °, cihaz için gerekli olan doğru uzunlukta açı. </li><li> Forseps kullanarak aygıt (örneğin, çıkış) delikli deliklere hortumun bir ucunu. </li><li> Forseps kullanarak, hortumun diğer ucunu bir künt 30-gauge iğne takın. </li><li> Kalan tüm delikleri için adım 4.2 tekrarlayın. </li><li> Kemotaksis tampon (CB), bir 3ml şırınga şırınga hava kabarcıkları özen 1mL toplayın. </li><li> Çıkış hortumun bir ucunu bir iğne merkezi sabitleyin. </li><li> CB iğne hub ekleyin ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için iğne hub dokunun. </li><li> CB şırınga ucu biraz dışarı itin ve hava hapsi olmadan 3ml şırınga iğne hub bağlamak. </li><li> CB, CB ile geriye kalan tüm iğne hub dolana kadar cihaz üzerinden itin. Bu hava kabarcıkları büyük bir çoğunluğu kaldırmanız gerekir. </li><li> CB ile chemoeffector denenmektedir uygun konsantrasyonları içeren iki 500μL şırınga doldurun. Şırınga içeriğini küçük bir damla dışarı iterek ve dokunarak ve iğne merkezi sıvı açılan takılarak hava kabarcığı oluşumunu ortadan kaldırır. </li><li> Benzer şekilde, CB bakteri girişine içeren bir şırınga bağlayın. Bakteri cihazın içine sunulduğunda bu silinecektir. </li></ol> 5. Son derece hareketli E. Büyüme coli <ol><li> Grow E. gecede kültürlerin coli sallayarak Tripton suyu (TB) ile 32 ° C'de 20 ml plazmid bir GFP ifade ile RP437. Plazmid korumak için uygun antibiyotik konsantrasyonları ekleyin. Protokolde, düşük kopya cihaz floresan dayalı bakteri tespit için bir plazmid pCM182 kullanın. E. için coli, 32 büyüyen kültürler ° C motilitesi yüksek sıcaklıklarda daha düşük olduğu gibi, yüksek hareketlilik açısından tavsiye edilir. </li><li> 250 mL Erlenmeyer şişesinin ~ 0.05 600Nm bir optik yoğunluk TB 20 ml kültür aşılamak için bir gecede kültür kullanın. 32 sallayarak kültür büyütün ° C </li><li> 5 dakika boyunca 400 xg'de düşük hızda santrifüj ~ 0.35 0.45 OD 600 hücreleri Hasat. </li><li> Chemoeffector kanalın ortasında beklenen konsantrasyon içeren CB ~ 0.35 OD 600 hücreleri tekrar </li><li> GFP ifade canlı hücreler bir OD 600 ~ 0.35 RFP etiketli ölü hücreleri ekleyin. Ölü hücreleri (kırmızı), herhangi bir göç akışı etkileri nedeniyle olmadığından emin olmak için bir iç kontrol sistemi olarak kullanılmaktadır. </li></ol> 6. İzleme kemotaksis <ol><li> Hücreye giriş iğne CB kısmını çıkarıngöbeği. Yedek hücre süspansiyonu ile. </li><li> 50μL şırınga yavaşça yeniden süspanse hücreleri ile doldurun. Bu adım, kamçı makaslanmış gibi yavaş yavaş yapılması gerektiğini ve motilite azaltacaktır. </li><li> 50μL şırınga adım adım 4.10 'da açıklandığı gibi giriş-iğne hub'a takın. </li><li> Görüntü elde etmek için yüksek hızlı bir kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop aşamasında cihazı yerleştirin. Giriş şırınga (her ikisi de 500 mcL degrade şırınga ve 50 mcL hücre şırınga) şırınga pompası içine yerleştirin ve degrade oluşur ve hücreleri borudan akan akışını başlatmak. </li><li> Hücreleri kemotaksis odasına girin görüntüleme önce istikrara kavuşturmak için sistem için ~ 20 dakika bekleyin. </li><li> Odanın uzunluğu boyunca farklı yerlerde (farklı pozlama süreleri karşılık gelen), yeşil (canlı) ve kırmızı (ölü) floresan görüntüleri toplayın. Genellikle, 100 görüntü 3 saniye aralıklarla her yerde toplamak. </li></ol> 7. Veri analizi: aşağıdaki adımları kullanarak veya herhangi bir piyasada bulunan görüntü analiz programı (örneğin, ImageJ, Metamorph) Matlab yazılmış basit kodlar kullanılarak yapılabilir. <ol><li> Arka plan piksel görüntü (yani, set eşik piksel yoğunluğu ve eşik daha az bir yoğunluk var tüm pikselleri kaldırmak) çıkarın. Analizinde bu gürültü en aza indirir. </li><li> Görüntünün merkezini belirlemek için ölü hücreleri (kırmızı floresan) pozisyonunu kullanın. Ölü hücreleri yok kemotaksis gösteren bu yana, bu hücreleri kemotaksis odasına girdi ve herhangi bir göç yokluğunda tespit olacaktır konumu temsil eder. </li><li> Görüntüyü canlı hücreleri (yeşil floresan) bulun. </li><li> Kanal içine görüntü bölün ve her kanalda canlı hücrelerinin sayısını belirlemek. Önceki 3, 1050 mikron genişliğinde kemotaksis odasının her ~ 16 mikron genişliğinde 64 kanal ayrıldı. </li><li> Tüm fotoğraflar için 7.1 7.3 adımları tekrarlayın ve her kanal için tüm görüntüleri üzerinden toplam hücre sayıları toplamı. Bu deney süresi boyunca her kanal tespit edilen toplam hücre sayımı verir. </li><li> +1 Ve -1 çarpanı, yüksek konsantrasyon (sağda) ve düşük konsantrasyonda (sol), ölü hücreler kenarlarında bulunan Her hücre atanır aşağıdaki gibidir: göç yönü temsil kemotaksis partisyon katsayısı (TBM), hesaplayın sırasıyla. Yani, degrade aşağı hareket hücreleri -1 ile çarpılır ise degrade +1 ile çarpılır kadar göç bir hücre. Çarpılarak tüm değerleri eklendi ve tespit edilen hücrelerin toplam sayısı normalize edilir. Örneğin, bir TBM değeri 0.40, toplam bakteri% 40 daha düşük konsantrasyonda tarafı (yani, daha fazla bakteri degrade yukarı hareket tespit edildi chemoeffector Cezbedici) daha yüksek konsantrasyon tarafına taşınmış olduğunu gösterir. </li><li> Kemotaksis göç göç ettiğini hücreleri mesafe ile orantılı bir faktör her kanalda Ağırlık hücre sayısı aşağıdaki gibidir: mesafe hücrelerinin göç, seyahat ağırlığında katsayısı (CMC), hesaplayın. Yüksek konsantrasyon tarafına yarım hareket bir ağırlık faktörü 0,5 ise, uzak yüksek konsantrasyon pozisyonlar (kanal 64) ile hareket eden bir hücre +1 bir ağırlık faktörü göz önüne alındığında, ve uzak bir hücre -1 ile düşük konsantrasyon konumunu ağırlıklı. Tüm ağırlıklı hücre sayıları toplamı ve CMC oluşturmak için hücre sayısı normale. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar 3,4: Biz kullanılan mikroakışkan cihazı (Şekil 1A) E. kemotaksis araştırmak için buradayız cezbedicilerde (aspartik asit, autoinducer-2) ve kovucular (Niso 4, indol) 3,4 Degradelerde coli. Prototip kemotaksis zorlanma 5 E. coli RP437 ifade GFP kanamisin-öldürülen E. ile birlikte kullanılır. akış etkilerini izlemek için kırmızı floresan proteini ifade coli TG1 hücreleri. Şekil 1B μFlow cihazda oluşan konsantrasyon farkı gösterilmiştir. Hücre giriş üzerinden akış ve 0 100 fluoresscein ng / ml cihaz yılında kurulmuştur istikrarlı bir eğim vardı, böylece kapatılmış oldu. Cihaz üzerinde piksel yoğunluğu floresein konsantrasyonunun profilini belirlemek için kullanılmıştır. Veri kemotaksis odasına girdiğinizde bakteriler doğrusal bir degrade karşılaştıkları göstermektedir. Şekil 2A ve B E. floresan görüntüleri gösterir . aspartik asit (0 100 mcM) ve Niso 4 (0 225 mcM) degradeler yanıt coli RP437 göç. Gözlenen bu kanonik cezbedici yanıtları ve itici tahmin edilmektedir. Şekil 3A E. sayısal dağılımını göstermektedir coli RP437 konsantrasyon farkı olmaması (yani, boş degrade aspartik asit),Şekiller 3B ve C aspartik asit ve Niso 4 gradyanlar dağılım gösterir. Bu yanıtların özgüllük (yani, göç önyargı) E. olarak açıktır coli RP437 Δ tar suşu (örneğin, E. coli aspartik asit ve nikel anlamda kullanılan Tar kemoreseptör eksik suşu), aspartik asit veya 4 Niso bir konsantrasyon gradiyenti varlığı göç önyargı göstermek değil . Mekansal dağılımının profilleri belirgin eğilimleri de hesaplanan TBM ve CMC değerleri ile tutarlı. E. göç TBM değerleri aspartik asit veya Niso 4 gradyanlar coli RP437 sırasıyla 0,33 ve -0,33,. Ilgili CMC değerleri sırasıyla 0,13 ve -0,14,. E. aksine, TBM ve CMC değerleri aspartik asit veya Niso 4 gradyanlar coli RP437 Δ tar gerginlik önemsizdir. Buna ek olarak, bir boş degrade aspartik asit TBM ve CMC sırasıyla 0,03 ve 0,02, ve bir degrade yokluğunda göç yanlılık eksikliği gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1b"> Şekil 1. Aygıt şematik ve konsantrasyon farkı. (A) mikroakışkan kemotaksis cihazının şematik gösterimi. Cihaz bir degrade karıştırma modülü (20 x 100 x 18750 mm) ve kemotaksis gözlem modülü (20 x 1050 x 11500 mm) oluşur. Cihaz giren iki degrade kanal genişlikleri 500 mm ve bakteri giriş genişliği 50 mm. Içerlek sinyal molekülüne (gri) ve buna yanıt olarak göç eden bakterilerin bir degrade gösteriyor. Ise ölü bakteri açık oval olarak gösterilen Live bakteri, katı oval olarak tasvir edilmektedir. (B) 0 ile 100 ng / ml floresein arasındaki konsantrasyon farkı cihaz oluşturulan ve floresan mikroskopi kullanılarak görüntülendi. Floresan görüntüleri 30 dakika sonra elde edilen ve görüntü analizi ile ölçüldü. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. E. Kemotaksis coli RP437 mikroakışkan cihaz. E. coli RP437 bir degrade maruz kalan (A) 0-100 mcM L-aspartat veya (B) 0-225 cihaz mcM Niso 4 ve göç canlı bakteri (yeşil), L-aspartat doğru veya nikel 30 dakika boyunca her 2.5 saniye görüntülenmiş. Ölü bakteriler (kırmızı), cihazın akış etkileri kontrol olarak görev yaptı. Görüntü analizi program3 geliştirilen bir evi kullanılarak ölçüldü. Gösterilen veriler, üç bağımsız deneyler temsilcisi sözde renkli görüntüler. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Şekil 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Şekil 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Şekil 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3c"> Şekil 3: kanonik cezbedici ve itici göç profilleri Niceleme. Yanıt mikroakışkan cihaz RP437 mekansal dağılımı (A) üniforma mcM 100 L-aspartat (yani, degrade), (B) aspartat 0 100 mcM degrade, (C) ve Niso 4 0 225 mcM degrade . RP437 hücrelerin ölü hücreleri dağılımı bir düz çizgi olarak gösterilir, dağıtım kesik çizgi olarak gösterilir ve RP437 eda + Δ tar hücrelerinin dağılımı, bir noktalı çizgi olarak gösterilir . Gösterilen veriler üç bağımsız deneyler için ortalaması alınır.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

Kemotaksis bölüm katsayısı (TBM) ve kemotaksis göç katsayısı (CMC), Mao ve ark 5 açıklandığı gibi hesaplanır . Düşük konsantrasyonda tarafında tespit edilen bir hücre -1 değeri verilir ise, yüksek konsantrasyon tarafına bir hücre tespit edilirse, 1 değeri verilir. Değerleri toplanır ve toplam hücre sayısına göre TBM oluşturmak için ayrılmıştır. TBM (pozitif ya da negatif) işareti göç yönü (bir sinyal doğru veya uzak) verir. TBM hücreleri ya da cezbedici bir itici, kemotaksis ölçüde ölçmek değildir o...

kararlı konsantrasyon degradeler bakteriyel kemotaksis miktarının mikroakışkan aygıt

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Kemotaksis bakteri cezbedici kimyasalların kaynakları yaklaşım veya itici kimyasalların kaynakları önlemek için izin verir. Bakteriler sürekli akım konsantrasyonunu konsantrasyonu ile karşılaştırarak özel chemoeffectors konsantrasyonu monitör daha önce birkaç saniye tespit. Bu karşılaştırma, net hareketin yönünü belirler. Birden fazla, rekabet gradyanlar genellikle doğada bir arada olmasına rağmen, bakteriyel kemotaksis araştırmak için geleneksel yaklaşımlar cezbedicilerde ve kovucular konsantrasyonu gradyanlar yanıt göç ölçülmesi için optimal. Burada, bakterilere karşı hassas ve kararlı chemoeffectors konsantrasyon gradyanlar sunulması ve nicel olarak uygulanan degrade tepki soruşturma mikroakışkan kemotaksis model geliştirme açıklar. Cihaz istenen herhangi bir mutlak konsantrasyon ve degrade gücü bu konsantrasyon gradyanlar çok yönlü kolayca uzadıya karıştırılması ile oluşturulabilir. Cihaz yanıtı ile gösterilmiştir<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 amino asitler ve nikel iyonları degradeler.

Bu protokol, chemoeffectors istikrarlı konsantrasyon gradyanlar bakteriyel kemotaksis soruşturma için bir mikroakışkan aygıt geliştirme açıklar.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Kemotaksi, bakterilerin çekici kimyasal kaynaklarına yaklaşmasına veya itici kimyasal kaynaklarından kaçınmasına olanak tanır. Bakteriler sürekli olarak ...'yı izlerler.

E Coli RP 4 37, tanımlanmış uzamsal konsantrasyon gradyanlarına maruz kaldıkları bir kemotaksi cihazına aktarılır. Hazneye giren hücreler, konsantrasyon gradyanının orta noktası ile karşılaşır. Sinyalin bir çekici mi yoksa itici mi olarak algılandığına bağlı olarak bakteriler, konsantrasyon gradyanı boyunca hızla yukarı veya aşağı doğru hareket ederler.Merhaba, ben Texas A&amp;M Üniversitesi Moleküler Sistem Biyoteknolojisi Laboratuvarı ve Kimya Mühendisliği Bölümü'nden Derek Engler. Bugün size mikroakışkan bir cihazda bakteriyel kemotaksisin incelendiği bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarlarımızda bu prosedürü, E. coli RP 4 37'nin nikel sülfat konsantrasyon gradyanında nasıl göç ettiğini çalışmak için kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Akışkan katmanı ve kontrol katmanı, SU-8 kalıptan Polimetil SUBOXANE veya PDMS'in replika kalıplama yöntemiyle üretilir. Bu prosedüre başlamak için, PDMS ön polimerini ve çapraz bağlayıcıyı 10'a bir ağırlık oranında karıştırın.Hava kabarcıkları giderilene kadar karışımı bir desikatörde bir saat boyunca degaze edin. PDMS karışımı hazır olduğunda, SU eight master'ı bir Petri kabına yerleştirin ve karışımı istenen kalınlığa ulaşana kadar SU eight master'ın üzerine dikkatlice dökün. PDMS'in kürlenmesi için PDMS ve SU eight master kalıbını içeren Petri kabını 80 °C'de iki saat boyunca ısıtın.İki saat sonra, kürlenmiş PDMS kaplı SU-8 master'ı ısıtıcı plakadan çıkarın ve PDMS kalıbını SU-8 master'dan soyun. İstenen yapı PDMS kalıbın içine gömülmüş olacaktır; 20 gauge küt uçlu iğne kullanarak PDMS kalıba, gradyan jeneratörüne, hücre girişine ve hücre çıkışına gidecek tüpler için dört delik açın. Artık PDMS cihazını birleştirmeye ve PDMS cihazını bağlamaya hazırız.İlk olarak, cam bir mikroskop lamını izopropanol ile temizleyin ve Airstream ile kurulayın. Ardından, PDMS kalıbı ve cam lamı bir plazma aşındırıcıda yaklaşık 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. PDMS kalıbı cam lam ile temas ettirin. Temas halindeki lamı ve PDMS kalıbı bir ısıtıcı tabla üzerinde 15 dakika boyunca 65 °C'ye ısıtın.PDMS cihazını monte etmek için, mikroskop kurulumuna bağlı olarak gerekli uzunlukta tüpü bir jilet yardımıyla 45 derecelik açıyla kesin. Ardından bir pens kullanarak, tüpün bir ucunu cihazda açılmış dört delikten birine yerleştirin.Hortumun diğer ucuna küt uçlu 30 gauge iğne göbeği yerleştirin. Hortum ve iğne göbeği yerleştirme işlemini geri kalan tüm delikler için tekrarlayın. Üç mililitrelik bir şırıngaya bir mililitre chemo taxes, tampon çözelti veya CB yükleyin.Şırıngadaki havanın çıkarılmasına dikkat edin. Bir pipet kullanarak çıkış iğne göbeğine CB ekleyin ve hava kabarcıklarını gidermek için iğne göbeğine hafifçe vurun. Üç mililitrelik şırınganın ucundan bir miktar CB dışarı itin ve şırıngayı, hava hapsolmadan iğne göbeğine bağlayın.Kalan tüm iğne göbekleri CB ile dolana kadar, CB'yi cihazdan geçirin. Bu işlem hava kabarcıklarının çoğunu giderecektir. Ardından, iki adet 500 µL'lik şırıngayı, test edilen kemo efektörün uygun konsantrasyonlarını içeren CB ile doldurun.Yüksek hareketliliğe sahip bakteriler hazırlamak için şırınganın içeriğinden küçük bir damla dışarı iterek iğne göbeğindeki sıvı damlalarına temas ettirin ve hava kabarcığı oluşumunu engelleyerek şırıngayı takın. Kemotaksi deneyi için, GFP ekspresyon plazmidi taşıyan e coli RP 4 37'nin tripton broth veya TB içerisinde, 32 °C'de çalkalamalı olarak bir gece boyunca kültürünü büyütün. Ertesi gün, 250 mL erlenmeyer flask içindeki 20 mL TB kültürünü 600 nm'de yaklaşık 0,05 optik yoğunluğa ulaşana kadar inoküle etmek için bir gecelik kültürü kullanın.Hücreler yaklaşık 0,35 ile 0,45 arasında bir OD 600 değerine ulaştığında, kültürü 32 °C'de çalkalayarak büyütün. Hücreleri düşük hızlı santrifüj ile hasat edin ve kanalın ortasında olması beklenen konsantrasyondaki kemo efektörü içeren CB içerisinde yaklaşık 0,35 OD 600 değerine gelecek şekilde yeniden süspande edin. Son olarak, GFP eksprese eden canlı hücrelere, yaklaşık 0,35 OD 600 değerinde RFP ile işaretlenmiş ölü hücreler ekleyin.Bu ölü hücreler, meydana gelen herhangi bir migrasyonun akış etkilerinden kaynaklanmadığından emin olmak için dahili kontrol olarak kullanılacaktır. Hücre süspansiyonu artık kemotaksi deneyi için mikroakışkan cihaza yüklenmeye hazırdır. Kemotaksi deneyine başlamak için, hücre giriş iğne göbeğindeki CB'nin bir kısmını boşaltın ve hücre süspansiyonu ile doldurun.50 µL'lik bir şırıngayı resüspande edilen hücrelerle nazikçe doldurun. Kamçıların kopması motiliteyi azaltabileceği için bu işlemi yavaşça yapın. Şırınga içeriğinden küçük bir damla dışarı itip bu damlayı iğne göbeğindeki sıvıya değdirerek ve şırıngayı takarak, 50 µL'lik şırıngayı daha önce gösterildiği gibi giriş iğne göbeğine sabitleyin; cihazı, görüntüleme için yüksek hızlı kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobun tablasına yerleştirin.Her iki giriş şırıngasını şırınga pompasına yerleştirin ve gradyan oluşacak ve hücreler tüpler boyunca akacak şekilde akışı başlatın. Hücreler kemotaksis odasına girdikten sonra, sistemin stabilize olması için yaklaşık 20 dakika bekleyin. Görüntüleme yapmadan önce, odanın uzunluğu boyunca farklı konumlardan canlı yeşil ve ölü kırmızı floresan görüntüleri toplayın.Genellikle her konumda üç saniye aralıklarla 100 görüntü topluyoruz. Elde edilen floresan görüntüler, Image J veya metamorph gibi ticari olarak mevcut herhangi bir görüntü analiz programı veya MATLAB ile yazılmış basit kodlar kullanılarak analiz edilebilir. Bu örnekte, MATLAB kodlarını kullanacağız.Görüntüdeki arka plan piksellerini belirlenen eşik piksel yoğunluğu aracılığıyla kaldırarak başlayın ve yoğunluğu eşik değerinden düşük olan tüm pikselleri silin. Bu işlem gürültüyü en aza indirir. Analizde, görüntünün merkezini belirlemek için ölü hücrelerin konumunu kullanın.Bu, hücrelerin kemotaksi odasına girdiği ve herhangi bir migrasyonun olmadığı durumda tespit edilecekleri konumu temsil eder. Ardından, görüntüdeki canlı hücreleri belirleyin, görüntüyü kanallara ayırın ve her kanaldaki canlı hücre sayısını tespit edin. Önceki çalışmamızda, 10 50 µm genişliğindeki kemotaksi odası, her biri yaklaşık 16 µm genişliğinde olan 64 kanala ayrılmıştır.Bu adımlar tüm görüntüler için tekrarlandıktan sonra, tüm görüntüler boyunca her kanal için toplam hücre sayılarının bir kısmı elde edilir. Bu, deney süresi boyunca her kanalda tespit edilen toplam hücre sayısını verir. Göç yönünü temsil eden kemotaksi bölüntü katsayısını veya CPC'yi hesaplayın.Aşağıdaki adımları uygulayarak, ölü hücrelerin yüksek konsantrasyonlu (sağ) ve düşük konsantrasyonlu (sol) taraflarında yer alan her bir hücreye sırasıyla artı bir ve eksi bir çarpanı atayın. Tüm çarpılmış değerleri toplayın ve toplam tespit edilen hücre sayısına göre normalize edin. Hücrelerin göçünü kat edilen mesafeye göre ağırlıklandıran kemotaksi göç katsayısını veya CMC'yi hesaplayın.En uzak yüksek konsantrasyon konumu olan kanal 64'e hareket eden bir hücreye artı bir ağırlık faktörü verilirken, yüksek konsantrasyon tarafına yarı yola kadar hareket eden bir hücreye artı 0.5 ağırlık faktörü verilir. En uzak düşük konsantrasyon konumuna hareket eden hücre ise eksi bir ile ağırlıklandırılır. Tüm ağırlıklı hücre sayılarının toplamı alınır ve CMC'yi oluşturmak için hücre sayısına normalize edilir.Bu grafik, mikroakışkan cihazda floresein izotiyosiyanat kullanılarak oluşturulan lineer bir konsantrasyon gradyanını veya profilini göstermektedir. Konsantrasyon gradyanının oluşumu, bu şekilde mavi ve sarı renkli boyalar kullanılarak gösterilmiştir. Hücre girişi CA olduğu için içinden akış gerçekleşmemiştir ve mavi ile sarı arasında bir renk yelpazesinin oluştuğu görülebilmektedir.Burada, E. coli RP 4 37'nin cihaz içinde 0 ila 100 µM L aspartat veya 0 ila 225 µM nikel sülfat gradyanına maruz bırakıldığı temsili bir kemotaksi deneyinden alınan yalancı renkli görüntüler yer almaktadır. Canlı yeşil bakterilerin L aspartata doğru veya nikelden uzağa göçü, 30 dakika boyunca her 2,5 saniyede bir görüntülenmiştir. Kırmızı ile gösterilen ölü bakteriler, cihazdaki akış etkileri için kontrol olarak kullanılmıştır.Gradyan yokluğunda mikroakışkan cihazdaki RP 4 37'nin uzamsal dağılımı, aspartat gradyanına ve nikel sülfat gradyanına verdiği yanıtla karşılaştırmalı olarak bu grafikte gösterilmiştir. Size, nikel sülfat gradyanındaki e coli RP 4 37'nin kemotaksisinin nasıl izleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, yüksek motiliteye sahip bir alt popülasyonun kullanılabilmesi için hücrelerin vorteksleme işlemini en aza indirgemeyi hatırlamak önemlidir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

a-microfluidic-device-for-quantifying-bacterial-chemotaxis-stable

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kayma akışı içinde derme çatma bir besin bir deniz manzarası ve yüzme davranışı içinde bakteri deniz mikropların kemotaktik toplayıcı davranış eğitimi için mikroakışkan kanalları ve deneylerde bunların uygulanmasını imalat açıklanmıştır.

Mikro Ölçekli Besin Katmanlar Deniz Mikro-organizmalar kemotaktik Tepki

Mikroakiskan kullanarak Bakteriyel Kemotaksis Çalışmaları - Röportaj

Biz, iyi tanımlanmış mikroçevresinin mekansal ve zamansal degradeleri üretebilir degrade üreten mikroakışkan cihaz mikroimalat için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yaklaşımda, degrade üreten mikroakışkan cihaz yönlendirilmiş hücre göçü, embriyogenez, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı çalışma için kullanılabilir.

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

Kaynak: Scheidweiler, D. ve diğerleri. Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilerek Gözenekli Ortamlarda Mikrobiyal Taşınımı Mekansal Ölçeklerde İncelemek. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, rastgele düzenlenmiş sütunlardan oluşan gözenekli bir matriks aracılığıyla bakteri hareketliliğini ölçmek için mikrofluidik bir cihazın kullanıldığını gösteriyor. Fluoresan etiketli bakteriler cihaza dahil edilir, gözenekli matriksin içinden gözlem kanalına ilerlerken mikroskopi ile...

Mikrofluidik Cihaz Kullanarak Bakteriyel Hareketliliğin Değerlendirilmesi

Bu video, hepsi çip üzerinde bir yöntem kullanılarak nötrofil kemotaksisi testini göstermektedir. Yöntem, immünomanyetik negatif seçim ve ardından bir mikroakışkan çip üzerinde kemotaksis testi ile nötrofillerin tam kandan doğrudan izolasyonuna izin verir.

Tam Kan Kullanılarak Hızlı Nötrofil Kemotaksisi Analizi için Mikroakışkan Çip Tabanlı Bir Yöntem

Bu protokol, sağlam tekrarlanabilirlik ile, bütün haldeki kan, bir damla, insan nötrofil kemotaksisi ölçmek için tasarlanmış bir tahlil göstermektedir. Bu yaklaşım, nötrofil ayrılması için ihtiyaç dışı eden ve deney hazırlama zaman sadece birkaç dakika gerektirir. Mikroakışkan çip bebeklerde veya örnek hacmi sınırlıdır küçük memeliler, zamanla nötrofil kemotaksisinin tekrarlanan ölçü sağlar.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Mikroakışkan ve miliakışkan kurulumlar içinde fotolik tarafından dinamik kimyasal manzara üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hem tek hücre hem de popülasyon düzeyinde, hareketli davranış, besin alımı veya mikroorganizmaların kimyasallarına adaptasyon dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için uygundur.

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

Burada sunulan bir in situ kemotaksis test için protokol, çevrede doğrudan mikrobiyal davranış çalışmaları sağlayan yeni geliştirilen mikroakışkan bir cihaz.

Sucul Ekosistemlerde Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Situ Chemotaxis Tsay'da

Burada, aynı anda çoklu konsantrasyon tepkileri elde ederken bakteriyel kaynama hareketliliğini değerlendirmek için indükleyici gradyan plakalarının kullanımını açıklıyoruz.

İndükleyici Gradyan Plakaları Üzerindeki Bakteriyel Yüzey Kaynatma Motilitesinin Ölçülmesi

Öğrenin mikroakışkan cihaz kullanarak E. coli RP 4 37 bakterilerinin kemotaksis davranışlarını incelemeyi. Bu yöntem, bakterilerin kimyasal uyaranlara yanıtını ve hareket mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Daha fazla video keşfet