Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Koku alma epitelinin bir preparasyonu bir tabağa monte edilir ve bir nemlendirilmiş hava akımına yerleştirilir. Diseksiyon mikroskobu altında, bir referans elektrot, bir tampon çözeltisi aracılığıyla dokuya elektriksel olarak bağlanır. Koku alma epitelinin yüzeyine bir kayıt elektrodu yerleştirilir.

Koku alma epiteli, koku maddelerini koku alma epiteline taşıyan bir nemlendirilmiş hava akımına uygulanan bilgisayar kontrollü koku verici ponponlar tarafından uyarılır. EOG sinyalleri, bir amplifikatör ve sayısallaştırıcı aracılığıyla kayıt bilgisayarına iletilir. Merhaba, ben Johns Hopkins Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki XO Hijyen Laboratuvarı'ndan Catherine Ciar.

Bugün size farelerden elektro olf facto gramı kaydetmek için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, koku alma duyu nöronlarının kokulara verdiği tepkileri incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Kayıt aparatı, tümü bir Faraday kafesi içindeki bir hava tablasına sabitlenmiş bir kayıt elektrotu, referans elektrotu, hava dağıtım tüpü, numune aşaması ve diseksiyon mikroskobundan oluşur. Mikrom manipülatörleri, elektrotların hava dağıtım tüpüne yerleştirilmesi için kullanılır. Hava dağıtım tüpünden ve numunenin üzerinden geçmeden önce nem eklemek için damıtılmış sudan sürekli bir hava akımı köpürtülür.

Numune için bir montaj yüzeyi olarak altı ila sekiz milimetreye uyum sağlamak için sard ile doldurulmuş 60 milimetrelik bir kültür kabı kullanılır. Montaj çanağındaki korumadan bir kuyu ve bir kanal oyulmuştur. Referans elektrodu, modifiye edilmiş zil çözeltisi aracılığıyla numuneye elektriksel olarak bağlamak için bir araç sağlamak.

Kayıt ve referans elektrotları bir amplifikatöre bağlanır. Amplifikatörden gelen sinyaller bir sayısallaştırıcıya ve ardından bir bilgisayara gönderilir. XI grafik yazılımı, stimülasyon protokolünü kontrol etmek, sinyali kaydetmek ve yanıtları analiz etmek için kullanılır.

Kayıt elektrodunu yerleştirirken elektrik potansiyelinin gerçek zamanlı olarak izlenmesi için amplifikatörden sonra bir osiloskop bağlanır. Ve EOG kayıtları sırasında. Kodorant uyaranların iletimi, bir koku verici uyaranın iletilmesinden hemen önce sinyal alımı için kullanılan aynı bilgisayara bağlı olan bir pico spritzer tarafından kontrol edilir.

Pico spritzer çıkışı, sıvı koku verici içeren bir koku şişesine bağlanır. Şişe daha sonra hava dağıtım borusuna bağlanır. Şimdi deneyleri kaydetmek için elektrotların nasıl hazırlanacağını görelim.

Kayıt elektrodu, modifiye edilmiş zil çözeltisi ile doldurulmuş, çekilmiş bir cam kılcal damar içinde bir klorür gümüş teldir. Referans elektrot bir klorür gümüş teldir. Elektrot tutucusuna gümüş bir tel takarak her iki elektrotun hazırlanmasına başlayın.

Kayıt elektrodu için, elektrot tutucusunun ucundan bir ila iki santimetre tel çıkıntı yapmalıdır. Referans elektrot için daha fazla tel bırakılabilir. Gümüş klorür kaplamayı eklemek için kabloyu 0,1 molar sodyum klorür içine yerleştirin ve elektrot tutucuyu 1,5 ila dokuz voltluk bir DC güç kaynağının pozitif terminaline bağlayın.

Güç kaynağının negatif terminali, 0.1 molar sodyum klorür çözeltisine elektriksel olarak bağlanmalıdır. Kayıt ile referans elektrot arasındaki herhangi bir statik yükü eşitlemek için reaksiyondaki klorürün 10 dakika ilerlemesine izin verin. Elektrotları kayıt cihazına takmadan önce kısaca birbirine dokunun.

Ardından, bir mikro pipet çektirmesi kullanarak bir cam kılcal damar çekin. Kılcal damarın ucundaki açıklığın çapı yaklaşık beş ila 10 mikron olmalıdır. Kılcal damarın kör ucunu çizmek ve kırmak için bir elmas kalem kullanın, böylece gümüş telden yaklaşık iki santimetre daha uzun olur.

Ateşi parlatmak için bir bütan meşalesi kullanın, kesilen ucu şimdi modifiye edilmiş zil çözeltisinde% 0.5 agros eritin. Uzun ince bir uca sahip olacak şekilde ısıtılmış ve çekilmiş bir şırınga kullanarak az miktarda erimiş agro solüsyonu elektrotun ucuna çekmek için bir transfer pipeti kullanın. Çekilen kılcal damarı yolun yaklaşık yarısına kadar doldurun.

Modifiye edilmiş zil çözeltisiyle, hava kabarcıklarını çıkarmak için kılcal damarı hafifçe vurun. Doldurulmuş elektrodu, kullanıma hazır olana kadar altta az miktarda modifiye edilmiş zil çözeltisi ile saklama kavanozunda saklayın. Bir doku örneği hazırlandıktan ve kayıt için hazır olduktan sonra, elektrotlar hazır durumdayken kayıt elektrot telinin üzerine dolu bir kılcal damar takın.

Kayıt için doku hazırlamaya başlamak için bir kayıt deneyine bakalım. Kurban edilmiş bir farenin kafatasının üzerindeki deriyi çıkarın ve başını orta hat boyunca ikiye bölün, başın yarısını orta tarafa monte edin, medial tarafı yukarı bakacak şekilde montaj kabına yerleştirin. Konkaları ortaya çıkarmak için septumu dikkatlice çıkarın.

Tabağı monte edilmiş mendille birlikte kayıt sahnesine yerleştirin. Sahneyi, konkalar üzerindeki kayıt konumu mikroskop altında ortalanacak şekilde hizalayın. Şimdi konka yüzeyine dakikada yaklaşık 600 mililitre oranında nemlendirilmiş hava vermek için hava tankını açın.

Hava dağıtım tüpünü, kayıt konumundan yaklaşık 10 milimetre uzakta olacak şekilde konumlandırın. AC amplifikasyonu EOG sinyalinde artefaktlara neden olacağından amplifikatörü DC moduna ayarlayın. Bir kilohertz'lik düşük geçiren filtre ve 100 x'lik bir kazanç ile elde edin.

Şimdi kayıt ve referans elektrotlarını mikro manipülatörlere monte edin. Referans elektrodu montaj kabındaki kuyuya indirin ve dokuya elektriksel olarak bağlanacak şekilde modifiye edilmiş zil solüsyonu ile örtün. Kayıt elektrodunu iki, B veya üç konka yüzeyine dikkatlice indirin.

Elektrot, koku alma epitelinin yüzeyine zar zor temas etmelidir. Elektrot epitel ile temas ettiğinde, osiloskop üzerinde düz bir taban çizgisi görünecektir. Şimdi, bilgisayardaki hava dağıtım tüpünün yan bağlantı noktasına bir koku şişesi takın.

Bir stimülasyon protokolü başlatın. Veri toplama için örnekleme hızı iki kilohertz veya daha yüksek olmalıdır. Yazılım bir koku darbesini tetikleyecek ve kayda başlayacaktır.

Tipik bir stimülasyon protokolü, 100 milisaniye süreli, tek darbe eşli, bir saniyelik aralıklarla ayrılmış 100 milisaniyelik darbeler veya on saniyelik sürekli darbe olabilir. Adaptasyonu en aza indirmek için, yüksek koku konsantrasyonları sağladıktan sonra protokoller arasında bir ila beş dakika bekleyin. Tüpte kalıntı koku kalabilir, hava tüpünü %95 etanol ile yıkayın ve ek doku örnekleriyle devam etmeden önce kurulayın.

Axo greft yazılımı, EOG sinyalinin temel parametrelerini ölçmek için araçlar sağlar. Bu tür parametreler yanıt genliğini, gecikme süresini, zirveye ulaşma süresini ve sonlandırma zaman sabitlerini içerir. EOG'nin çeşitli parametreleri, yanıt genliği, gecikme artış süresi, zirveye ulaşma süresi ve sonlandırma zaman sabiti dahil olmak üzere fareler arasındaki normalleştirilmiş yanıtların karşılaştırılması için özellikle yararlıdır.

Burada gösterilenler, artan sıvı amil asetat konsantrasyonları ile stimülasyona yanıt olarak bir fareden alınan OG'lerdir. Üstteki siyah çizgi, koku uyarımının zamanlamasını ve süresini gösterir. Burada, beş fare hata çubuğundan ortalama alınan bir doz yanıt ilişkisinin %95 güven aralıkları olduğunu görüyoruz.

Tepe genliğinde bir düşüş genellikle çok yüksek koku konsantrasyonlarında gözlenir. Eşleştirilmiş bir nabız stimülasyonuna yanıt olarak bir EOG örneği, tek bir kısa koku verici nabzının birkaç saniye süren adaptasyonu ortaya çıkardığı gösterilmiştir. Burada gösterilen, 10 saniyelik sürekli koku verici stimülasyonuna yanıt olarak bir EOG'dir.

EOG, sürekli koku sunumu sırasında duyarsızlaşma gösterir. Size farelerden elektrot faktörü gramını nasıl kaydedeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, elektrodu sadece epitelin yüzeyine yerleştirmeyi ve elektrodu yüzeyin altına nüfuz etmemeyi unutmamak önemlidir.

Her zaman başın aynı tarafından kayıt yapın ve varyasyonu en aza indirmek, dokuyu nemli tutmak, ancak sıvı damlacıklarını toplamadan, dokuyu diseksiyondan hemen sonra nemlendirilmiş havanın altına koymak, dokuyu kayıt için en iyi durumda tutacaktır. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.