Styryl Boyaların Fotoçevrim kullanarak Synaptic veziküllü Havuzları incelenmesi

Bu video, Styro Dye FM 1 43'ün fotoğraf dönüştürme prosedürünü göstermektedir. Drosophila melanogaster'deki sinaptik vezikül havuzlarını incelemek için, önce drosophila larvaları, nöromüsküler kavşağı veya NMJ preparatını oluşturan ventral kasları ortaya çıkarmak için diseke edilir. Preparatlar, burada gri etiketli hücresel zarda gösterilen FM D içeren tampon içinde inkübe edilir.

Daha sonra fiziksel füzyonu indüklemek için elektriksel veya kimyasal olarak uyarılırlar, vezikül zarı içselleştirilir. Hücre dışı FM boyası daha sonra yıkanır, plazma zarından çıkarılır ve doku sürekli yüksek yoğunluklu aydınlatma altında sabitlenir. Boya tamamen ağartılır ve di amino Ben ve çökelme nedeniyle siyah renk ortaya çıkar.

Bu çökelti daha sonra em iletimi ile görselleştirilebilir. Merhaba, ben Almanya'nın Gaon kentindeki Avrupa Nörobilim Enstitüsü'ndeki Sylvia Olli'nin laboratuvarından Philippe o Paso. Bugün size nöromüsküler kavşakta FM foto dönüşümü için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarımızda sinaptik vezikal geri dönüşümü incelemek için kullanıyoruz. Tamam, öyleyse diseksiyon mikroskobu altında çalışmaya başlayalım. Bir drosophila larvalarını sırt tarafı yukarı bakacak şekilde çok koruyucu kaplı bir tabağa sabitleyerek başlayın.

Bir şırınga iğnesi kullanarak drosophila salin ile kaplayın ve diseksiyon makasının sırt tarafını uzunlamasına bölümünü bulun. Sonra iç organları çıkarın. Ardından, hazırlığı gerin ve tekrar puro kabına sabitleyin.

Daha sonra bu prosedürde kullanılan FM boyalarını ağartmadan korumak için birkaç ventral kas kullanılabilir. Bu prosedür düşük ışık koşullarında yapılmalıdır. Sinirleri kimyasal olarak uyarmak için sıkışmış drosophila preparatını 90 milimolar potasyum klorür ve 10 mikromolar FM.1 43 kalıbı içeren drosophila salin ile örtün.

Stimülasyonu takiben oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. Uyarıcı çözeltiyi çıkarın ve tabağı sabitlenmiş drosophila ile daldırın. Kimyasal güvenlik başlığı altında çalışan hücre dışı FM 1 43 kalıbını çıkarmak için iki kez 100 mililitre drosophila salin ile doldurulmuş bir beherde hazırlık.

Nöromüsküler kavşak preparatını% 2.5 glutaraldehit içinde fosfat tamponlu salin veya PBS içinde oda sıcaklığında 45 dakika sabitleyin. Preparasyonu PBS ile bir kez yıkayın, ardından puro kabından çıkarın ve 15 dakika boyunca 100 milimolar amonyum klorüre batırın. Kalan glute aldehit fiksatifinin serbest aldehit gruplarını söndürmek için.

Normal PBS kullanarak amonyum klorür çözeltisini yıkayın, nöromüsküler kavşak preparatını yeni bir puro kabına yerleştirin ve mililitre başına 1.5 miligram filtrelenmiş içine daldırın. PBS'de diamin, benzin veya DAB ve dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Numuneyi, nispeten düşük büyütmeli kuru objektif kullanarak bir arka ayna içeren bir lamba muhafazasına sahip bir cıva lambası ışık kaynağı ile donatılmış bir floresan mikroskobu altına yerleştirin.

Örneği bulun. Ardından normal bir mavi uyarma yeşil floresan filtre küpü kullanarak floresan sinyalini odağa getirin. Nöromüsküler kavşaklar, kaslar üzerinde parlak noktalar olarak görünür.

Ardından, aynı floresan filtre setini kullanarak, FM D tamamen ağartılana kadar numuneyi maksimum yoğunlukta aydınlatın. 20 x objektif lens kullanarak 30 ila 45 dakika yeterli olacaktır. Bununla birlikte, fotoğraf dönüştürme süresi, aydınlatma yoğunluğuna, DAB'ın preparasyona nüfuz etme gücüne ve kullanılan objektif merceğe bağlı olarak değişir.

Aydınlatmanın ardından, s'yi iletim ışığı altında inceleyin. Fotoğraf dönüşümü gerçekleştiyse, koyu kahverengi bir çökelti görülmelidir. Diseksiyon kapsamına geri dönün, ardından fotoğrafa dönüştürülen noktayı larvadan kesmek için makas kullanın.

Diseksiyon kapsamına geri dönün. Ardından, larvalardan fotoğrafa dönüştürülen noktayı kesmek için makas kullanın. Şimdi numuneyi, kimyasal güvenlik başlığı altında çalışan ve eldiven ve göz koruması da dahil olmak üzere uygun güvenlik ekipmanı giyen PBS içeren bir mikro füj tüpüne yerleştirin.

Örnek başına 300 mikrolitre %1 osmiyum tetroksit hazırlayın. Şimdi numuneyi plastik tepeli bir cam şişeye yerleştirin ve preparatı sabitlemek için hazırlanan osmiyum tetroksit solüsyonunu ekleyin. Numune inkübe edilirken 30, 50, 70, 90, 95 ve %100 etanol içeren ayrı çözeltiler hazırlayın.

Numuneyi PBS ile her biri beş dakika boyunca dört ila beş kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, numuneyi yeni bir şişeye aktarmak için pipetinize plastik bir PE kullanın. Son yıkamadan sonra numuneyi temiz bir cam şişeye aktarın.

Ardından, numuneyi bir dizi etanol çözeltisine yerleştirerek kurutun. Bir mililitre% 30 etanol içinde inkübe ederek başlayın. Daha sonra beş dakika sonra, bir mera pipeti kullanarak etanolü çıkarın ve bir mililitre% 50 etanol ile değiştirin.

Dehidrasyona devam edin, nöromüsküler kavşak preparatını 70, 90 ve sonra% 95 solüsyonlarda inkübe edin. Numune daha sonra% 95 etanol çözeltisi içinde, dehidrasyonu takiben üç kez% 100 Etanol içinde inkübe edilenden daha fazla kez inkübe edilecektir. Etanole iki mililitre bire bir EIN reçinesi ekleyin ve numuneyi bir döndürücü inkübata yerleştirin.

%100 ein'de döndükten sonra oda sıcaklığında iki ila dört saat ve kalan etanolün dört ila altı saat buharlaşmasına izin vermek için numuneyi açık bir şişeye koyun. Taze EIN'i bir kalıba dökün. Hazırlıkları ekleyin ve 60 santigrat derecede 36 saat inkübe edin.

EIN gömülü preparatlar hazır olduğunda, bir elmas bıçağı kullanarak 50 ila 80 nanometre ince kesitler I hazırlamak için bir ultra mikrotom kullanın. Numuneler ince kesitler halinde kesilir. Bölümler bıçağın su banyosu üzerinde akar ve daha sonra normal EM ızgaralarında alınabilir.

Hazırlıklar artık geleneksel EM prosedürleri kullanılarak görüntülenmeye hazırdır. Drosophila Melan gaster'dan izole edilen nöromüsküler kavşaklar, yüksek potasyum ve içselleştirilmiş membranlar kullanılarak uyarıldı. Burada gösterildiği gibi FM 1 43 kullanılarak boyanmıştır.

Bir sinir terminalinin floresansı, geleneksel bir epi floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Sürekli aydınlatma altında, boya tamamen ağartılır ve aydınlatma devam ettiğinde, dino benzin çökelmesi nedeniyle siyah bir renk ortaya çıkar. Bu sinir terminali sinaptik veziküller içerir, ancak bunların hiçbiri fotoğrafa dönüştürülmez.

Bu, dokuda yeterli aydınlatmanın olmaması veya zayıf DIA amino benzin penetrasyonundan kaynaklanabilir. Buna karşılık, çok fazla aydınlatma, uygun miktarda aydınlatma ile hiçbir vezikül veya organelin ayırt edilemediği genel bir karanlık terminale neden olur, fotoğraf dönüşümü görülebilir. Bu mikrograf, FM foto dönüşümünü gösteren koyu veziküllerden oluşan bir havuzun görüldüğü sinaptik bir bhutonu göstermektedir.

Fem die ile etiketlenmiş sinaptik vezikülleri nasıl fotoğrafla dönüştüreceğinizi az önce gösterdik. Bu prosedürü yaparken, dönüştürme adımı için aydınlatma sürelerini her zaman dikkatli bir şekilde kalibre etmeyi unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde iyi şanslar.