Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

Merhaba, benim adım Jay Harkins. Protein Discovery'de araştırma bilimcisiyim. Bugün, yüksek geri kazanımlı moleküler ağırlık tabanlı fraksiyonlama gerçekleştirmek için yeni gel free 8, 100 Fraksiyonlama sisteminin kullanımının ne kadar kolay olduğunu göstereceğim.

Gel-free sistemini kullanarak, kanal başına bir miligrama kadar toplam protein yükleyebilir ve yaklaşık 90 dakika içinde sekiz örneğe kadar tekrarlanabilir şekilde fraksiyona ayırabilirsiniz. Sistem; bir cihaz, tek kullanımlık kartuş ve deneyi gerçekleştirmek için ihtiyacınız olan tüm tampon çözeltileri içerir. Hadi başlayalım.

Bu prosedüre, sekiz adede kadar 500 µL'lik tüp hazırlayıp her birini etiketleyerek başlayın. Her tüpe 112 µL'ye kadar hacimdeki protein örneğinden 1 mg'a kadar ekleyin. Örnekteki protein miktarı, örneğin karmaşıklığına bağlıdır.

Bu gösterim için kullanılan doku homojenatı gibi daha karmaşık örnekler için, kanal başına 150 ila 200 mikrogram en iyi sonuçları verecektir. Ardından, jel içermeyen kartuş kitinde sağlanan beş x örnek tamponundan 30 mikrolitre ekleyin. Her protein örneğine, sekiz mikrolitre bir molar DTT ekleyin.

Ardından, her örneği su ile 150 µL son hacme tamamlayın. Daha sonra, örneği denatüre etmek için vialleri 95 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. Isıtılan örneklerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

gel free 8, 100 kartuşunu folyo poşetten çıkarın. Plaka kapatıcısını çıkarıp atın. Bir pipet kullanarak kartuş bölmelerindeki saklama tamponunu boşaltın.

Kartuşun sekiz odasının tamamı kullanılacaksa, saklama tamponunu bölmelerden boşaltmak için kartuşu ters çevirin. Ardından, her bir anot tampon rezervuarına sekiz mililitre jel serbest yürütme tamponu eklenir. Katot tampon rezervuarlarının her birine altı mililitre eklenir ve toplama odalarının her birine 100 mikrolitre pipetlenir.

Sekiz kanallı 100 ila 200 microliter pipet kullanarak, katot tampon rezervuarından örnek yükleme haznesine akan tüm tamponu uzaklaştırıp atın ve örnekleri derhal yükleme haznelerine yükleyin. Örnekler yüklendikten sonra, kartuşu gel free 8, 100 fraksiyonlama istasyonuna yerleştirin. Ardından, cihazın dokunmatik ekranlı görüntüleme panelindeki programlaması kolay grafik kullanıcı arayüzünü kullanarak elektrot dizilerini indirin ve kapağı kapatın; mevcut önceden programlanmış yöntemler listesine gidin.

Yöntem butonuna basarak uygun yöntemi seçin. Getir butonuna basın ve önceden programlanmış istenen yöntemin numarasını girin. Ekrandaki klavyeyi kullanarak tamam'a basın. Ardından uygula butonuna basın.

Uygulanacak yöntem ana ekranın alt kısmında görünecektir. Önceden programlanmış yöntemlerin her biri, belirli bir moleküler ağırlık aralığındaki proteinleri ayrıştırmak için tasarlanmış set voltajlarından ve zamana dayalı duraklamalardan oluşur. Uygun yöntem seçildikten sonra, ana ekrandaki kanal düğmesine basın.

Ardından, çalışma sırasında kullanılacak kanalları seçin. Sekiz kanalın tamamını seçmek için "tümünü seç"e basın. Sonra "tamam"a basın.

Ana ekrana dönmek için güvenlik kapağının kapalı olduğundan ve ekranın altındaki gösterge ışığının yeşil olduğundan emin olun. Sistem çalışırken deneyi başlatmak için şimdi start düğmesine basın; ekranın sol tarafındaki kutuda görünen daireler her bir kanalın durumunu göstermektedir. Yeşil daire, kanalın aktif olduğu anlamına gelir.

Uygulanan voltajlar ve akımlar, kanal durum dairelerinin sağında görüntülenir. Gel free 8, 100, yöntemde belirtilen aralıkla fraksiyon toplama işlemi için otomatik olarak duraklayacaktır. Cihaz fraksiyon toplamak için duraklatıldığında, bir duraklamanın gerçekleştiğini bildiren bir metin kutusu görünecek ve durum daireleri sarıya dönecektir.

Kartuşun içinde, anot ve katot rezervuarları arasında sabit bir voltaj uygulanır. Bu potansiyel altında, protein karışımı elektroforetik olarak yükleme odasından itilerek özel olarak tasarlanmış hassas döküme aktarılır. Proteinler önce yığma jel içerisinde keskin bir bant şeklinde toplanır ve ardından ayırma jelinde kendi moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılır.

Proteinler jelden elüye oldukça, sıvı fazda tutulur ve konsantre edilir. Toplama haznesinde jel bulunmaz. Ardından cihaz duraklatılır.

Önceden seçilen zaman aralıklarına dayanarak fraksiyonlar bir pipet yardımıyla toplanır. Ardından, ilgilenilen ikinci moleküler ağırlık fraksiyonunu hapsetmek için potansiyel yeniden uygulanır. Bu işlem, istenen tüm fraksiyonlar toplanana kadar tekrarlanır.

Her kartuş sekiz bağımsız elektroforetik kanal içerir, böylece kullanıcı ihtiyaç duyduğu kadar kanalı çalıştırabilir ve kullanılmayan kanalları daha sonraki bir tarihte kullanmak üzere saklayabilir. Fraksiyonları çıkarmak için cihazın kapağını açın, ardından yerleşik kanal pipetini kullanın. Her bir toplama haznesindeki 150 µL sıvıyı toplama tüplerine veya çok kuyucuklu bir plakaya aktarın.

Fraksiyonlar alındıktan sonra, her kanala 100 µL ekleyip iki kez pipetleyerek toplama haznesini jel içermeyen yürütme tamponu ile iki kez yıkayın. Yıkama işleminden sonra, toplama haznelerine tekrar 100 µL jel içermeyen yürütme tamponu ekleyin. Kapağı kapatın ve devam et düğmesine basın.

Gel free 8, 100, bir sonraki zaman aralığına kadar çalışacaktır. Deneyde kalan toplam süre ekranın sağ tarafında gösterilmektedir. Kalan süre, geçen süre ve duraklatma seçenekleri arasında geçiş yapmak için süreyi görüntüleyen kutunun üzerindeki düğmeye basın.

Tüm fraksiyonlar toplandıktan sonra, izoelektrik odaklama veya jel elektroforezi gibi ileri aşama hazırlıklar için ya da sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi veya immün afinite kullanılarak yapılacak analizler için derhal kullanılabilirler. Bu gösterimde, her biri 200 micrograms olan sekiz protein örneği, her biri 12 fraksiyona ayrılarak toplam 96 fraksiyon elde edilmiştir. Fraksiyonlama sonuçlarını görselleştirmek için, sığır karaciğer homojenat örneğindeki 12 fraksiyonun her birinden alınan birer alikot standart bir 1D jelde yürütülmüş ve gümüş boyama yapılmıştır.

Bu şekilde gösterildiği üzere, protein örneği 3,5 kilodalton ile 150 kilodalton arasındaki moleküler ağırlık aralığını kapsayan 12 ayrı fraksiyona ayrılmıştır. Burada gösterilen jel, gel free 8, 100 sisteminin yüksek miktardaki proteini belirgin moleküler ağırlık fraksiyonlarına ayırma kapasitesini vurgulamaktadır. Bu sistem, kütle spektrometrisi kullanan top-down ve bottom-up proteomik çalışmalarının yanı sıra, tek bir saflaştırılmış tam protein moleküler ağırlık fraksiyonunun gerektiği immün الأفinite deneyleri için oldukça güçlü bir araçtır.

Örneklerinizi tekrarlanabilir bir şekilde ayrı moleküler ağırlık fraksiyonlarına ayırmanın ve yüksek sıvı faz geri kazanımı elde etmenin gel free 8, 100 fraksiyonlama sistemi ile ne kadar kolay olduğunu size göstermekten memnuniyet duyduk. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.