Name: Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-02T17:57:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin fare koku duyu nöronlarının elektroolfaktogram kaydı yöntemini, nemlendirilmiş hava akışı ve elektrot yerleştirme teknikleri kullanarak. Bu protokol koku epiteli düzeyinde fonksiyon analizi için güvenilir bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr. Yijun Song ve üyeleri, tavsiye ve yardım için Johns Hopkins Üniversitesi Biyoloji Bölümü Hattar Kuruvilla Zhao tri-lab teşekkür ederim. NIH hibe DC007395 ve DC009946 tarafından desteklenir.

Bölüm 1. EOG kayıt kurulum Kayıt cihazları, kayıt elektrodu, referans elektrodu, hava teslim tüp numune aşama, ve diseksiyon mikroskobu, bir Faraday kafesi içinde bir hava masaya demirlemiş oluşur. Mikromanipülatörler, Elektrotların yerleştirilmesi ve hava teslim tüp kullanılır. Sürekli bir hava akımı, hava teslimat tüp aracılığıyla ve örnek üzerinden geçirmeden önce nemi eklemek için distile su ile kabarmış. Sylgard 6-8 mm derinliğe kadar dolu bir 60 mm kültür çanak örnek için bir montaj yüzeyi olarak kullanılır. Bir kuyu ve bir kanal elektrikle modifiye Ringer solüsyonu ile numune referans elektrot bağlamak için bir araç sağlamak için montaj çanak Sylgard oyulmuştur. Kayıt elektrot ve referans elektrot bir amplifikatöre bağlı. Amplifikatör gelen sinyaller bir bilgisayar sonra sayısallaştırıcı gönderilen ve. Axograph veya pClamp Yazılım stimülasyon protokolü kontrol etmek için sinyal kayıt ve yanıtları sonraki analiz için kullanılabilir. Amplifikatör sonra bağlı bir osiloskop kayıt elektrot yerleştirerek elektrik potansiyeli gerçek zamanlı izleme ve EOG kayıtları sırasında uygun olabilir. Odorant uyaranlara teslimi sinyal alımı için kullanılan aynı bilgisayara bağlı bir Picospritzer tarafından kontrol edilir. Picospritzer hava basıncı 10 psi ayarlanır. Tek bir hava tankı ve regülatör hava masa ve Picospritzer her iki hava besleme için kullanılabilir. Ikinci bir hava tankı ve regülatör, bu daha düşük bir basınç ve hava akımı büyük miktarda gerektirdiği gibi, nemlendirilmiş hava akışı için hava sağlamak için kullanılır. Hemen önce bir odorant uyaran teslim Picospritzer çıkışı bir odorant şişe bağlanır. Odorant şişesi sonra hava teslim tüpüne bağlı. Bölüm 2: elektrotlar hazırlanması Kayıt elektrot çekti cam kapiller modifiye Ringer çözeltisi (135 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM CaCl 2, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM Hepes, pH 7.4, filtre steril) ile dolu bir chlorided gümüş tel. Referans elektrot, chlorided gümüş tel. <ol><li> Elektrot tutucu içine gümüş tel yükleyin. Kayıt elektrodu için, 1-2 santimetre tel elektrot tutucu ucundan dışarı çıkmalıdır. Daha fazla tel referans elektrot için bırakılabilir. </li><li> AgCl kat gümüş tel eklemek için 0,1 M NaCl tel konumu ve elektrot tutucu bir 1,5-9 V DC güç kaynağının pozitif terminaline bağlayın. Elektriksel güç kaynağı negatif terminaline 0,1 M NaCl çözeltisi bağlı olmalıdır. 10 dakika boyunca devam chloriding reaksiyon izin verin. Kayıt ve referans elektrot arasındaki herhangi bir statik yükü eşitlemek için, kısaca kayıt cihazları bunları yüklemeden önce elektrotlar birbirine dokunacak. </li><li> Bir bardak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak kapiller çekin. Kapiller ucunda açılış çapı 5-10 mikron civarında olmalıdır. </li><li> Kılcal künt ucu, gümüş tel ~ 2 cm daha uzun, böylece skoru ve koparak bir elmas kalem kullanın. Yangın lehçe bütan meşale ile kesme ucu. </li><li> Modifiye Ringer solüsyonu% 0.5 'lik agaroz eritin. Elektrodun ucu bir transfer pipet kullanarak içine küçük bir miktar erimiş agaroz çözüm çekin. </li><li> Şekilde modifiye Ringer solüsyonu (bu amaç için yararlı ısıtılır ve uzun ince bir sonu var çekti bir şırınga) ile yaklaşık 1 / 2 çekti kılcal doldurun. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için yavaşça kılcal fiske. Kullanılmak üzere hazır olana kadar dolu elektrot alt modifiye Ringer çözüm küçük bir miktar ile bir kavanozda saklayın. Bir doku örneği hazırlanmış ve kayıt için hazır sonra, kayıt elektrot teli üzerinde bir dolu kılcal yükleyin. </li></ol> Bölüm 3: odorant çözümler hazırlanması Koku amil asetat ve heptaldehyde büyük tepkiler uyandırmak ve böylece EOG uyarıcılar olarak iyi seçimler. <ol><li> Mikrosantrifüj tüplerde, dimetil sülfoksit (DMSO) odorant dilüsyonları bir dizi hazırlamak. Bir doz-yanıt eğrisi için bir başlangıç ​​noktası olarak, 5 M 5 ila 10 kat dilüsyonlarının hazırlamak x 10 -6 M. Solüsyondan her gün yapın. </li><li> Ayrıca silikon tıpa ile 2 gram şişelerde 4.9 mL su ile DMSO 100 mcL seyreltilmiş hisse karıştırılarak suda 50 kat koku sulandırmak. Çözümleri, en az 30 dakika şişelerde muvazene edelim. Her şişe koku maddesi buhar konsantrasyonu bilinmeyen olduğunu unutmayın, ancak sıvı faz koku konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak değişecektir. </li><li> P silikon tıpa ile iki adet 18 gauge iğne takınrovide giriş ve çıkış portları. Şişe kullanımda değilken portlar takılmalıdır. </li></ol> Bölüm 4: EOG ve analiz veri kaydetme <ol><li> Kurban dekapitasyon tarafından takip CO 2 ötenazi veya anestezik doz aşımı bir fare. Kafatası örten deri çıkarın ve sagittally orta hat boyunca baş iki eşit parçaya böler. </li><li> Montaj çanak, başın bir yarısında, iç tarafa monte edin. Konkalar maruz septum dikkatlice çıkarın. </li><li> Doku ile kayıt aşamasında monte edilmiş çanak yerleştirin. Konkalar kayıt konumu mikroskop altında merkezli olduğu için, sahne aynı hizaya getirin. </li><li> Konka yüzey nemlendirilmiş hava hava tankı üzerine çevirin. Pozisyon hava teslim tüp böylece kayıt yerden yaklaşık 10 mm uzaklıkta. Akış hızı ~ 600 ml / dak. </li><li> Low-pass filtre, 1 kHz ve 100X kazandıracağı DC modu (AC amplifikasyon EOG sinyali eserler neden olacaktır) amplifikatör ayarlayın. </li><li> Mikromanipülatörler Mount kayıt ve referans elektrotlar. </li><li> Montaj çanak kuyuya referans elektrot Alt ve doku elektrikle bağlı olduğu gibi modifiye Ringer solüsyonu ile kapatın. </li><li> Konka IIb veya III yüzeyine kayıt elektrot dikkatlice düşük. Elektrot ancak olfaktör epitelin yüzeyine dokunmayın! Elektrot epitel ile temas söz konusu olduğunda (örneğin bir elektrik devresi tamamlar) düz bir taban osiloskop görünecektir. </li><li> Odorant şişe hava teslim tüp yan bağlantı noktasına takın. </li><li> Bilgisayarda, bir stimülasyon protokolü başlatın. Veri elde etmek için örnekleme oranı, 2 kHz veya daha yüksek olmalıdır. Yazılım bir koku darbe tetikleyebilir ve kayıt başlayacaktır. </li><li> Tipik bir stimülasyon protokolü 100 msn bakliyat 1 sn aralığı ile ayrılmış eşleştirilmiş 100-msn süre tek darbe, ya da 10 saniye sürekli darbe olabilir. </li><li> Protokolleri arasındaki doku minimal adapte bu yüzden biraz zaman tanıyın. Bir dakika amil asetat ve 10 -3 M heptaldehyde sıvı konsantrasyonları için yeterli olur; yüksek konsantrasyonlarda az 5 dakika izin verir. Yüksek koku konsantrasyonu (sonunda bir doz-yanıt eğrisi gibi) teslim ettikten sonra artık koku tüp içinde kalabilir. % 95 etanol ile yıkayın ve hava tüpü ek doku örnekleri ile devam etmeden önce kuru. </li><li> Axograph yazılımı EOG sinyali önemli parametreleri ölçmek için araçları sağlar. Bu parametreleri yanıtı genlik, latans zirve zamanı ve fesih zaman sabitleri içerir. Bu, dijital daha fazla analiz önce 25 Hz'de izlerini filtre istenebilir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. EOG analiz için Parametreler. EOG çeşitli parametreleri yanıtı genlik, latans (uyaran uygulanan ve yanıt başlar arasındaki zaman), yükselme zamanını (başlangıcı arasındaki süre de dahil olmak üzere, fareler arasında karşılıklar karşılaştırma, özellikle yararlı tepki ve pik), tepe (stimülasyon başından itibaren yanıt zirvesine zaman) ve sabit fesih süresi (τ, tek bir üstel denklem yanıt çürüme aşamasında uygun belirlenen .) , Gecikme, yükselme zamanı, ve sabit bir zaman fesih olarak kinetik parametrelerin karşılaştırılması için, bu analizden önce tepkilerin tepe genlik normalleştirmek için tavsiye edilir. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Temsilci farklı stimülasyon protokolleri altında sinyalleri EOG uyarılara yanıt olarak bir fare EOGs (a) Örnekler amil asetat artan konsantrasyonları ile. Panelin üst kısmında siyah bir çizgi odorant stimülasyon zamanlaması ve süresi gösterir. Efsaneye konsantrasyonları sıvı solüsyon konsantrasyonlarının. (B) Bir doz-cevap ilişkisi beş farelerden alınan ortalama. Hata çubukları,% 95 güven aralığı. Tepe genlik azalması, sık sık, çok yüksek kokusu konsantrasyonlarda görülmektedir. (C), eşleştirilmiş bir darbe stimülasyonuna yanıt olarak bir EOG bir örnek. Odorant tek bir kısa pulse birkaç saniye süren adaptasyon ortaya çıkarır. (D) 10 sn yanıt EOG bir örnek odorant stimülasyon sürdürmüştür. EOG sürekli odorant sunum sırasında duyarsızlaştırma gösterir.

<ol><li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).</li>
<li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroolfactogram%3A+a+review+of+its+history+and+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li>
<li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li>
<li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+in+G%28olf%29+are+anosmic%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li>
<li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li>
<li>Munger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2%2B-calmodulin-dependent+odor+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li>
<li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li>
<li>Buiakova, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+marker+protein+%28OMP%29+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li>
<li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+chloride+accumulation+in+olfactory+epithelium+of+mice+lacking+NKCC1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1.</a> J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).</li>
<li>Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+CNG+channel+desensitization+by+Ca2%2B%2FCaM+via+the+B1b+subunit+affects+response+termination+but+not+sensitivity+to+recurring+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation.</a> Neuron. 58, 374-386 (2008).</li>
<li>Cygnar, K. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li>
<li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+%22IP%283%29-odors%22%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li>
<li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li>
<li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li>
<li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li>
</ol>

Fare, Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan yöntemler ile ele ve ötenazi uygulandı.

Bu protokol açıklanan kurulum ile olfaktör epitel yüzeyinde odorant uyaranlara, tam odorant konsantrasyon ve dinamikleri bilinmiyor olsa bile, vahşi tip ve mutant fareler arasında karşılaştırma sağlayan doku hazırlıkları arasında tutarlı olacaktır. Çeşitli faktörler, özellikle kayıt yeri ve nemlendirilmiş hava akış hızı, EOG değişimler neden olabilir. Bakım benzer konumlarda aynı konka varyasyonu en aza indirmek için kayıt alınmalıdır. Bu başın aynı tarafında sürekli kayıt ve mikroskop, koku teslim tüp, ve doku örnekleri arasında hava tablo değişmeden üzerinde mikromanipülatörler ayak izi tutarak kolayca elde edilebilir. Buna ek olarak, aşırı doku diseksiyonu sonra kurumasını önlemek için doku örnekleri hemen nemlendirilmiş hava akışı içine yerleştirilmiş olmalıdır. Fareler üzerinde EOG kayıtları da 7, 14, 15, ya da baş zedelemeden ve konkalar 16, 17 üzerinde delinmiş küçük bir delik içine elektrod ekleme konkalar hazırlanan fare üzerindeki sıvı perfüzyon aparatı ile yürütülen olabilir . Her varyasyon EOG kayıt kendi güçleri vardır: Bu protokol açıklandığı gibi doku hazırlıkları hava fazlı kayıtları az miktarda bir kurulum gerektirmez ve yapmak kolay; bir sıvı perfüzyon cihazları kullanırken kayıtları farmakolojik reaktiflerin kullanımını kolaylaştırmak karşın birçok koku hidrofobik doğa koku teslim zordur; son olarak, kafa sağlam olduğu kayıtları &#39;yapay sniff&#39; deneylerde kullanılabilir, elektrot yerleştirme konkalar tam maruz kaldığında daha zor olmasına rağmen.

<table><tbody><tr><td>Hava iletim tüpü</td><td>ekipman</td><td>Özel Yapım</td><td></td><td>T-adaptörlü 1 mL'lik bir şırınga gövdesi alternatif olarak kullanılabilir</td></tr><tr><td>Hava masası</td><td>ekipman</td><td>Newport Corp.</td><td>LW3030B-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>ekipman</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-301</td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar ve Veri Toplama Yazılımı</td><td>ekipman</td><td>Apple Macintosh üzerinde Axograph 4.9.2</td><td></td><td>Mac OS X ve Windows için Axograph'ın güncellenmiş versiyonları http://axographx.com/ adresinden temin edilebilir.</td></tr><tr><td>Bütan pürmüzü</td><td>ekipman</td><td></td><td></td><td>A cr&amp;#232;me br&amp;#251;l&amp;#232;Meşale düzgün çalışıyor</td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı</td><td>ekipman</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>ekipman</td><td>Scienscope</td><td>SSZ</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot tutucu</td><td>ekipmanlar</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1021</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Tutucu Düzenekler (12 mm)</td><td>ekipman</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatörler</td><td>ekipman</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Çekici</td><td>ekipman</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>ekipmanlar</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>ekipman</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikon tüp</td><td>ekipman</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Numune tablası</td><td>ekipman</td><td>Özel Yapım</td><td></td><td>Montaj kabını yükseltmek için herhangi bir küçük katı nesne kullanılabilir. Kabı modelleme kili ile sabitleyin.</td></tr><tr><td>18 gauge iğneler</td><td>materyal</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>2 oz. cam şişeler</td><td>materyal</td><td>VWR international</td><td>16152-201</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal borular</td><td>materyal</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-6</td><td></td></tr><tr><td>16D boyutunda silikon tıkaçlar</td><td>materyal</td><td>Kimya Gereçleri</td><td>D1069809</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş tel</td><td>materyal</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>SylGuard 184</td><td>materyal</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>World Precision Instruments'tan</td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Amil asetat</td><td>reaktif</td><td>Aldrich</td><td>W504009</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Heptaldehit</td><td>reaktif</td><td>Aldrich</td><td>H2120</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+6S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>reaktif</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>akışölçer</td><td>ekipman</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GF-2260</td><td></td></tr></tbody></table>

hava-faz electroolfactogram kayıt fare koku duyu nöronlar analizi yanıtları

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Hayvanlar, gıda kaynakları bulma predatör kaçınarak, çiftleşme ve diğer sosyal etkileşimler conspecifics tespit gibi birçok kritik davranışları, koku bağlıdır. Electroolfactogram (EOG) kayıt koku epiteli seviyesinde tahlil koku alma işlevi, bilgilendirici yapmak için, kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Kurbağa 1 Ottoson tarafından EOG açıklamasını, 1956 yılından bu yana, EOG kayıt semender, tavşan, sıçan, fare, ve insanlar (Scott ve Scott Johnson, 2002, ref. 2) dahil olmak üzere pek çok omurgalıların tatbik edilmiştir. Farelerde genetik modifikasyon son gelişmeler knock-out koku alma fonksiyonu fizyolojik karakterizasyonu EOG kayıt ilgi başlattı ve fareler-vurmak var. , Koku alma sinyal iletimi bileşenleri 3-8 merkezi bir rol göstermek için, ve daha yakın zamanda 9-12 OSN yanıtları bazı düzenleyici mekanizmaların katkısı karakterize EOG kayıtları başarıyla uygulanmıştır . Odorant algılama kirpikler akar ve membran 13 depolarizes bir akım üreten bir sinyal iletimi kaskad iyon kanallarının açılması için neden OSNs, kirpikler olfaktör epitelin yüzey oluşur. EOG negatif potansiyel kayıt alan 2 ayrı duyarlı OSNs kaynaklanan potansiyel değişikliklerin bir toplamı sonucu, üzerine koku epiteli yüzeyinde odorant stimülasyon ekstraselüler kaydedildi. EOG genliği ve kinetik karşılaştırılması ve böylece genetik modifikasyon ve diğer deneysel manipülasyonlar koku OSN yanıt altında yatan moleküler sinyalizasyon nasıl etkilediğini hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada fare koku alma konkalar bir hazırlık bir hava faz EOG kayıt açıklar. Kısaca, fare ödün sonra, koku konkalar orta hat boyunca baş bisecting ve septum çıkarmadan maruz kalmaktadır. Konka hazırlık sonra kayıt kurulum yerleştirilir ve bir kayıt elektrot medial konkalar olfaktör epitelin yüzeyine yerleştirilir. Referans elektrot, elektriksel bir tampon çözelti ile dokusuna bağlıdır. Epitel yüzeyi nemli tutmak için sürekli bir nemlendirilmiş hava akımı üzerine üflenir. Odorant çözümleri buharı epitel uyarmak için nemlendirilmiş hava akışı içine şişirilmiş. Yanıtları kaydedilir ve daha fazla analiz için sayısallaştırılmış.

Electroolfactogram (EOG) kayıt koku epiteli düzeyinde koku alma fonksiyonu değerlendiren bir bilgilendirme yapmak için kolay ve güvenilir bir yoldur. Bu protokol bir kayıt kurulum, fare doku hazırlanması, veri toplama ve temel veri analizi açıklar.

Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Hayvanlar; besin kaynaklarını bulmak, yırtıcılardan kaçınmak ve çiftleşme ile ... için türdeşlerini tanımlamak gibi birçok kritik davranış için koku alma duyusuna bağımlıdır.

Koku epitelinin bir preparatı bir kaba monte edilir ve nemlendirilmiş bir hava akımına yerleştirilir. Bir diseksiyon mikroskobu altında, bir referans elektrot, bir tampon çözelti aracılığıyla dokuya elektriksel olarak bağlanır. Bir kayıt elektrodu ise koku epitelinin yüzeyine yerleştirilir.Olfaktör epitel, nemlendirilmiş bir hava akımı içine verilen ve odorantları olfaktör epitelyuma taşıyan, bilgisayar kontrollü odorant püskürtmeleri ile uyarılır. EOG sinyalleri, bir amplifikatör ve dijitalleştirici aracılığıyla kayıt bilgisayarına iletilir. Merhaba, ben Johns Hopkins Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki Hijyen XO Laboratuvarı'ndan Catherine Ciar.Bugün sizlere farelerden elektro-olfaktogram kaydetme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda koku duyusu duyusal nöronlarının kokulara verdiği yanıtları incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Kayıt düzeneği; bir kayıt elektrodu, referans elektrodu, hava iletim tüpü, numune tablası ve bir Faraday kafesi içindeki hava tablasına sabitlenmiş bir diseksiyon mikroskobundan oluşmaktadır. Elektrotların hava iletim tüpüne yerleştirilmesi için mikro manipülatörler kullanılır. Sürekli bir hava akımı, hava iletim tüpünden ve numunenin üzerinden geçmeden önce nem eklemek amacıyla distile su içinden kabarcıklar halinde geçirilir.Numune için montaj yüzeyi olarak, altı ila sekiz milimetre kalınlığında bir adaptasyon tabakasıyla doldurulmuş 60 milimetrelik bir kültür kabı kullanılır. Montaj kabındaki bu koruyucu tabakanın içerisine bir kuyu ve bir kanal oyulur. Bu işlem, modifiye edilmiş ringer çözeltisi aracılığıyla referans elektrodun numuneye elektriksel olarak bağlanmasını sağlamak amacıyla yapılır.Kayıt ve referans elektrotları bir amplifikatöre bağlanır. Amplifikatörden gelen sinyaller bir dijitalleştiriciye ve ardından bir bilgisayara gönderilir. Stimülasyon protokolünü kontrol etmek, sinyali kaydetmek ve yanıtları analiz etmek için XI grafik yazılımı kullanılır.Kayıt elektrodu yerleştirilirken ve EOG kayıtları sırasında elektriksel potansiyeli gerçek zamanlı olarak izlemek için amplifikatörden sonra bir osiloskop bağlanır. Koku uyaranlarının verilmesi, koku uyaranı verilmeden hemen önce sinyal toplama için kullanılan aynı bilgisayara bağlı olan bir pico spritzer tarafından kontrol edilir.Piko spritzer çıkışı, sıvı koklayıcı içeren bir koklayıcı şişesine bağlanır. Şişe daha sonra hava iletim tüpüne bağlanır. Şimdi kayıt deneyleri için elektrotların nasıl hazırlanacağına bakalım.Kayıt elektrodu, modifiye ringer çözeltisi ile doldurulmuş çekilmiş bir cam kapiler içindeki gümüş klorür telidir. Referans elektrodu ise gümüş klorür telidir. Her iki elektrodun hazırlığına, gümüş teli elektrot tutucuya yerleştirerek başlayın.Kayıt elektrodu için, elektrot tutucusunun ucundan bir ila iki santimetre tel çıkmalıdır. Referans elektrodu için daha fazla tel bırakılabilir. Gümüş klorür kaplamasını eklemek için teli 0.1 molar sodyum klorür içine yerleştirin ve elektrot tutucusunu 1.5 ila dokuz voltluk bir DC güç kaynağının pozitif terminaline bağlayın.Güç kaynağının negatif terminali, 0,1 molar sodyum klorür çözeltisine elektriksel olarak bağlanmalıdır. Kayıt ve referans elektrotlar arasındaki statik yükü eşitlemek için klorür reaksiyonunun 10 dakika boyunca devam etmesini sağlayın. Elektrotları kayıt cihazına yerleştirmeden önce birbirlerine kısa süreliğine dokundurun.Ardından, bir mikro pipet çekici kullanarak cam bir kapiler çekin. Kapiler ucundaki açıklığın çapı yaklaşık beş ila 10 mikron olmalıdır. Kapilerin küt ucunu çizip kırmak için bir elmas kalem kullanın; böylece kapiler, gümüş telden yaklaşık iki santimetre daha uzun olmalıdır.Kesilmiş ucu ateşle cilalamak için bir bütan pürmüzü kullanın ve ardından modifiye Ringer çözeltisi içindeki %0,5 agros'u eritin. Isıtılıp çekilerek uzun ve ince bir uç haline getirilmiş bir şırınga yardımıyla, transfer pipeti kullanarak küçük bir miktar erimiş agro çözeltisini elektrodun ucuna çekin. Çekilmiş kılcal boruyu yaklaşık yarıya kadar doldurun.Modifiye ringer çözeltisi ile kılcal boruyu, hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe vurun. Doldurulmuş elektrodu, kullanılmaya hazır olana kadar tabanında az miktarda modifiye ringer çözeltisi bulunan saklama kavanozunda muhafaza edin. Bir doku örneği hazırlandığında ve kayıt için uygun hale geldiğinde, doldurulmuş kılcal boruyu, elektrotlar hazır durumdayken kayıt elektrodu telinin üzerine yerleştirin.Kayıt hazırlıklarına başlamak için bir kayıt deneyine göz atalım. Kurban edilen bir farenin kafatasının üzerindeki deriyi çıkarın ve başı orta hat boyunca ikiye bölün; başın bir yarısını medial tarafı yukarı gelecek şekilde montaj tabağına yerleştirin. Turbinatları açığa çıkarmak için septumu dikkatlice çıkarın.Montajı yapılmış dokunun bulunduğu kabı kayıt aşamasına yerleştirin. Turbinatlar üzerindeki kayıt konumunun mikroskobun altında ortalanacak şekilde aşamayı hizalayın. Şimdi, turbinat yüzeyine dakikada yaklaşık 600 milliliters hızında nemlendirilmiş hava sağlamak için hava tankını açın.Hava iletim tüpünü, kayıt konumundan yaklaşık 10 milimetre uzaklıkta olacak şekilde konumlandırın. Amplifikatörü DC moduna ayarlayın, çünkü AC amplifikasyonu EOG sinyalinde artefaktlara neden olacaktır. Bir kilohertz değerinde düşük geçiren filtre ve 100 x kazanç ile kayıt yapın.Şimdi kayıt ve referans elektrotlarını mikro manipülatörlere monte edin. Referans elektrodunu montaj kabındaki kuyucuğun içine indirin ve dokuyla elektriksel olarak bağlantılı olacak şekilde modifiye ringer çözeltisi ile kaplayın. Kayıt elektrodunu dikkatlice turbinate iki B veya üçün yüzeyine indirin.Elektrot, olfaktör epitelyumun yüzeyine hafifçe değmelidir. Elektrot epitelyumla temas ettiğinde, osiloskopta düz bir temel çizgi belirecektir. Şimdi, bilgisayardaki hava iletim tüpünün yan portuna bir koku şişesi takın.Bir stimülasyon protokolü başlatın. Veri toplama için örnekleme hızı iki kilohertz veya daha yüksek olmalıdır. Yazılım, bir koku pulsunu tetikleyecek ve kayda başlayacaktır.Tipik bir stimülasyon protokolü; 100 milisaniye süreli, tekli pulse eşli, bir saniyelik aralıklarla ayrılmış 100 milisaniyelik pulslar veya on saniyelik sürekli bir pulse şeklinde olabilir. Adaptasyonu minimize etmek için, yüksek koku konsantrasyonları uygulandıktan sonra protokoller arasında bir ila beş dakika bekleyin. Tüpte kalıntı koku kalabilir; ek doku örnekleriyle devam etmeden önce hava tüpünü %95 etanol ile yıkayın ve kurulayın.Axo graft yazılımı, EOG sinyalinin temel parametrelerini ölçmek için araçlar sağlar. Bu parametreler arasında yanıt genliği, latans, zirveye ulaşma süresi ve sonlanma zaman sabitleri yer alır. EOG'nin yanıt genliği, latans yükselme süresi, zirveye ulaşma süresi ve sonlanma zaman sabiti dahil olmak üzere çeşitli parametreleri, fareler arasındaki normalize edilmiş yanıtların karşılaştırılması için özellikle yararlıdır.Burada, artan konsantrasyonlardaki sıvı amil asetat stimülasyonuna yanıt olarak bir fareden elde edilen OG'ler gösterilmektedir. Üstteki siyah çizgi, odorant stimülasyonunun zamanlamasını ve süresini belirtmektedir. Burada, beş fareden ortalaması alınmış bir doz-yanıt ilişkisi görülmektedir; hata çubukları %95 güven aralıklarını temsil etmektedir.Çok yüksek koku konsantrasyonlarında genellikle pik amplitüdünde bir azalma gözlenir. Eşleşmiş pulse stimülasyona yanıt olarak verilen bir EOG örneğinde, tek bir kısa odoran pulse'unun birkaç saniye süren bir adaptasyona yol açtığı görülmektedir. Burada, 10 saniyelik sürekli odoran stimülasyonuna yanıt olarak alınan bir EOG gösterilmiştir.EOG, sürekli koku sunumu sırasında duyarsızlaşma gösterir. Farelerden elektrot faktör gramının nasıl kaydedileceğini az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, elektrodun sadece epitelyum yüzeyine yerleştirilmesi gerektiğini ve elektrodun yüzeyin altına nüfuz etmemesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.Varyasyonu minimize etmek için her zaman başın aynı tarafından kayıt yapın ve kurulumda değişikliklerden kaçının; dokuyu nemli tutun ancak sıvı damlacıkları birikmesine izin vermeyin. Diseksiyondan hemen sonra dokuyu nemlendirilmiş havaya yerleştirmek, dokuyu kayıt için en iyi durumda tutacaktır. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Multielectrode array (MEA) kayıtları nöronların büyük nüfus elektriksel aktivite eğitimi için bir yöntem sağlar. Burada, aynı anda doku uyarıcı fare vomeronasal epitel kayıt MEA hazırlanması ayrıntılar mevcut.

Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Böcek koku alma sistemleri electroantennograms (EAG) ve anteni bulunan tüm odorant reseptör nöronları (ORNs) ve bireysel ev sahipliği bu yanıtları toplanır tek sensillum kayıtları (SSR), formları kayıt odorant indüklenen yanıtları için eşsiz fırsatlar sunmaya sırasıyla sensilla.

Güve Koku Sistemi Elektrofizyolojik Ölçümler

Bu makale, fareler koku ampulün yüzeyi harita koku uyarılmış faaliyetleri içsel optik sinyalleri ve flavoproteins otofloresans sinyallerini görüntüleme protokolleri sunar.

Optik Yansıtma ve Otofloresans Sinyalleri kullanarak, Fare Koku Ampul Görüntüleme Koku-Uyarılmış Etkinlikler

Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.

Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Meyve sinekleri karmaşık bir koku alma sistemine sahiptir, yüzlerce koku maddesini ayırt edebilir ve davranışsal kararları yönlendirmek için koku alma duyularını kullanabilirler. Bu video, sineklerde koku alma davranışsal tepkilerini incelemek için bir yöntem olan dört olfaktometre testini açıklamaktadır. Öne çıkan protokol klibi, test sineklerinin nasıl ele alınacağını ve testi gerçekleştirirken kritik adımların neler olduğunu gösterir.

Dört Olfaktometre Testi: Drosophila'da Koku İşaretli Tepkileri Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu video, farelerde koku alma duyusal nöronlarının (OSN'ler) delikli bir yama kelepçesi tekniği kullanılarak elektrofizyolojik kaydını göstermektedir. Florofor etiketli koku reseptörlerine sahip OSN'leri içeren koku alma epiteli, bir fareden izole edilir ve bir kayıt odasında sabitlenir. Bir kayıt pipeti, bir OSN'nin dendritik topuzuna kenetlenir ve pipet içindeki nistatin, hücre ile elektriksel bağlantı oluşturmak için zarı deler. Son olarak, bir koku uyarıcısı vermek için başka bir pipet...

Farelerde Koku Alma Duyu Nöronlarının Delikli Yama-Kelepçe Kaydı

Biz omurgasız koku yolunun ilk üç aşamada koku-uyarılmış yanıtlar karakterize etmek ekstraselüler çoklu ünite kayıt tekniği varyasyonları göstermektedir. Bu teknikler kolayca başka sinir sistemlerinin topluluk etkinliği incelemek için adapte edilebilir.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Burada, 100'e kadar sirke sineğinin (Drosophila melanogaster) koku alma tepkilerini test etmek için bir davranış kurulumu ve veri analizi yöntemini açıklıyoruz. Bu sistem, tek veya çoklu koku uyaranlarıyla kullanılabilir ve nöronal alt kümelerin optogenetik aktivasyonu veya susturulması için uyarlanabilir.

Of Bilgisayar İzleme tarafından Analiz Edilmiş Olfaktor Davranışlar<em&gt; Drosophila</em&gt; Dört kadranda olfactometer içinde

Koku sinirinden ekstrasellüler çok üniteli kayıt, deniz balıklarında koku alma hassasiyetini değerlendirmek için hassas, sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Birincil duyusal girişi kaydeder ve dış tuzluluktan bağımsızdır.

Teleostların Koku Sinirinden Ekstrasellüler Çok Birimli Kayıt

Bu protokol, ol/gitme koku alma davranışı deneyleri için bir olfaktometrenin yapımını açıklar. Olfaktometrenin başarılı bir şekilde oluşturulmasını sağlamak için resimlerle birlikte adım adım talimatlar sağlanmıştır. İşlem sırasında karşılaşılan sorunların giderilmesine yönelik bilgiler de dahil edilmiştir.

Kemirgen Koku Alma Davranışı Çalışmaları için Bir Olfaktometre Oluşturma

Öğrenin fare koku duyu nöronlarının elektroolfaktogram kaydı yöntemini, nemlendirilmiş hava akışı ve elektrot yerleştirme teknikleri kullanarak. Bu protokol koku epiteli düzeyinde fonksiyon analizi için güvenilir bir araçtır.

Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Daha fazla video keşfet