Name: İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-22T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Öğrenin sıçan mezenkimal kök hücrelerinin manyetik hücre sıralama ile izolasyonunu ve zenginleştirilmesini. Akış sitometrisi ile yüzey belirteçleri doğrulanır ve tek koloni türetilmiş hücreler elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01GM079688, R21RR024439 ve R21GM075838), Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0.941.055) ve Mimar Sinan Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. Rat MKH izolasyonu Önceden 1'de açıklandığı gibi, 6-8 hafta eski Sprague-Dawley erkek sıçan, 2 mezenkimal kök hücreleri izole edildi. İzole MKH plastik yüzeyine yapışır ve in vitro kültür sırasında kolayca genişletebilirsiniz. <ol><li> Hayvan anestezi odasına koyun ve yaklaşık beş dakika boyunca anestezi oldu. Anestezi sırasında, yanıp sönen, solunum ve motor aktivite oranı gözlemliyoruz. Motor aktivite durur ve yanıp sönen oranı seyrek olduktan sonra hemen odasından hayvan çıkarın. </li><li> Bir operasyon istasyonunda hayvan uzanın ve servikal dislokasyon hayvan öldürmek. Arka bacaklarda femur ve tibiaları kesilmiş, cilt ve kasların çıkarın. </li><li> Birkaç saniye için% 70 izopropanol disseke femur ve tibiaları koyun ve 1X D-PBS transfer. </li><li> Biyogüvenlik kabini, femur ve tibiaları DMEM içeren bir 10cm çanak transfer edildi. Her kemik, sonra cımbız ile yapıldı ve iki ucu açık bir makas kesilmiştir. 3ml bir enjektöre 22G iğne takın ve DMEM ile doldurun, sonra kemik bir açık ucuna iğne takarak 50ml tüp içine iliği yıkayın. 2 ~ 3 kez her kemik için bu işlemi tekrarlayın. Ilikleri elde edildiğinde, hücreler tekrar süspansiyon ve kemik artıkları ve kan agrega kaldırmak için hücre süspansiyonu 70μm hücre süzgecinden geçirmek. </li><li> 200 gr az hücreleri, 4 ° C 5 dakika aşağı Spin ve aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak. 25ml MSC ortamda yeniden süspanse hücreleri (% 10 FBS ve% 1 Kalem-Strep içeren DMEM). 10ml hücre süspansiyonu, toplam iki çanak için her 10cm kültür çanak numaralı seribaşı oldu. 1 ~ 2 hafta boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör kültür kaplarında saklayın. Orta 2 ~ 3 günde bir değiştirildi. </li></ol> 2. Rat MKH zenginleştirilmesi CD54, CD90, CD73, CD105 ve CD271 3-5 da dahil olmak üzere, MKH zenginleştirmek için bir dizi yüzey proteinleri kullanılmıştır. Bu çalışmada, manyetik hücre sıralayarak MKH zenginleştirmek için işaretleyici olarak kullanılan CD54 ve CD90. <ol><li> Hücreleri confluency 80% ulaştığında, orta aspirat ve her yemek için 4 ~ 5ml tripsin-EDTA ekleyin. Bulaşıkları inkübatör geri koyun ve hücre dekolmanı izin için yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe. Hücreleri, müstakil kültür ortamı eşit miktarda tripsin inaktive edildi. 4 ° C, 5 dakika boyunca 200 gr 15ml tüp ve spin hücreleri hücre süspansiyonu toplayın. </li><li> Sonraki adımlar BD IMagnet kullanarak hücre ayrılması için kılavuzuna göre iki yüzey belirteçleri CD54 ve CD90 ile MKH zenginleştirmek için nasıl açıklar. Hücre pelet, 20 milyon hücre / ml hücre boyama tamponu (1X D-PBS içinde% 3 ısı inaktive FBS) yeniden süspanse edildi. Biotinlenmiş CD54 antikor (milyon başına 0.25μg hücreleri) ve biotinlenmiş CD90 antikor (milyon hücre başına 0.15μg) eklenir ve hücre süspansiyonu ile hafifçe karıştırılır. 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübasyondan sonra, işaretli hücrelerin aşırı 1X BD IMAG tampon hacmi ile yıkandı. Etiketli hücreler 5 dakika boyunca, 4 ° C 200g aşağı bükülmüş. </li><li> Vortex BD IMAG streptavidin parçacıkları iyice, her 10 milyon hücre 40μl parçacıkları ekleyin. Parçacık etiketli hücreleri ile iyice karıştırın ve hücrelerin ~ 12 ° C'de 30 dakika süreyle 6 inkübe. Bu streptavidin parçacıklar bağlamak için sırasıyla CD54 ve CD90 yüzey proteinlerine bağlı olduğu, biotinlenmiş anti-CD54 ve anti-CD90. </li><li> Inkübasyon süresi boyunca, olumlu bir kısmını toplamak için yuvarlak bir alt test tüpü etiket. Inkübasyondan sonra, 20 milyon hücre / ml 1X BD IMAG tampon ile etiketleme ses getirmek ve etiketli hücreleri pozitif fraksiyon toplanması tüp transferi. BD IMagnet üzerine yerleştirin ve pozitif fraksiyonu tüp kalmasına izin, 6 dakika sonra BD IMagnet hala olumlu bir fraksiyonu tüp ile bir bardak Pasteur pipeti ile süpernatant kaldırmak. </li><li> BD IMagnet pozitif fraksiyonu tüp çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. 1ml buz 1X BD IMAG tampon ve nazik karıştırılarak tekrar süspansiyon hücreleri ekleyin. Tüp BD IMagnet üzerine yerleştirin ve 2 ~ 4 dakika kalmasına izin. Yeni bir cam Pasteur pipeti ile süpernatantı. 2.5 bir kez daha açıklandığı gibi yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> BD IMagnet ve kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri, tohum hücreleri ve flow sitometri için 10cm çanak korumak için 75cm 2 balon tüp çıkarın. </li></ol> 3. Yüzey Marker İfade Sitometrisi ile doğrulanması Flow sitometri analizi ifade CD54 ve CD90 elde edilen hücreler doğrulamak için yapıldı. HSC işaretleyici CD45 MKH HKH'lerin mahrum olduklarını teyit etmek için kullanılmıştır. <ol><li> Hücreleri ~% 80 konfluent hale geldiğinde, tripsin-EDTA ile hücreleri trypsinize ve 15ml bir tüp içine hücreleri toplamak. 200g, 4 ° C 5 dakika hücreleri toplamak için santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant aspire.h kez 1X D-PBS ile hücreler. Son bir konsantrasyon 5 ~ 10 milyon hücre / ml ve buz üzerinde hücrelerin tutmak hücre boyama tampon yeniden süspanse hücreleri (1X D-PBS% 2 ve% 0.05 sodyum azid FBS içeren). (2 izotip kontrolü IgG2a;.. 3 İzotip kontrolü IgG1, 4 CD45; 5 CD54;.. 6 CD90 1 hücreleri sadece) altı etiketli tüpler içine kısım 100μl hücre süspansiyonu. </li><li> (:: 0.5μg milyon başına hücreleri; CD54: 0.25μg milyon başına hücreleri; CD90: CD45 hücreleri 20μl milyon başına IgG2a ve IgG1 0.15μg milyon başına hücreleri) uygun konsantrasyonları izotip kontrol ve primer antikor ekleyin ve 4 ° C'de inkübe 30 dakika. </li><li> 100μl hücre boyama tampon 1X D-PBS ile iki kez ve daha sonra tekrar süspansiyon hücreleri hücrelerinin yıkayın. SA-PE (streptavidin fikoeritrin milyon hücre başına 0.15μg kullanın) ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika karanlıkta. </li><li> Etiketli hücreleri 1X D-PBS ile iki kez yıkayın. 400μl hücre boyama tampon hücrelerin yeniden süspanse edin ve flow sitometri analizi için bir şahin tüp transferi. </li></ol> 4. MKH Türetilmiş Tek koloni ayrılması MKH farklı hücre şekli, büyüme oranı gibi farklılaşma yeteneğinin 6 farklı alt popülasyonlar oluşan heterojen bir nüfus. Ancak, tüm alt popülasyonlar bilinen MSC belirteçlerinin ifade etme ve bu nedenle bu alt popülasyonlar ayrı işaretleri kullanmak mümkün değildir. Bu nedenle, tek hücre oluşturduğu koloni farklı alt popülasyonlar, ayırmak için uygulanan klonlama silindir. <ol><li> ~ 10cm çanak başına yaklaşık 50 100 hücre Plaka hücreleri. 1 ~ 2 hafta boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör inkübe edin. Bu dönemde, ters bir mikroskop ile iyi izole koloniler inceleyin. Koloniler yeterince büyük boyut (her koloni 100'den fazla hücre daha iyi) ulaştığında, çanak alt kısmında bir sharpie koloniler işaretleyin. Işaretlenir koloni almak zaman aldı birinin yakınında herhangi bir çevre koloniler olmadığından emin olun. </li><li> Aspire orta ve çanak 1X D-PBS ile bir kez yıkayın. Steril bir forseps ile steril bir klonlama silindir Pick up ve nazikçe işaretlenmiş koloni çevresinde yer. Işaretli tüm koloniler üzerine yerleştirilen bir klonlama silindir kadar bu işlemi tekrarlayın. Aldı koloniler her klonlama silindir sadece bir koloni içerdiğini birbirlerine uzak olmalıdır. </li><li> 100μl tripsin-EDTA her klonlama silindir ekleyin ve ~ 5 dakika süreyle geri inkübatör çanak koymak. 5 dakika sonra, onlar kadar yuvarlama olup olmadığını görmek için mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hücreler yukarı kaldırdı, tripsin inaktive kültür ortamı eşit miktarda ekleyebilirsiniz. 200μl micropipettor hücre süspansiyonu karıştırın ve 60mm çanak 3ml prewarmed kültür ortamı içeren bir hücre süspansiyonu aktarmak. Bulaşıkları düzgün Etiket ve kuvöz içine geri koymak. Önümüzdeki birkaç gün içinde morfolojik değişim izleme. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Sıçan MKH izolasyonu için kısmen açıklanan protokole göre, plastik yapışık MKH kaplama sonraki gün görünür olmalıdır. Hücrelerin sayısı hızla artmaya devam ederken, konfluent hücreleri Şekil 1A gösterilen hücreler gibi görünmelidir. Hücrelerine ula geldiğinde ~ confluency% 80 (Şekil 1B), alt kültüre yürütülen olabilir. Altkültürü sırasında, tripsin-EDTA hücreleri ayırmak için kullanılan ve Şekil 1C gösterildiği gibi kaldırdı hücreleri küçük ve yuvarlak. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Sıçan MKH Faz kontrastlı görüntüler. (A) konfluent MKH. Hücrelerin büyük çoğunluğu mili gibi ya da yıldız gibi. (B) MKH yaklaşık% 80 confluency. (C) trypsinization sonra kaldırdın hücreleri küçük ve yuvarlak. Bir kez MKH manyetik hücre sıralama ile zenginleştirilmiş, flow sitometri analizi, yüzey işaretleyici ifadeleri doğrulamak için yapılır. Zenginleştirme iyi ise, hücreler HSC marker CD45 (Şekil 2) karşı olumlu MSC belirteçlerinin CD54 ve CD90 karşı boyama ancak olumsuz göstermek gerekir. İzotip denetimleri IgG2a ve IgG1 negatif kontrol olarak kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Yüzey belirteçleri için MKH Flow sitometri analizi. MKH IgG2a (izotip kontrolü 1), IgG1 (izotip kontrolü 2), CD45, CD54 ve CD90 karşı antikorlar ile etiketlenir. MKH CD54 ve CD90 ifade değil CD45. Hücreleri uygun klonal yoğunlukta numaralı seribaşı zaman, koloniler tek hücre çıkmalıdır. Şekil 3A, tek bir hücrenin oluşturduğu bir koloni temsil eder. Klonlama silindir sömürgelerden elde edilen koloniler ve hücreler ayrı ayrı kültürü ayrı kullanılabilir. Şekil 3B ve 3C iki ayrı koloniler elde edilen hücreler temsil eder. Koloni 2 türetilen hücreler (Şekil 3C) yuvarlak ise koloni 1 türetilen hücreleri gibi mili (Şekil 3B). <pclass src="/files/ftp_upload/1852/1852fig3.jpg" alt="Şekil 3"></pclass> Şekil 3. MKH ve tek koloni elde edilen hücreler tarafından Colony oluşumu. MKH klonal yoğunluğa sahip bir form tek tek koloniler kültüre . Bu koloniler ayrı kültüre klonlama silindir ve farklı koloniler hücreleri tarafından ayrılabilir. Klonal yoğunluğu kaplama (A) temsilcisi koloni MKH tarafından oluşturulmuştur. (B) bir koloni elde edilen hücreler, Mil gibi. (C) Yuvarlak hücreleri başka bir koloni türetilmiştir.

<ol><li>de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+glial+glutamate+transporters+in+adult+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells.</a> J Neurochem. 91, 155-166 (2004).</li>
<li>Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+withdrawal+on+osteoblastic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells.</a> J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).</li>
<li>Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells%3A+from+basic+biology+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.</a> Gene Ther. 15, 109-116 (2008).</li>
<li>Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krause+Plasticity+of+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Krause Plasticity of marrow-derived stem cells.</a> Blood. 102, 3483-3493 (2003).</li>
<li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).</li>
</ol>

Bu protokol, izole etmek ve zenginleştirmek MKH anlatılmaktadır. Tek koloni elde edilen hücreleri ayırmak için bir yöntem de dahil edilmiştir. Başarılı bir izolasyon, zenginleştirme ve koloni ayrımı için önemli olan birkaç adım vardır. Hücre izolasyonu sıçan yaparken, bir hücre süzgeç ya da kan pıhtılaşması ve kemik enkaz kurtulmak için benzer büyüklükte bir steril naylon örgü süzülmeye tavsiye edilir. Gecede hücreleri kaplama sonra, birçok ölü hücreleri orta yüzen olacak ve ölü hücreleri bağlı hücrelerin büyümesine yar...

<table><tbody><tr><td>1X D-PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>Biotinli fare IgG2a</td><td>BD Biosciences</td><td>555572</td><td></td></tr><tr><td>Biotinli fare IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>555747</td><td></td></tr><tr><td>Biotinli anti-sıçan CD54</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL054B</td><td></td></tr><tr><td>Biotinli anti-sıçan CD90</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL005B</td><td></td></tr><tr><td>Biotinli anti-sıçan CD45</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL001B</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag tamponu</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı tüp</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin partikülleri</td><td>BD Biosciences</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>F0040</td><td></td></tr><tr><td>Klonlama silindiri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2059</td><td></td></tr></tbody></table>

İzolasyon ve rat mezenkimal kök hücreler zenginleştirilmesi (mkh) ve mkh türetilmiş tek koloni ayırma

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MKH, yetişkin kök hücrelerin tedavi edici uygulamalar için umut verici bir kaynak bir nüfus vardır. Bu hücreler, kemik iliğinden izole edilebilir ve plastik bağlılık nedeniyle hematopoietik kök hücreler (HKH&#39;lerin) kolaylıkla ayrılabilir. Bu protokol, sıçan femur ve tibiaları MKH izole etmek için nasıl açıklamaktadır. Izole hücreler manyetik hücre sıralayarak iki MKH yüzey belirteçleri CD54 ve CD90 karşı daha da zenginleştirilmiş. CD54 ve CD90 yüzey belirteçleri İfade sonra akış sitometri analizi ile teyit edildi. HSC işaretleyici CD45 sıralaması MKH HKH&#39;lerin tüketilmiş olup olmadığını kontrol etmek için de yer aldı. MKH doğal olarak oldukça heterojen. Farklı şekiller, proliferasyon ve farklılaşma yetenekleri hücrelerin alt popülasyonlar vardır. Bu alt popülasyonlar, bilinen tüm MKH belirteçlerinin ifade ve farklı alt popülasyonlar için hiçbir benzersiz marker henüz tespit edilmiştir. Bu nedenle, farklı alt popülasyonlar ayırmak için alternatif bir yaklaşım tek koloni elde edilen hücreler ayrı klonlama silindir kullanıyor. Tek koloniler elde edilen hücreler daha sonra kültür ve ayrı olarak değerlendirilir.

Rat MKH, femur ve tibiaları izole edilmiş ve daha sonra manyetik hücre sıralama ile zenginleştirilmiş. Sıralama hücreler flow sitometri ile yüzey belirteçlerinin ifade teyit edildi. Bu hücreler de klonal yoğunluğu tek koloniler oluşturmak için kültüre edildi ve daha sonra bu kolonilerin klonlama silindir ile ayrıldı.

İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

Mezenkimal kök hücreler (MKH), terapötik uygulamalar için gelecek vadeden bir kaynak olan yetişkin kök hücre popülasyonudur. Bu hücreler kemik iliğinden izole edilebilir ve...

Kısaca MSC'ler olarak adlandırılan mezenkimal kök hücreler, altı ila sekiz haftalık dişi bir rag dolly sıçandan izole edilir ve yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaşana kadar 10 santimetrelik bir Petri kabında kültüre edilir. MSC'leri zenginleştirmek için hücreler, önce biyotin konjuge primer antikorlarla, ardından streptavidin konjuge manyetik boncuklarla boyanır. İşaretli hücreler daha sonra manyetik aktive hücre ayıklama yöntemiyle negatif fraksiyon ve pozitif fraksiyon olmak üzere iki fraksiyona ayrılır.Ardından, yüzey belirteç ekspresyonunu doğrulamak için akış sitometrisi analizi kullanılır. Son olarak, tek koloni kaynaklı MSC'leri elde etmek için klonlama silindirleri kullanılır. Merhaba, ben Michigan Eyalet Üniversitesi Kimya Mühendisliği ve Malzeme Bilimi Bölümü'ndeki Christina Chang laboratuvarından Lee.Bugün size chy kök hücrelerinin izolasyonu ve zenginleştirilmesinin yanı sıra tek koloniden türetilmiş hücrelerin elde edilmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kırmızı kök hücrelerin proliferasyon ve diferansiyasyon davranışlarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Mezenkimal kök hücreler veya MSC'ler, altı ila sekiz haftalık dişi Sprague Dawley sıçanlarından izole edilecektir. Bu prosedüre başlamak için, ötanazi uygulanmış hayvanın arka bacaklarından femur ve tibyaları kesin. Deriyi ve kasları temizleyin, diseke edilmiş femur ve tibyaları birkaç saniye boyunca %70 izopropanol içinde bekletin ve ardından bunları 1X DPBS'ye aktarın.Aşağıdaki adımlar bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. İlk olarak, femur ve tibyayı DMEM içeren 10 santimetrelik bir kaba aktarın. Ardından, her bir kemiği cımbızla tutarken iki ucunu makasla kesin.22 gauge bir iğneyi üç mililitrelik bir şırıngaya takın ve DMEM ile doldurun. İğneyi kemiğin açılmış olan bir ucundan içeri yerleştirin ve iliği 50 mililitrelik bir tüpe boşaltın. Tüm ilik elde edilene kadar, her kemik için bu işlemi iki ila üç kez tekrarlayın.Hücreleri yeniden süspanse edin, ardından kemik kalıntılarını ve kan agregatlarını temizlemek için hücre süspansiyonunu 70 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 4 °C'de, 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspirasyonla uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 25 mL MSC medium seed içinde yeniden süspanse edin.Her bir 10 santimetrelik kültür plağına 10 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kültür plaklarını 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde bir ila iki hafta boyunca inkübe edin. Önceden izole edilmiş sıçan MSC'leri yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaştığında, medyumu aspire edin ve her bir plağa dört ila beş mililitre tripsin EDTA ekleyin.Kapları inkübatöre geri yerleştirin ve yaklaşık beş dakika inkübe edin. Hücrelerin ayrılmasını sağlamak için, tripsini etkisiz hale getirmek amacıyla eşit miktarda kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonlarını 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve hücreleri 4 °C'de, 200 g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Şimdi, CD 54 ve CD 90 olmak üzere iki yüzey belirteci ile MSC'lerin zenginleştirilmesini göstereceğiz. İşlem için BD Biosciences'tan bir hücre ayırma mıknatısı olan BD I mıknatıs kullanılmaktadır. İşleme, hücre peletini mililitrede 20 milyon hücre olacak şekilde hücre boyama tamponunda yeniden süspanse ederek başlayın.Ardından, hücre süspansiyonuna biyotinize CD 54 antikoru ve biyotinize CD 90 antikoru ekleyin ve nazikçe karıştırın; 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ettikten sonra, işaretlenmiş hücreleri fazla miktarda bir X BD IMAG tamponu ile yıkayın. İşaretlenmiş hücreleri 200 GS, dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüjleyin. BD imag streptavidin partiküllerini iyice vorteksleyerek hazırlayın ve ardından her 10 milyon hücre için 40 microliter partikül ekleyin.Partikülleri etiketli hücrelerle iyice karıştırın ve hücreleri 6 ila 12 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon süresi boyunca, pozitif fraksiyonu toplamak için yuvarlak tabanlı bir test tüpünü etiketleyin. İnkübasyon tamamlandığında, etiketleme hacmini mililitrede 20 milyon hücreye getirin.Bir adet Expedia I mag tamponu ile. Etiketli hücreleri pozitif fraksiyon toplama tüpüne aktarın. Pozitif fraksiyon tüpünü BDI mıknatısı üzerine yerleştirin ve altı dakika boyunca bekletin.Ardından, pozitif fraksiyon tüpü hâlâ BDI mıknatısı üzerindeyken, süpernatantı cam pastör pipeti ile uzaklaştırın. Daha sonra, pozitif fraksiyon tüpünü BDI mıknatısından çıkarın ve buza yerleştirin. Bir mililitre buzda soğutulmuş 1X BDI mag tamponu ekleyin ve hücreleri nazikçe karıştırarak yeniden süspande edin.Tüpü tekrar BDI mıknatısa yerleştirin ve iki ila dört dakika boyunca bekletin. Süpernatantı yeni bir cam pastör pipeti ile uzaklaştırın. Yıkama işlemini daha önce açıklandığı şekilde tekrarlayın.Bir kez daha. Son olarak, süpernatantı yeni bir cam pastör pipeti ile uzaklaştırın. Ardından tüpü BDI mıknatıs standından çıkarın.Hücreleri bir mililitre kültür ortamında süspande edin ve hücre süspansiyonunu 25 mililitre ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücrelerin sürdürülmesi için 1 adet 75 santimetrekarelik flask ve akış sitometrisi için 10 santimetrelik bir kap kullanın.Tek koloni kaynaklı MSC'lerin ayrıştırma prosedürüne başlamak için, 10 santimetrelik kap başına yaklaşık 50 ila 100 hücre olacak şekilde hücre ekimi yapın ve 37 °C ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde bir ila iki hafta boyunca inkübe edin. Bu bir ila iki haftalık süre boyunca, iyi izole edilmiş kolonileri ters mikroskop ile inceleyin. Koloniler, her bir kolonide 100 hücreden fazla olacak yeterli büyüklüğe ulaştığında, kabın altına kalıcı bir markör ile kolonileri işaretleyin.İşaretlenecek koloniyi seçerken, çevresinde başka koloni bulunmadığından emin olun. Besiyerini aspire edin ve pens yardımıyla plağı bir kez 1X DPBS ile yıkayın. Steril bir klonlama silindiri alın ve nazikçe işaretlenen koloninin etrafına yerleştirin.Her işaretli koloninin üzerine bir klonlama silindiri yerleştirilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Her klonlama silindirine 100 µL tripsin EDTA ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Beş dakika sonra, hücrelerin yuvarlaklaşıp yuvarlaklaşmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin.Hücreler kalktığında, tripsini inaktive etmek için eşit miktarda kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 200 mikrolitrelik mikro pipetle karıştırın ve hücre süspansiyonunu, üç mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı içeren 60 milimetrelik bir kaba aktarın. Kapları etiketleyin ve plastik yüzeye yapışan hücrelerin izolasyonundan sonra onları tekrar inkübatöre yerleştirin.MSC'ler ekimden sonraki gün görünür hale gelmelidir. Hücreler çoğalmaya devam ettikçe, konfluens halindeki hücreler, çoğunluğunun iğ şeklinde veya yıldız şeklinde olduğu bu faz kontrast görüntüsündeki hücrelere benzemelidir; hücreler yaklaşık %80 konfluense ulaştığında kültürleme uygundur.Tripsinizasyondan sonra ayrılan hücreler yuvarlak görünmeli ve besiyerinde yüzmelidir. MSC'ler manyetik hücre ayırma ile zenginleştirildikten sonra, yüzey belirteç ekspresyonlarını doğrulamak için akış sitometrisi uygulanır. Zenginleştirme başarılıysa, hücrelerin MSC belirteçleri olan CD 54 ve CD 90'a karşı pozitif boyanma, ancak HSC belirteci olan CD 45'e karşı negatif boyanma göstermesi gerekir; negatif kontroller olarak IgG iki A ve IgG bir izotip kontrolleri kullanılır.Hücreler uygun bir klonal yoğunlukta yerleştirildiğinde, bu örnekte gösterildiği gibi koloniler tekil hücrelerden oluşarak yükselmelidir. Ardından, kolonileri ayırmak için klonlama silindirleri kullanılabilir ve kolonilerden türetilen hücreler ayrı ayrı kültüre edilebilir. Bu iki örnekte, bir koloniden türetilen hücreler iğ şeklinde görünürken, diğer koloniden türetilen hücreler yuvarlaktır.Böylece, rastgele ve yaygın kök hücrelerin nasıl izole edilip zenginleştirileceğini ve ayrıca tek koloni türevli hücrelerin nasıl elde edileceğini gösterdik. Bu işlem sırasında, izolasyon aşamasında kan pıhtılarından ve kemik artıklarından kurtulmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Zenginleştirme sırasında optimal miktarda antikor kullanın ve koloni ayırımı sırasında iyi izole edilmiş kolonileri işaretleyin.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

isolation-enrichment-rat-mesenchymal-stem-cells-mscs-separation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir.

CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bu yazı basit yalıtım ve Yeni Zelanda beyaz tavşan synovial sıvı mezenkimal kök hücre arınma için basit ve ekonomik Protokolü sunar.

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Bu makalede, sıçan mandibulalarından kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek, yetiştirmek, sıralamak ve tanımlamak için tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi sıralamasını birleştiren bir yöntem sunulmaktadır.

Sıçanlarda Mandibuler Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Yetiştirilmesi

Yağ dokusundan türetilmiş mezenkimal kök hücreler (Ad-MSC'ler), insülin üreten hücrelere (IPC'ler) farklılaşan potansiyel bir MSC kaynağı olabilir. Bu protokolde, sıçan epididim Ad-MSC'lerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı adımlar ve ardından aynı sıçan Ad-MSC'lerinden IPC'lerin üretilmesi için basit, kısa bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Yağ Dokusu Mezenkimal Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Hücrelere Farklılaşması İçin İzolasyonu

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Çene kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler, çeşitli farklılaşma, kendini yenileme ve immün modülasyonda önemli işlevlere sahiptir. Gen terapisi, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta öncü hücrelerin çok önemli bir rezervuarı olarak ortaya çıkmışlardır. Burada, sıçanlarda çene kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için benzersiz bir yöntem sunuyoruz.

Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü Tekniği

Mevcut protokol, farelerden yüksek oranda homojen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (BMSC'ler) saflaştırmak, genişletmek ve karakterize etmek için uygun maliyetli bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, yüksek proliferasyon ve farklılaşma potansiyeline sahip büyük miktarlarda BMSC'lerin elde edilmesini kolaylaştırır, fare modellerini destekler ve klinik öncesi araştırmaları ilerletir.

Fare Kaynaklı Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Saflaştırılması, Genişletilmesi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Fenotiplendirilmesi

Öğrenin sıçan mezenkimal kök hücrelerinin manyetik hücre sıralama ile izolasyonunu ve zenginleştirilmesini. Akış sitometrisi ile yüzey belirteçleri doğrulanır ve tek koloni türetilmiş hücreler elde edilir.

İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

Daha fazla video keşfet