İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

Kısaca MSC'ler olarak adlandırılan mezenkimal kök hücreler, altı ila sekiz haftalık dişi bir rag dolly sıçandan izole edilir ve yaklaşık %80 konfluense ulaşana kadar 10 santimetrelik bir Petri kabında kültüre edilir. MSC'leri zenginleştirmek için hücreler, biotin konjuge primer antikorlarla, ardından streptavidin konjuge manyetik boncuklarla boyanır. Etiketlenen hücreler daha sonra manyetik aktive hücre ayıklama yöntemiyle negatif fraksiyon ve pozitif fraksiyon olmak üzere iki fraksiyona ayrılır.

Ardından, yüzey belirteci ekspresyonunu doğrulamak için akış sitometrisi analizi kullanılır. Son olarak, tek koloni kaynaklı MSC'ler elde etmek için klonlama silindirleri kullanılır. Merhaba, ben Michigan State Üniversitesi Kimya Mühendisliği ve Malzeme Bilimi Bölümü'ndeki Christina Chang laboratuvarından Lee.

Bugün size chy kök hücrelerinin izolasyonu ve zenginleştirilmesinin yanı sıra tek koloniden türetilmiş hücrelerin elde edilmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kırmızı kök hücrelerin proliferasyon ve diferansiyasyon davranışlarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Mezenkimal kök hücreler veya MSC'ler, altı ila sekiz haftalık dişi Sprague Dawley sıçanından izole edilecektir. Bu prosedüre başlamak için, ötanazi uygulanmış hayvanın arka bacaklarından femur ve tibia kemiklerini kesin. Deriyi ve kasları temizleyin, diseke edilen femur ve tibiaları birkaç saniye boyunca %70 izopropanol içinde bekletin ve ardından 1X DPBS'ye aktarın.

Aşağıdaki adımlar bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. İlk olarak, femur ve tibyayı DMEM içeren 10 santimetrelik bir kaba aktarın. Ardından, her bir kemiği cımbızla tutarken, iki ucu makasla kesin.

Üç mililitrelik bir şırıngaya 22 gauge iğne takın ve şırıngayı DMEM ile doldurun. İğneyi kemiğin açık olan bir ucundan içeri yerleştirin ve iliği 50 mililitrelik bir tüpe yıkayarak aktarın. Tüm ilik elde edilene kadar, her bir kemik için bu işlemi iki ila üç kez tekrarlayın.

Hücreleri yeniden süspande edin, ardından kemik kalıntılarını ve kan agregatlarını temizlemek için hücre süspansiyonunu 70 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 4 °C'de 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspirasyon yoluyla uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 25 mL MSC ekim besiyerinde yeniden süspande edin.

İki adet 10 santimetrelik kültür kabının her birine 10 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kültür kaplarını 37 degrees Celsius %5carbon dioxide inkübatörde bir ila iki hafta boyunca inkübe edin. Daha önce izole edilen sıçan MSC'ler yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaştığında, medyumu aspire edin ve her bir kaba dört ila beş mililitre tripsin EDTA ekleyin.

Kapları inkübatöre geri yerleştirin ve yaklaşık beş dakika inkübe edin. Hücrelerin ayrılmasını sağlamak için, tripsini inaktive edecek miktarda kültür medyumu ekleyin. Hücre süspansiyonlarını 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve hücreleri 4 °C'de 200 ×g hızında beş dakika santrifüj edin.

Şimdi, CD 54 ve CD 90 olmak üzere iki yüzey markörü ile MSC'lerin zenginleştirilmesini göstereceğiz. BD Biosciences'tan bir hücre ayırma mıknatısı olan BD I mıknatısı kullanın. Hücre peletini, mililitrede 20 milyon hücre olacak şekilde hücre boyama tamponunda resüspansiyon yaparak başlayın.

Ardından, hücre süspansiyonuna biotinillenmiş CD 54 antikoru ve biotinillenmiş CD 90 antikoru ekleyin ve nazikçe karıştırın; 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ettikten sonra, etiketlenmiş hücreleri fazla miktarda bir X BD IMAG tamponu ile yıkayın. Etiketlenmiş hücreleri 200 GS'de, dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüjleyin. BD imag streptavidin partiküllerini iyice vorteksleyerek hazırlayın ve ardından her 10 milyon hücre için 40 microliters partikül ekleyin.

Partikülleri işaretlenmiş hücrelerle iyice karıştırın ve hücreleri 6 ila 12 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon süresi boyunca, pozitif fraksiyonu toplamak için yuvarlak tabanlı bir test tüpünü etiketleyin. İnkübasyon tamamlandığında, işaretleme hacmini mililitre başına 20 milyon hücreye getirin.

Bir adet Expedia I mag tamponu ile. Etiketli hücreleri pozitif fraksiyon toplama tüpüne aktarın. Pozitif fraksiyon tüpünü BDI mıknatısı üzerine yerleştirin ve altı dakika boyunca bekletin.

Ardından, pozitif fraksiyon tüpü hala BDI mıknatısı üzerindeyken, süpernatanı cam bir pastör pipeti ile uzaklaştırın. Sonrasında, pozitif fraksiyon tüpünü BDI mıknatısından çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Bir mililitre buz gibi soğuk 1X BDI mag buffer ekleyin ve hücreleri nazikçe karıştırarak yeniden süspanse edin.

Tüpü tekrar BDI mıknatısı üzerine yerleştirin ve iki ila dört dakika bekletin. Süpernatantı yeni bir cam pastör pipeti ile uzaklaştırın. Yıkama işlemini daha önce açıklandığı şekilde tekrarlayın.

Bir kez daha. Son olarak, süpernatanı yeni bir cam pastör pipeti ile uzaklaştırın. Ardından tüpü BDI mıknatıs standından çıkarın.

Hücreleri bir mililitre kültür ortamında süspande edin ve hücre süspansiyonunu 25 mililitre ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri sürdürmek için 1 adet 75 santimetrekarelik flask ve akış sitometrisi için 10 santimetrelik bir kap kullanın.

Tek koloni kaynaklı MSC'leri ayırma işlemine başlamak için, hücreleri 10 santimetrelik kap başına yaklaşık 50 ila 100 hücre olacak şekilde ekleyin ve 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde bir ila iki hafta boyunca inkübe edin. Bu bir ila iki haftalık süre boyunca, iyi izole edilmiş kolonileri ters mikroskop ile inceleyin. Koloniler, her bir kolonide 100 hücreden fazla olacak yeterli büyüklüğe ulaştığında, kabın alt kısmındaki kolonileri kalıcı bir markörle işaretleyin.

İşaretlenecek bir koloni seçerken, çevresinde başka koloni bulunmadığından emin olun. Besiyerini aspire edin ve pens kullanarak plakı bir kez X-D-P-B-S ile yıkayın. Steril bir klonlama silindiri alın ve nazikçe işaretli koloninin etrafına yerleştirin.

Her işaretli koloninin üzerine bir klonlama silindiri yerleştirilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Her klonlama silindirine 100 µL tripsin EDTA ekleyin ve tabağı inkübatöre geri koyun. Beş dakika sonra, hücrelerin yuvarlaklaşıp yuvarlaklaşmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin.

Hücreler kalktığında, tripsini inaktive etmek için eşit miktarda kültür medyumu ekleyin. Hücre süspansiyonunu 200 mikrolitrelik mikro pipetle karıştırın ve hücre süspansiyonunu, üç mililitre ön ısıtılmış kültür medyumu içeren 60 milimetrelik bir kaba aktarın. Kapları etiketleyin ve plastik yüzeye yapışan hücrelerin izolasyonundan sonra tekrar inkübatöre yerleştirin.

MSC'ler ekimden sonraki gün görünür olmalıdır. Hücreler çoğalmaya devam ettikçe, konfluens aşamasındaki hücreler, çoğunluğunun iğ şeklinde veya yıldız şeklinde olduğu bu faz kontrast görüntüsündeki hücrelere benzemelidir; hücreler yaklaşık %80 konfluense ulaştığında kültürleme uygundur.

Tripsinizasyondan sonra ayrılan hücreler yuvarlak görünmeli ve besiyerinde yüzmelidir. MSC'ler manyetik hücre ayıklama ile zenginleştirildikten sonra, yüzey belirteç ekspresyonlarını doğrulamak için akış sitometrisi gerçekleştirilir. Zenginleştirme başarılıysa, hücreler MSC belirteçleri olan CD 54 ve CD 90'a karşı pozitif boyanma, HSC belirteci CD 45'e karşı ise negatif boyanma göstermelidir; negatif kontroller olarak IgG two A ve IgG one izotip kontrolleri kullanılır.

Hücreler uygun bir klonal yoğunlukta yerleştirildiğinde, bu örnekte gösterildiği gibi koloniler tekil hücrelerden gelişmelidir. Ardından kolonileri ayırmak için klonlama silindirleri kullanılabilir ve kolonilerden türetilen hücreler ayrı ayrı kültüre edilebilir. Bu iki örnekte, bir koloniden türetilen hücreler iğ şeklinde (spin alike) iken, diğer koloniden türetilen hücreler yuvarlaktır.

Böylece size rastgele ve yaygın kök hücrelerin nasıl izole edileceğini ve zenginleştirileceğini, ayrıca tek koloni türevli hücrelerin nasıl elde edileceğini gösterdik. Bu prosedür sırasında, izolasyon aşamasında kan pıhtılarından ve kemik kalıntılarından kurtulmanın önemli olduğunu unutmayın. Zenginleştirme sırasında optimal miktarda antikor kullanın ve koloni ayırma sırasında iyi izole edilmiş kolonileri işaretleyin.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.