Fare Oosit alımı

Benim adım Amanda dli. University of California Irvine'daki Dr. Paul Verana'nın laboratuvarından geliyorum. Bugün size oosit toplama prosedürünü göstereceğim.

Bu işlem, videx'in dişiden izole edilmesini gerektirir. Ovex izole edildikten sonra, videx üzerinden FHM medyumu enjekte edeceğiz ve ardından uterus üzerinden cytes çıkış yapacaktır. Bu işlem tamamlandığında, medyum içindeki cytes'leri izole edeceğiz ve bunları gelecekteki deneylerde kullanacağız.

Bu prosedürü, sitlerin izolasyonuna ek olarak, belirli zaman noktalarındaki embriyoları izole etmek için de kullanmak isteyebilirsiniz. Bu prosedürü video formatında görmenizi istememizin bir nedeni, oviduktun farklı kısımlarının ayırt edilmesinin oldukça zor olabilmesidir. Bu videoda, FHM medyasını enjekte edeceğiniz infundibulumu göstereceğim.

Kullanacağınız diseksiyon araçları, iki set keskin pens ve bir çift keskin makastır. Dişiden alınan ova kanalları, 35 milimetrelik bir doku kültürü kabı içindeki FHM medyumuna yerleştirilecektir. Yumurtalar, bir mililitrelik bir şırıngaya takılı 30 milimetrelik küt uçlu bir iğne kullanılarak geri alınacak ve uc keskin bir pens ile sabitlenecektir.

FHM, sitlerin toplanması için kullanılan bir tutma ortamıdır. KSOM ise, döllenmeleri durumunda sitlerin inkübatör içinde büyümelerini sağlamak için kullanılan ortamdır. Yumurtalar ve embriyolar ovidukttan alındıktan sonra, kapiler tüpten çekilmiş bir cam transfer pipeti kullanacağız, buna bazı borular ekleyeceğiz ve bunları ağızla çekerek bir tutma ortamına aktaracağız.

Embriyoları ve yumurtaları tutmak için cam bir konkav kap kullanılır. Bunlar, daha kolay bulunmaları için ayrı bölmelerde olacak şekilde her bir konkav daireye yerleştirilebilir. Bu düzenek, yağ kullanılmadan bir CO2 inkübatörüne yerleştirilebilmesi için bu kabın içerisine konur.

Kullanılan medyuma bağlı olarak, FHM medyumunun veya KSOM'un üzerine, tabana su konularak musluk kapatılır ve sıvı yerinde tutulur. Kılların uzaklaştırıldığından emin olmak için %70 etanol kullanılır. Karın bölgesine küçük bir kesi ve karın boşluğuna bir insizyon yapılır.

Karın bölgesini açığa çıkarmak için yapılan kesiyi genişleteceğiz. Rahim görünür olduğunda, bağırsakları kenara çekeceğiz; böylece rahim hemen aşağıda kalacaktır. Rahim Y şeklindedir ve rahim kısımlarını dikkatle ayıracağız.

Kesildiğinde, ovidukt spagettiye benzer. Oviduktun bir kısmını almaya çalışacağım. UCT'yi ve yağla çevrili olan yumurtalıkların bir kısmını alacağım.

Diğer taraf da alınacak. Bu noktada, tekrar, yumurtalığı veya rahimi kaldıracağız. Buradaki rahimi kaldırın, bağlantı noktasının altından kesin. Vid kanalları bu aşamada bulunur.

OV overinin bir kısmını yanımıza alacağım. Bu kısım daha sonra besiyerine yerleştirilecek. Uterus hâlâ kasılıyor.

Uterus düz kastan oluşur, bu nedenle vücuttan ayrılmış olsa bile nöronlar hala ateşlenmeye devam eder. Uterus burada gösterilmiştir. OV kanalı spagettiye benzerken ve yumurtalık bunun üzerindeyken, OV kanalı aslında yumurtalığa bağlı değildir.

Şu an için yumurtalığın sadece bir kısmını göstermiş olsak da, 30 gauge küt uçlu iğneyi tuttuğum baskın elim sağ elimdir. Bunu, in fibula'yı izole etmek için bir penset gibi kullanıyorum. İzoleme işlemi tamamlandıktan sonra, küt uçlu iğneyi in fibula'ya yerleştireceğim ve uterustan dışarı akacak bir miktar sıvı enjekte edeceğim.

Sol elimle keskin forseps tutuyorum. Bu, fibula içindekileri izole etmek ve her şeyi yerinde tutmak için kullanılır. Am dula, burada izole edilen trompet şeklinde bir yapıdır.

İğnemin ucu, doku tabakasının arasından geçen fibulada. Tamam. Tüm embriyoları ve yumurtaları izole ettiğimden emin olmak için, rahmi bir diş macunu tüpü gibi sıkmayı tercih ediyorum. Yağ yastıkçıklarına odaklandığınızda, mükemmel şekilde simetrik görünen yağ damlacıklarına benzer yapıları ararsınız.

Şu an tam olarak o uzun yağın solunda bir tane var. Bu tek bir yumurta. Yapacağım şey, ağız pipetiyle yumurtayı alıp, yumurtaları izole edebilmemiz için biraz daha tutma besiyerine koymak.

Bugün size dişi üreme sisteminden hücrelerin nasıl izole edileceğini gösterdim. Ayrıca, oviduktin farklı yapılarını da gösterdim. Özellikle, FHM medyumunu enjekte edebileceğiniz tek yapı olan infundibulumu inceledik.

30 gauge bir iğne ile işlemi gerçekleştiriyorum. Bu teknikle, dişinin üreme yolunda bulunan sitositleri ve varsa embriyoları izole ettim. Bunları gen ekspresyon çalışmaları veya transgenik çalışmalar için kullanabilirim.