İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

Kısaca MSC'ler olarak adlandırılan mezenkimal kök hücreler, altı ila sekiz haftalık dişi bir rag dolly sıçandan izole edilir ve yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaşana kadar 10 santimetrelik bir Petri kabında kültüre edilir. MSC'leri zenginleştirmek için hücreler, önce biyotin konjuge primer antikorlarla, ardından streptavidin konjuge manyetik boncuklarla boyanır. İşaretli hücreler daha sonra manyetik aktive hücre ayıklama yöntemiyle negatif fraksiyon ve pozitif fraksiyon olmak üzere iki fraksiyona ayrılır.

Ardından, yüzey belirteç ekspresyonunu doğrulamak için akış sitometrisi analizi kullanılır. Son olarak, tek koloni kaynaklı MSC'leri elde etmek için klonlama silindirleri kullanılır. Merhaba, ben Michigan Eyalet Üniversitesi Kimya Mühendisliği ve Malzeme Bilimi Bölümü'ndeki Christina Chang laboratuvarından Lee.

Bugün size chy kök hücrelerinin izolasyonu ve zenginleştirilmesinin yanı sıra tek koloniden türetilmiş hücrelerin elde edilmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kırmızı kök hücrelerin proliferasyon ve diferansiyasyon davranışlarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Mezenkimal kök hücreler veya MSC'ler, altı ila sekiz haftalık dişi Sprague Dawley sıçanlarından izole edilecektir. Bu prosedüre başlamak için, ötanazi uygulanmış hayvanın arka bacaklarından femur ve tibyaları kesin. Deriyi ve kasları temizleyin, diseke edilmiş femur ve tibyaları birkaç saniye boyunca %70 izopropanol içinde bekletin ve ardından bunları 1X DPBS'ye aktarın.

Aşağıdaki adımlar bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. İlk olarak, femur ve tibyayı DMEM içeren 10 santimetrelik bir kaba aktarın. Ardından, her bir kemiği cımbızla tutarken iki ucunu makasla kesin.

22 gauge bir iğneyi üç mililitrelik bir şırıngaya takın ve DMEM ile doldurun. İğneyi kemiğin açılmış olan bir ucundan içeri yerleştirin ve iliği 50 mililitrelik bir tüpe boşaltın. Tüm ilik elde edilene kadar, her kemik için bu işlemi iki ila üç kez tekrarlayın.

Hücreleri yeniden süspanse edin, ardından kemik kalıntılarını ve kan agregatlarını temizlemek için hücre süspansiyonunu 70 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 4 °C'de, 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspirasyonla uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 25 mL MSC medium seed içinde yeniden süspanse edin.

Her bir 10 santimetrelik kültür plağına 10 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kültür plaklarını 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde bir ila iki hafta boyunca inkübe edin. Önceden izole edilmiş sıçan MSC'leri yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaştığında, medyumu aspire edin ve her bir plağa dört ila beş mililitre tripsin EDTA ekleyin.

Kapları inkübatöre geri yerleştirin ve yaklaşık beş dakika inkübe edin. Hücrelerin ayrılmasını sağlamak için, tripsini etkisiz hale getirmek amacıyla eşit miktarda kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonlarını 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve hücreleri 4 °C'de, 200 g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Şimdi, CD 54 ve CD 90 olmak üzere iki yüzey belirteci ile MSC'lerin zenginleştirilmesini göstereceğiz. İşlem için BD Biosciences'tan bir hücre ayırma mıknatısı olan BD I mıknatıs kullanılmaktadır. İşleme, hücre peletini mililitrede 20 milyon hücre olacak şekilde hücre boyama tamponunda yeniden süspanse ederek başlayın.

Ardından, hücre süspansiyonuna biyotinize CD 54 antikoru ve biyotinize CD 90 antikoru ekleyin ve nazikçe karıştırın; 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ettikten sonra, işaretlenmiş hücreleri fazla miktarda bir X BD IMAG tamponu ile yıkayın. İşaretlenmiş hücreleri 200 GS, dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüjleyin. BD imag streptavidin partiküllerini iyice vorteksleyerek hazırlayın ve ardından her 10 milyon hücre için 40 microliter partikül ekleyin.

Partikülleri etiketli hücrelerle iyice karıştırın ve hücreleri 6 ila 12 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon süresi boyunca, pozitif fraksiyonu toplamak için yuvarlak tabanlı bir test tüpünü etiketleyin. İnkübasyon tamamlandığında, etiketleme hacmini mililitrede 20 milyon hücreye getirin.

Bir adet Expedia I mag tamponu ile. Etiketli hücreleri pozitif fraksiyon toplama tüpüne aktarın. Pozitif fraksiyon tüpünü BDI mıknatısı üzerine yerleştirin ve altı dakika boyunca bekletin.

Ardından, pozitif fraksiyon tüpü hâlâ BDI mıknatısı üzerindeyken, süpernatantı cam pastör pipeti ile uzaklaştırın. Daha sonra, pozitif fraksiyon tüpünü BDI mıknatısından çıkarın ve buza yerleştirin. Bir mililitre buzda soğutulmuş 1X BDI mag tamponu ekleyin ve hücreleri nazikçe karıştırarak yeniden süspande edin.

Tüpü tekrar BDI mıknatısa yerleştirin ve iki ila dört dakika boyunca bekletin. Süpernatantı yeni bir cam pastör pipeti ile uzaklaştırın. Yıkama işlemini daha önce açıklandığı şekilde tekrarlayın.

Bir kez daha. Son olarak, süpernatantı yeni bir cam pastör pipeti ile uzaklaştırın. Ardından tüpü BDI mıknatıs standından çıkarın.

Hücreleri bir mililitre kültür ortamında süspande edin ve hücre süspansiyonunu 25 mililitre ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücrelerin sürdürülmesi için 1 adet 75 santimetrekarelik flask ve akış sitometrisi için 10 santimetrelik bir kap kullanın.

Tek koloni kaynaklı MSC'lerin ayrıştırma prosedürüne başlamak için, 10 santimetrelik kap başına yaklaşık 50 ila 100 hücre olacak şekilde hücre ekimi yapın ve 37 °C ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde bir ila iki hafta boyunca inkübe edin. Bu bir ila iki haftalık süre boyunca, iyi izole edilmiş kolonileri ters mikroskop ile inceleyin. Koloniler, her bir kolonide 100 hücreden fazla olacak yeterli büyüklüğe ulaştığında, kabın altına kalıcı bir markör ile kolonileri işaretleyin.

İşaretlenecek koloniyi seçerken, çevresinde başka koloni bulunmadığından emin olun. Besiyerini aspire edin ve pens yardımıyla plağı bir kez 1X DPBS ile yıkayın. Steril bir klonlama silindiri alın ve nazikçe işaretlenen koloninin etrafına yerleştirin.

Her işaretli koloninin üzerine bir klonlama silindiri yerleştirilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Her klonlama silindirine 100 µL tripsin EDTA ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Beş dakika sonra, hücrelerin yuvarlaklaşıp yuvarlaklaşmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin.

Hücreler kalktığında, tripsini inaktive etmek için eşit miktarda kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 200 mikrolitrelik mikro pipetle karıştırın ve hücre süspansiyonunu, üç mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı içeren 60 milimetrelik bir kaba aktarın. Kapları etiketleyin ve plastik yüzeye yapışan hücrelerin izolasyonundan sonra onları tekrar inkübatöre yerleştirin.

MSC'ler ekimden sonraki gün görünür hale gelmelidir. Hücreler çoğalmaya devam ettikçe, konfluens halindeki hücreler, çoğunluğunun iğ şeklinde veya yıldız şeklinde olduğu bu faz kontrast görüntüsündeki hücrelere benzemelidir; hücreler yaklaşık %80 konfluense ulaştığında kültürleme uygundur.

Tripsinizasyondan sonra ayrılan hücreler yuvarlak görünmeli ve besiyerinde yüzmelidir. MSC'ler manyetik hücre ayırma ile zenginleştirildikten sonra, yüzey belirteç ekspresyonlarını doğrulamak için akış sitometrisi uygulanır. Zenginleştirme başarılıysa, hücrelerin MSC belirteçleri olan CD 54 ve CD 90'a karşı pozitif boyanma, ancak HSC belirteci olan CD 45'e karşı negatif boyanma göstermesi gerekir; negatif kontroller olarak IgG iki A ve IgG bir izotip kontrolleri kullanılır.

Hücreler uygun bir klonal yoğunlukta yerleştirildiğinde, bu örnekte gösterildiği gibi koloniler tekil hücrelerden oluşarak yükselmelidir. Ardından, kolonileri ayırmak için klonlama silindirleri kullanılabilir ve kolonilerden türetilen hücreler ayrı ayrı kültüre edilebilir. Bu iki örnekte, bir koloniden türetilen hücreler iğ şeklinde görünürken, diğer koloniden türetilen hücreler yuvarlaktır.

Böylece, rastgele ve yaygın kök hücrelerin nasıl izole edilip zenginleştirileceğini ve ayrıca tek koloni türevli hücrelerin nasıl elde edileceğini gösterdik. Bu işlem sırasında, izolasyon aşamasında kan pıhtılarından ve kemik artıklarından kurtulmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Zenginleştirme sırasında optimal miktarda antikor kullanın ve koloni ayırımı sırasında iyi izole edilmiş kolonileri işaretleyin.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.