Name: Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Öğrenin, Pichia pastoris mayasında rekombinant protein ifadesi için elektrokompetent hücre hazırlama, transformasyon, DNA saflaştırma ve Western blot analizi yöntemlerini. Bu protokol yüksek verimli protein üretimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu işi desteklemek için Kanada Vakfı Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüleri için teşekkür etmek istiyorum. MT Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim (CMDE) TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi bir burs ile desteklenmiştir.

Metilotropik maya Pichia pastoris rekombinant proteinlerin İfade Bu protokol başlamadan önce bir P. çerçeve klonlanmış ilgi geni olmalıdır doğru yerleştirilmesi için vektör ilgi gen kontrol etmek için pastoris ebeveyn vektör ve sıralı var. Adım: P. içine yapı ve dönüşüm doğrusallaştırma electrocompetent maya hücreleri pastoris Bu adım için, elinizin altında şu medya ve plakalar olması gerekir: <ul><li> YPDS plakalar </li><li> 600 mL YPD orta </li><li> steril su buz gibi </li><li> Sorbitol 1 m </li><li> Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Cihaz </li><li> Microcon YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi </li><li> 0.2 cm elektroporasyon küvet </li><li> 15 ml steril cam tüp </li><li> steril cam Pasteur Pipet </li><li> Zeocin içeren YPDS plakalar </li></ul> Bölüm 1: electrocompetent maya hücreleri Hazırlık <ol><li> Dört gün önce P. dışarı hedeflenen dönüşümün çizgi Zeocin olmadan YPDS plaka pastoris hücreleri ve bunları 30 ° C, 1-2 gün ya da tek bir koloni oluştururlar kadar büyümesine izin. </li><li> Amaçlanan dönüşüm İki gün önce sizin P. 5 ml büyüyecek 30 50 ml Falcon tüp YPD orta pastoris gerginlik ° C geceleme. Falcon tüp çalkalayıcı bunu düzeltmek için bir şişe yerleştirin. </li><li> Önceki gün 0.25 gecelik kültür 30 çalkalayıcı gecede tekrar büyümesine izin ° C OD 600 = 1,3-1,5 ml ve 2 litrelik bir şişeyi taze YPD orta dönüşüm inokülasyon 500 ml . Not: spektrofotometre ölçüm doğru bir sonuç elde edebilmeniz için önce örnek sulandırmak. </li><li> Dönüşümün gün buz steril su ve 1 M sorbitol elinizin altında vardır. 4 5 dakika için 1500 xg'de hücreleri Santrifüj ° C 500 ml, buz gibi soğuk, steril su ile pelletini tekrar. </li><li> 4. adımı olarak hücreleri yeniden santrifüjleyin. 250 mL, buz gibi soğuk, steril su ile pelletini tekrar. </li><li> 4. adımda hücreleri tekrar santrifüjleyin. Sorbitol buz 1 M 20 ml pelletini tekrar. </li><li> 4. adımda hücreleri tekrar santrifüjleyin. ~ 1.5 mL nihai hacmi sorbitol buz 1 M 1 mL pelletini tekrar. 4 ° C daha sonra kullanmak kadar buz üzerinde veya Mağaza hücreleri. Not: gerektiğinden daha fazla electrocompetent hücreleri hazırlamak ve mikrosantrifüj tüplerde 80 ul hacimde saklayın -80 ° C Biz, bir aydan daha uzun süre saklanan hücreler kullanır. </li></ol> Bölüm 2: Lineerleştirme ve pPICZαA inşa konsantrasyonu Dönüşümü için kısıtlama sindirmek ilgi gen içeren vektör linearize. Biz enzim PmeI kullanırlar. Diğer kısıtlama siteleri mümkündür. Eklemek vektör linearize için kullanmak istediğiniz kısıtlama sitesi içermediğinden emin olmak için var. P. içine dönüşüm için pastoris 5-20 mikrogram 5-10 ul steril su Lineerleştirilmiş DNA gerekecektir. Ayrıca, linearize konsantre ve P. içine düz vektör (insert) transfer pastoris. Eklemek olmadan ana vektörü, arka plan hücre içi ifade etmek için bir kontrol ve size ifade sonuçlarını yorumlamak sağlar. <ol><li> Buz üzerinde tüm reaktifler çözülme, aşağıdaki reaktifler birleştirmek ve kısaca tüp altındaki tüm sıvı almak için santrifüj tüp dokunun ve tekrar döndürebilirsiniz: <ul><li> x ul steril su </li><li> 5.0 ul 10X NEBuffer 4 </li><li> 0.5 ul 100X BSA </li><li> 2 mg vektör DNA (~ 100 ng / ml) </li><li> 2.0 ul pme I enzim karışımı </li></ul> → 50 ul toplam reaksiyon hacmi Not: Yeterli Lineerleştirilmiş vektör DNA elde etmek için ayrı tüplerde yukarıdaki karışımı 3 veya 4 kez hazırlamak ve Amicon Ultra Santrifüj Cihaz ile sindirilir DNA konsantre çözümleri birleştirmek. </li><li> 37 ° C, 3 saat ve 20 dakika boyunca ısı 65 ° C'de enzim karışımı etkisiz hale inkübe edin. </li><li> Bu arada, Milli-Q su 1 ml ile bir Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Cihaz ön durulama 6-8 dakika 4000 xg'de tüp spin ve akış yoluyla atın. Not: membran kez ıslak kurumasına izin vermeyin. Cihazın ön durulandıktan sonra cihaz kullanmıyorsanız kullanılıncaya kadar, membran su bırakın. </li><li> Isı ile inaktive edilmiş çözüm için adım 2 transfer öncesi durulanır Amicon Santrifüj Filtre Ünitesi, 6-8 dakika 4000 xg'de tüp spin ve üzerinden akış atın. Not: Birden fazla doğrusallaştırma karışımı hazırlanan varsa, bir Amicon Santrifüj Filtre Ünitesi tüm çözümleri birleştirmek. </li><li> Amicon filtre çözüm miktarı yaklaşık 100 kadar Santrifüj ~ 150 &amp; mu; l. Yukarıda boş bir tüpe 1,5 mL steril su başka bir ekleyin ve çözüm Amicon tüp transferi ve santrifüj adımı tekrarlayın. Ikinci kez 1.5 ml steril su ile yıkayın ve tekrar yoluyla akışı atın. ~ 150 ul son hacmi azaltın. Çamaşır adımları hücreleri darbeli arching önlemek için tampon kalan tuz çıkarın. Not: santrifüj basamağı için sallanan bir kova rotor kullanır; santrifüj sırasında bir yerde tutmak için 50 ml Falcon tüp kapaklı Amicon santrifüj filtre ünitesi yerleştirebilirsiniz. Amicon filtre cihazları uzun santrifüj sonra bile filtre çözüm 50 ul korur. </li><li> DNA hazırlığı daha fazla konsantrasyon için bir ön-durulanır Microcon YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi Amicon filtre cihazı kalan DNA çözüm transferi ve Amicon tüp tüm DNA kurtarmak için ek 50 ul steril su ile durulama. Bir mikrosantrifüj Microcon Santrifüj Filtre Ünitesi filtre hala biraz sıvı ile kaplıdır kadar 10.000 xg'de santrifüjleyin. Sadece kısa bir süre için spin ve sadece küçük bir miktar sıvı filtre bırakılırsa her dakika kontrol edin. DNA çözümü kurtarmak için, 3 dakika boyunca 1000 xg ikinci bir santrifüj adım yeni bir mikrosantrifüj tüp ve spin filtre baş aşağı yerleştirin. Son hacmi, toplam 10-15 ul geçmemelidir, aksi takdirde DNA çok dönüşüm adım için sulandırılmış olabilir. Not: filtre cihaz çok uzun spin ve potansiyel örneklem kaybını önlemek için tamamen kurumasını izin yok. Membran kuru ise, membran 10-15 ul steril su ekleyip 30 saniye hafifçe ajitasyon ve yukarıda açıklandığı gibi DNA kurtarmak. </li></ol> Bölüm 3: P. Dönüşüm; elektroporasyon tarafından pastoris <ol><li> Şimdi eklemek içeren Lineerleştirilmiş ve konsantre pPICZαA DNA electrocompetent P. dönüşüm için hazır pastoris hücreleri (bkz. adım Ben, bölüm 2). Buz üzerinde 0.2 cm elektroporasyon küvet; yer; sorbitol 1 M 1 ml ile mikrosantrifüj tüp doldurmak ve buz üzerinde etiket steril 15 ml'lik cam tüp içinde ve steril bir var: dönüşüm yaklaşık 15 dakika önce aşağıdaki reaktifler ve cihazlar hazırlamak Pasteur pipeti elinizin altında cam. </li><li> Buz gibi bir 0.2 cm elektroporasyon küvet adım Ben, parçası 2.7 hücrelerin 80 ul aktarın. Elektroporasyon küvet, yan-yan pipet hareket ettirerek adım Ben, parçası 3.6 ve karışımı konsantre lineerleştirilmiş pPICZαA DNA çözüm ekleyin. Not: DNA ekleyerek ilk durağı sadece pipet itin. Hücrelerin DNA karıştırıldıktan sonra ikinci durağı pipet itme ve küvet yavaşça çıkarın. </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde hücreleri küvet inkübe edin. </li><li> Bir doku ile küvet dışını silin ve kullanılan özel elektroporasyon cihaz üreticisi tarafından önerilen maya (Saccharomyces cerevisiae) parametrelere göre hücreler darbe. Not: aşağıdaki koşullar ile Bio-Rad GenePulser kullanın: <ul><li> Şarj voltajı (V): 1500; </li><li> Kapasitans (μF): 25; </li><li> Direnci (Ω): 200. </li></ul> 0.2 cm elektroporasyon küvet, protokol ~ 7500 V / cm bir alan gücü ile, bir darbe uzunluğu ~ 10 ms üretir. </li><li> Hemen buz küvet için sorbitol 1 M 1 mL ekleyin. Steril cam Pasteur pipeti kullanarak 15 ml steril bir tüp küvet içerik aktarma. </li><li> 30 ° C'de 1.5 saat sallayarak olmadan tüp inkübe edelim. </li><li> 100 mg / ml Zeocin içeren dört etiketli YPDS plakaları 5-7 steril cam boncuk ekleyin. 250 ul her bir plaka üzerinde 15 ml'lik cam tüp elektroporasyon karışımı sürün. Yatay hücreler eşit yaymak için plaka çalkalayınız. Plaka 15 dakika boyunca kuru ve sonra agar plaka tersini boncuk kaldırmak. Not: GS115 Pichia gerginlik kullanırken transformants seçmek için 100 mg / ml Zeocin. Başka bir Pichia gerginlik kullanıyorsanız, seçim şartları değişebilir. </li><li> Koloniler oluşana kadar 2 ila 3 gün 30 ° C ters tabak inkübe. Işığa duyarlı Zeocin bozulması önlemek için siyah plastik tabak sarın. Plakalarda antibiyotik az miktarda, yanlış pozitif klonların neden olabilir. </li><li> Koloniler sonra, 12 koloniler almak ve 100 mg / Zeocin ml içeren taze YPDS plakaları klonlar bulaşması, onları arındırıp-temizleyen. </li></ol> Adım II: Protein ifade Pichia pastoris Bu adım için, elinizin altında şu medya, tabak ve reaktifler olması gerekir: <ul><li> BMGY orta </li><li> gliserol, sterilize </li><li> BMMY orta </li><li> metanol, sterilize </li><li> Epicentre Maya DNA saflaştırma kiti </li></ul> SizeAyrıca aşağıdaki şişeler gerekir: <ul><li> 250 ml şişesi, otoklava </li><li> 1 L şaşkın şişesi, otoklava </li><li> 200 ml beher, otoklava </li></ul> Bölüm 1: Pichia pastoris Protein ekspresyonu Aşağıdaki adımları da dönüştürülmüş kontrol vektör (eklemek) için yapılır. <ol><li> Adım Ben, parçası 3,9 saflaştırılmış Pichia koloniler tek bir koloni seçin ve steril 250 ml cam şişe içinde 25 ml BMGY aşılamak. 30 ° C kadar bir kültür sallayarak inkübatör (250-300 rpm) bir OD 600 ulaşır = 2-6 (yaklaşık 16-18 saat). Büyümek Not: spektrofotometre ölçüm doğru bir sonuç elde edebilmeniz için önce örnek sulandırmak. Hücreler log-faz büyüme olacaktır. </li><li> Hücreleri bir gliserol stok hazırlamak uygun OD 600 ulaşmıştır. 2 mL Corning cyrogenic flakon, 25 ml hücre kültürü 800 ul aktarın ve 200 ul steril gliserol ekleyin. -80 Gliserol stok ve mağaza Freeze ° C </li><li> Maya DNA saflaştırılması için, bir mikrosantrifüj tüpe 1,5 ml 25 ml hücre kültürü aktarmak. Oda sıcaklığında 1 dakika için 1300 xg'de santrifüj hücreleri Hasat. Bu hücreler, Pichia genomu (bkz. adım II, part2) entegre ilgi gen varsa çift kontrol Pichia integrants analiz etmek için kullanılır . 4 hücre pelletini Mağaza ° C daha fazla analiz kadar. </li><li> Geri kalanı için 25 ml kültür 50 ml Falcon tüp transferi ve oda sıcaklığında 5 dakika 3000 xg'de santrifüj hücreleri tarafından hasat. Durusu süpernatant ve herhangi bir kalıntı ortamı çıkarmak için, baş aşağı bir doku tüpler yerde. Hücre yıkamak için pelet, kalan BMGY ortamı kaldırmak için daha sonra ifade BMGY orta gliserol olarak inhibe edebilir 20 ml BMMY tekrar süspansiyon haline getirin. Yine oda sıcaklığında 5 dakika 3000 xg'de santrifüjleyin ve süpernatantı süzün. </li><li> BMMY orta 1.0 OD 600 yeniden süspanse hücre pelletini ifadesi neden (yaklaşık 100-200 ml) ve 1 litre şaşkın balonuna kültür aktarmak için. 200 ml beher balon kapak ve 30 büyümeye devam inkübatör dönmek ° C. Not: aşağıdaki sıcaklık 30 aşmayacak şekilde önemlidir ° C Inkübatör dalgalanma sıcaklık, 28 sıcaklık ° C Yeterli havalandırma metanol indüksiyon sırasında etkin bir şekilde ifade etmek için de önemli bir parametredir (ifade inducing zaman, hiç bir kültür hacmi&gt; toplam balon hacminin% 10-30 fazla). Kültür ortamı daha fazla oksijen tanıtmak Biz oldukça şaşkın şişeler kullanmanızı öneririz. </li><li> Indüksiyon korumak için her 24 saatte bir final konsantrasyon% 0.5 metanol steril saf metanol ekleyin. </li><li> 1.5 mL mikrosantrifüj tüp kültürünün ifadesi transferi 1 ml başladıktan sonra belirli zaman noktalarında. 2.5 dakika oda sıcaklığında 1300 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı ayrı bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha fazla analiz zamanına kadar -80 supernatant ve hücre pelletleri ° C saklayın. Indüksiyon sonrası protein ekspresyonu için optimal süre kurmak için farklı zaman noktalarında örnekler ele alınacaktır. Not: 6h örnekleri alınması için zaman noktaları olarak, 12 saat, 24 saat, 36H ve 48 saat seçin. 4 gün daha fazla büyüme mümkündür. En uygun zaman noktalarında farklı ifade proteinler arasında değişmektedir. </li><li> Coomassie lekeli SDS-PAGE ve western blot (Bu protokol açıklanmayan), protein ekspresyonu süpernatantlar ve hücre pelletleri analiz edin. </li></ol> Bölüm 2: Maya Pichia bütünleyici DNA saflaştırma ve PCR analizi BMGY Pichia kültür maya DNA arıtma adım için gerekli tüm reaktifler Epicentre MasterPure Maya DNA Saflaştırma Kit dahildir. Not: Bu analiz ek ve ilgi gen Pichia genom entegre olup olmadığını belirlemek için yapılır. BMGY kültür (bkz. adım II, Kısım 1.3) alınan 1.5 mL örnek hücre pelletini kullanılır. Epicentre MasterPure Maya DNA Saflaştırma kılavuzu, talimatları uygulayın ve eklemek için spesifik primerler ile maya DNA'sı ile PCR çalışması. 1 ul etidyum bromür içeren bir agaroz jel üzerinde PCR ürünü 3 ul analiz edin. 1 Kb + boyutuna işaretleyici eklemek boyutu yorumlamak ve bir jel dokümantasyon istasyonu kullanarak DNA görselleştirmek için iyi bir ekleyin. Rekombinant protein western blot analizi ile analiz edilebilir. Protein saflaştırma metal ücret reçine (Bu protokol açıklanan) His-tag arıtma yapılabilir. Ek, yemek tarifleri listesi Ben Adım: <ol><li> YPD orta: 600 mL hazırlamak içinYPD orta (Maya Özü Peptonlu Dekstroz Orta) 540 ml su 5 gr maya özü ve 12 g pepton çözülür. Sıvı döngüsü 20 dakika Otoklav. Bu arada 70 mL% 20 dekstroz ve filtre kullanmadan önce sterilize hazırlar. Otoklavlanmış çözüm serin ~ 60 ° C ve 60 mL% 20 dekstroz filtre ile sterilize edilmiş eklemek edelim. </li><li> YPDS (+ Zeocin) plakaları: YPDS 500 ml + Zeocin agar (Maya Özü ile Sorbitol Peptonlu Dekstroz Medium) 5 g maya özü, 450 ml su içinde 91,1 g sorbitol ve 10 g pepton çözülür hazırlamak. 10 g agar ve sıvı döngüsü 20 dakika boyunca bir manyetik karıştırıcı ve otoklav ekleyin. Bu arada 60 mL% 20 dekstroz ve filtre kullanmadan önce sterilize hazırlar. Otoklavlanmış çözüm serin ~ 60 ° C, 50 ml filtre ile sterilize edilmiş% 20 dekstroz eklemek edelim. Zeocin olmadan YPDS plakaları için antibiyotik eklemeden önce birkaç tabak dökün. Sonra nihai konsantrasyonu 100 mg / ml Zeocin agar elde etmek için 100 mg / ml stok solüsyonu 500 ul Zeocin ekleyin. Antibiyotik eklerken bir manyetik plaka üzerinde karıştırın ve eşit karışımı bir ek yaklaşık 2 dakika karıştırın izin alalım. Medya Petri kaplarına dökün ve siyah plastik ile kaplayın. Gece bankta tabak kuru olsun. 4 Zeocin içeren Mağaza YPD plakaları ° C Raf ömrü 1-2 haftadır. Not: Zeocin ışığa duyarlı olması nedeniyle plastik ile kapsama alanı gereklidir. </li></ol> II Adım: <ol><li> BMGY (Tamponlu gliserol-kompleks Orta) ve BMMY (Metanol-kompleks Orta Tamponlanmış): Maya özü ve 560 ml su içinde 16 g pepton her orta 8 g çözülür. Sıvı döngüsü 20 dakika Otoklav. Bu arada aşağıdaki çözümleri hazırlar: <ul><li> 1 M potasyum fosfat tamponu, pH 6.0: </li></ul> 24 ml 1M K 2 HPO 4 ve 156 mL 1M K 2 HPO 4 birleştirin ve onaylamak pH = 6.0 (pH ayarlanması gerekiyorsa, fosforik asit veya KOH). Sterilize Filtre ve oda sıcaklığında muhafaza. Bu çözümün raf ömrü bir yıl daha fazla. <ul><li> 10X YNB (amino asitler olmadan Amonyum Sülfat% 13.4 Maya Azot Base): </li></ul> Amonyum sülfat ve 200 ml su ve sterilize amino asitler olmadan maya azot tabanı 26.8 g (YNB) eritin. YNB su tamamen çözmek için çözüm ısıtın. 4 ° C saklayınız Bu çözümün raf ömrü yaklaşık bir yıl. Not: alternatif olarak, amonyum sülfat olmadan ve amino asitler olmadan YNB 3.4 gr ve 10 gr amonyum sülfat ekleyin. <ul><li> 500X B (0.02% Biotin): </li></ul> 50 ml su ve sterilize 10 mg biotin çözülür. 4 ° C saklayınız Bu çözümün raf ömrü yaklaşık bir yıl. <ul><li> 10X M (5% Metanol): </li></ul> 95 ml su ile 5 ml metanol karıştırın. Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C Bu çözümün raf ömrü yaklaşık iki aydır. <ul><li> 10X GY (% 10 Gliserol): </li></ul> Gliserol 10 ml 90 ml su ile karıştırın. Sterilize Filtresi. Oda sıcaklığında saklayın. Bu çözümün raf ömrü bir yıl daha fazla. Oda sıcaklığına kadar soğumasını otoklavlanmış çözüm, sonra aşağıdaki ekleyin ve iyice karıştırın bakalım: <ul><li> 80 ml 1 M potasyum fosfat tamponu, pH 6.0; </li><li> 80 ml 10X YNB </li><li> 0.16 ml 500X B </li><li> 80 ml 10X GY </li></ul> BMMY hazırlanması için, 80 ml 10X M yerine gliserol ekleyin. Mağaza medya ° C 4 Bu çözümün raf ömrü yaklaşık iki aydır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1862/1862fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Bu western blot görüntü, 24 saat sonra ifade dört ifade proteinleri (1605, 0537, 1228 ve 1682 olarak etiketli) gösterir . Immunoblotting için kullanılan antikor c-myc-HRP antikor oldu. Ikinci şerit (N) etiketli bir negatif kontrol ve ebeveyn (düz) vektörü ile dönüştürülmüş olması nedeniyle, rekombinant protein ifade hücreleri süpernatant yüklü.

<ol><li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+yeast+in+biotechnology%3A+protein+production+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li>
<li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li>
</ol>

Protein ifade Metilotropik maya Pichia pastoris bir ana sistem olarak kullanarak, bu protokolde açıklanmıştır . Protein kullanılan klonlama vektörü bağlı olarak ortama salınır. Rekombinant proteinin salgılanmasını sonraki arıtma kolaylaştırır. Ancak, gösterilen koşullar artan protein düzeyleri neden olabilir farklı proteinler ve koşulları ve ifade kez değişiklikleri ifade için optimize gerekebilir. Bu protokolde kullanılan vektör, c-myc epitop ve bu epitop satın alınabilir bir antikor özelliğine sahipt...

rekombinant proteinlerin metilotropik maya İfade pichia pastoris</em

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Mikrobiyal ökaryotik konak Pichia pastoris protein ekspresyonu, hızlı ve kullanımı kolay bir ifade sisteminde yüksek miktarda rekombinant protein üretme imkanı sunmaktadır . Tek hücreli bir mikroorganizma P. gibi pastoris işlemek için kolay ve ucuz medya yüksek hücre yoğunluğu hızla büyüyor. Ökaryot, P. olmak pastoris yüksek ökaryotik hücrelerde ve elde edilen rekombinant proteinler tarafından gerçekleştirilen post-translasyonel modifikasyonlar birçok protein katlanması, proteolitik işleme, disülfit bağı oluşumu ve glikozilasyon [1] tabi gerçekleştirmek için yapabiliyor. Metilotropik maya P. olarak pastoris tek karbon kaynağı olarak metanol metabolize yeteneğine sahiptir. Alkol oksidaz, AOX1, güçlü organizatörü, sıkı bir şekilde düzenlenir ve metanol ile indüklenen ve ilgi gen ifadesi için kullanılır . Buna göre, yabancı protein ifade besi metanol ekleyerek indüklenen olabilir [2, 3]. Diğer önemli bir avantajı, bir sinyal dizisi kullanarak P. pastoris sekretuar yolu yabancı bir proteini hedef, büyüme ortamına rekombinant protein salgılanmasını. Heterolog protein, medya maya kendisi tarafından salgılanan endojen protein ve medya için hiçbir katma proteinler sadece düşük seviyeleri ile total protein, orta ve büyük çoğunluğu oluşturur ve protein saflaştırılması adımları izleyerek kolaylaştırmaktadır [3, 4]. Rekombinant protein, E. her iki seçim için bir Zeocin direnç geninin salgılanması için α-faktörü salgılanması sinyali Burada kullanılan vektör (pPICZαA) faiz gen sıkı bir şekilde düzenlenir, metanol indüklenen ifade AOX1 organizatörü içeren coli ve Pichia ve c-myc epitopu ve rekombinant protein algılama ve saflaştırılması için polyhistidine (6xHis) etiketi içeren bir C-terminal peptid. Ayrıca, ana vektörü, c-myc epitop tanıma Anti-myc-HRP antikor kullanarak rekombinant protein batı blot analizi göstermektedir .

Protokol Metilotropik maya kullanarak protein ekspresyonu açıklar.<em&gt; Pichia pastoris</em&gt;. Electrocompetent maya hücrelerinin hazırlanması, ilgi gen içine vektör dönüşümü<em&gt; S. pastoris</em&gt; Ve maya DNA arıtma de yapılmaktadır. Western blot analizi ve protein saflaştırma bu protein ifade protokolünde son adımları oluşturmak.

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Mikrobiyal ökaryotik konakçı Pichia pastoris'te protein ekspresyonu, yüksek miktarlarda rekombinan proteinin hızlı ve ... şeklinde üretme imkanı sunar.

Aşağıdaki protokol, metil atrofik maya opus kullanılarak protein ekspresyonunu açıklamaktadır. Elektro-kompetan maya hücrelerinin hazırlanması ve ilgilenilen genin vektör ile PPA'lara transformasyonu gösterilmiş, ardından genin maya genomuna doğru şekilde entegre edildiğini kontrol etmek için maya DNA saflaştırma adımı anlatılmıştır. Son olarak, rekombinant proteinin ekspresyonunu gerçekleştireceğiz.Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Steven Hallam laboratuvarından Maria. Ben de Helm Lab'den Marcus. Bugün size TRO maya PQ.Past stories'de rekombinant proteinleri eksprese etme prosedürünü göstereceğiz.Çevresel DNA'nın ekstrakte edilip arşivlendiği ve meta genomik kütüphanelerin bulunduğu, tanımlanmamış mikroorganizmalardan proteinleri incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Metilotrofik maya Pichia pastoris'te rekombinant proteinlerin ekspresyonu, ilgilendiğiniz genin bir Pichia parent vektörüne çerçeve içi (in frame) klonlanmasını gerektirir.Deneyimizde, PPIC Z alpha A vektörünü kullanıyoruz. Bu vektör; ilgilenilen genin metanolle indüklenen sıkı denetimli ekspresyonu için AO X one promotörünü, rekombinant proteinin sekresyonu için alfa faktör sekresyon sinyalini, hem e coli hem de pic'te seleksiyon için zaas ve direnç genini, C terminalinde c-mic epitopu içeren bir peptidi ve rekombinant proteinin saptanması ve saflaştırılması için bir poli histidin etiketini içerir. Transformasyon öncesinde, ilgilenilen geninizi içeren vektörü restriksiyon sindirimi ile lineerize edin. Biz PME one enzimini kullanıyoruz, ancak insertinizde bu restriksiyon bölgesi bulunmadığı sürece diğer restriksiyon bölgelerinin kullanımı da mümkündür.Yeterli miktarda doğrusal vektör DNA'sı elde etmek için, ayrı tüplerde üç ila dört adet 50 µL'lik restriksiyon sindirim reaksiyonu hazırlayın; sindirim işleminden sonra tüm solüsyonları birleştirin ve konstrüktünüzü konsantre edin. PPA dous hücrelerine transformasyon gerçekleştirmek için, bir AmCon santrifüj filtre ünitesi ve bir MicroCon santrifüj filtre ünitesi kullanarak, 5 ila 10 µL steril su içerisinde 5 ila 20 µg doğrusal DNA'ya ihtiyacınız olacaktır. Elektrokometan PPA dous hazırlamak için, planlanan transformasyondan dört gün önce hücreleri SN içermeyen A-Y-P-D-S plakasına ekleyin; transformasyondan iki gün öncesine kadar, tekil koloniler oluşana dek veya bir ila iki gün boyunca 30 °C'de inkübe ederek büyütün.PPA'nın veya suşun 5 ml'sini, 50 ml'lik bir Falcon tüpü içerisinde, YPD besiyerinde 30 °C'de gece boyunca büyütün. Transformasyondan bir gün önce, Falcon tüpünü çalkalayıcıya sabitlemek için bir erlene yerleştirin. 2 litrelik bir erlendeki 500 ml taze YPD besiyerini inoküle etmek için gece boyunca büyütülen kültürden 0,25 ml kullanın.Bir çalkalayıcıda 30 °C'de, OD 600 değeri 1,3 ile 1,5 olana kadar gece boyunca tekrar büyütün. Transformasyon gününde buz, soğuk steril su ve 1 M sorbitolü hazır bulundurun. Hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 1500 G'de santrifüjleyin.Santrifüj işleminden sonra, peleti 500 mililitre buz gibi soğuk, steril su ile süspande ederiz. Santrifüj tüplerinin kapasitesine bağlı olarak, hacmi iki ayrı tüpe bölmeniz veya birden fazla işlem yapmanız gerekebilir. Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti 250 mililitre buz gibi soğuk, steril su ile yeniden süspande edin.Santrifüj tüplerinin kapasitesine bağlı olarak, ayrı hücre peletlerini tek bir tüpte birleştirebilirsiniz. Santrifüj sonrası hücreleri tekrar süspande ederken, bu kez peleti yeniden süspande edin. Resüspande edilen hücreleri 20 mL buz gibi soğuk 1 M sorbitol ile 50 mL'lik bir falcon tüpüne aktarın ve santrifüjleyin.Son santrifüj işleminden sonra, peleti yaklaşık 1,5 ml nihai hacme ulaşana kadar bir mililitre buz gibi soğuk, bir molar sorbitol içerisinde yeniden süspande edin. Mikro santrifüj tüplerindeki yeniden süspande edilmiş hücreleri, transformasyon için kullanılana kadar buz üzerinde veya dört santigrat derece sıcaklıkta saklayın. Konsantre lineerize edilmiş yapıların PPA stok hücrelerine transformasyonundan önce, aşağıdaki reaktifleri ve cihazları hazırlayın.Bir mikrosantrifüj tüpünü bir mililitre bir molar sorbitol ile doldurun ve buz üzerine yerleştirin. 0.2 santimetre electroporation. Buz üzerinde Vet.Steril bir 15 mililitrelik cam tüpü etiketleyin ve pipetinizin yanında steril bir cam pastör pipeti bulundurun. Daha önce hazırlanan elektrokometan hücrelerden 80 mikrolitre miktarını buz soğuğundaki 0,2 santimetrelik elektroporasyon küvetine aktarın.Plazmid DNA çözeltisini hücrelere ekleyin ve pipet ucunu yanlara hareket ettirerek karıştırın. Elektroporasyon küvetine aktarın. Hücrelerin bulunduğu küveti beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Ardından, küvetin dışını peçete ile silin ve hücreleri, kullandığınız spesifik elektroporasyon cihazı üreticisinin tomurcuklanan mayalar için önerdiği parametrelere göre pulse edin. Bu gösterimde, aşağıdaki koşullarla bir BioRad gene Pulser kullanılmıştır: 1500 volt şarj voltajı, 25 micro ferres kapasitans ve pulse işleminden hemen sonra 200 ohms direnç.Vete bir mililitre buz gibi soğuk, bir molar sorbitol ekleyin. Vete içeriğini steril bir cam pastör pipeti kullanarak steril 15 mililitre tüpe aktarın. Tüpü çalkalamadan 30 °C'de 1,5 saat inkübe edin.1,5 saat sonra, elektropore edilmiş hücreler ekime hazır hale gelir. Her biri 100 micrograms per milliliter Zain içeren, etiketlenmiş dört YPTS plağının her birine beş ila 10 adet sterilize edilmiş cam boncuk ekleyin. Elektroporasyon karışımından 250 microliters miktarında yayınız.Her plakada karıştırın ve hücrelerin eşit şekilde yayılması için plağı yatay olarak sallayın. Plakaların 15 dakika boyunca kurumasını bekleyin ve ardından plakaları ters çevirerek agar üzerindeki boncukları çıkarın. Işığa duyarlı Zain'in bozulmasını önlemek için plakaları siyah plastik ile sarın ve koloniler oluşana kadar plakaları ters bir şekilde 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin.12 koloni seçin. Klonları, mililitre başına 100 mikrogram zein içeren taze YPDS plaklarına ekerek saflaştırın. Protein ekspresyonu için PPA hücrelerini hazırlamak amacıyla, saflaştırılmış pichia kolonilerinden tek bir koloni seçin ve steril 250 mililitrelik bir flask içerisindeki 25 mililitre VMGY ortamına inoküle edin; kültür OD 600 değeri iki ile altı arasına ulaşana kadar 30 degrees Celsius sıcaklıkta çalkalamalı inkübatörde büyütün.Hücreler uygun OD 600 değerine ulaştığında, saklama için hücrelerin gliserol stokunu hazırlayın. Hücre kültürünün 800 microliters kısmını iki mililitrelik kriyojenik tüpe aktarın ve 200 microliters sterilize gliserol ekleyin. Gliserol stokunu minus 80 degrees Celsius sıcaklıkta saklayın.Ek olarak, hücre kültürünün 1.5 mililitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri, oda sıcaklığında bir dakika boyunca 1300 GS'de santrifüj ederek hasat edin. Peleti dört derece Celsius'ta saklayın.Bu hücreler, hedef genin pichia genomuna entegre olduğunu doğrulamak amacıyla, inserta özgü primerlerle PCR sonrası agaroz jelde pichia izlerini analiz etmek için yapılacak maya DNA saflaştırmasında kullanılacaktır. 25 mililitrelik kültürün geri kalanını 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında 3000 Gs'de beş dakika santrifüj ederek hasat edin, süpernatanı dökün ve kalan medya kalıntılarını temizlemek için tüpü bir peçete üzerine ters çevirin. Hücre peletini yıkamak için 20 mililitre BMMY besiyerinde vorteksleyerek veya pipetle yukarı aşağı çekerek resüsпендируйте ve santrifüjleyin.Süpernatant dekante edildikten sonra, hücre peleti vorteksleme veya pipetle yukarı aşağı çekme yoluyla BMMY ekspresyon indüksiyon besiyerinde 1,0 OD 600 değerine ulaşana kadar tekrar süspanse edilir. Kültürü bir litrelik bölmeli (baffled) erlene aktarın ve erleni 200 mililitrelik bir tıpayla kapatın.Kültüre daha fazla oksijen sağladıkları için bölmeli erlenlerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Metanol indüksiyonu sırasında verimli protein ekspresyonu için, büyümeyi 30 °C'de sürdürmek amacıyla erleni inkübatöre yerleştirin. İnkübatörünüzün sıcaklığı dalgalanıyorsa, sıcaklığın 30 °C'yi aşmaması önemlidir.Sıcaklığı 28 °C olarak ayarlayın. Ekspresyonun başlamasından sonra belirli zaman noktalarında indüksiyonu sürdürmek için her 24 saatte bir, final konsantrasyonu %0,5 metanol olacak şekilde steril saf metanol ekleyin; kültürden 1 mL alarak 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1300 ×g'de 2,5 dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, süpernatanı ayrı bir 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Süpernatanları ve hücre peletlerini, ileri analizlere kadar -80 °C'de saklayın. İndüksiyon sonrası protein ekspresyonu için optimal zaman aralığını belirlemek amacıyla farklı zaman noktalarından alınan örnekler analiz edilecektir. Şimdi, konakçı sistem olarak PIA Pastis kullanılarak rekombinant proteinlerin başarıyla eksprese edildiğine dair bazı temsili sonuçları sunuyoruz.Bu western blot görüntüsü, 24 saatlik ekspresyon sonrası eksprese edilen dört proteini göstermektedir. İmmunobloting için kullanılan antikor, acemic HRP antikoru idi. İkinci şerit bir negatif kontroldür ve ana vektörle transforme edildikleri için rekombinant protein eksprese etmeyen hücrelerden elde edilen süpernatan ile yüklenmiştir.Ökaryotik konak PQ.Plus kullanarak rekombinant proteinlerin nasıl eksprese edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, ilgilendiğiniz genin klonlandığını ve çerçeveye oturduğunu doğrulamak için konstrüktünüzün dizilemiş olması ve işleme başlamadan önce tüm plaklarınız ile reaktiflerinizin hazır olması önemlidir. Ayrıca, metanol indüksiyonu ile protein ekspresyonu öncesinde yüksek sayıda transforman elde etmek için yeterli miktarda lineerize plazmit hazırlamanız önemlidir. Protein ekspresyonunuzu inhibe edebilecek gliserol kalıntılarını temizlemek için hücre pelletinizi iyice yıkadığınızdan emin olun.İşte hepsi bu. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

expression-recombinant-proteins-methylotrophic-yeast-pichia

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Geliştirmek dönüşümü, yönetmek ve probiyotik maya Saccharomyces boulardii heterolog protein ifadesini test etmek için kullanılabilecek tekniklerin birleşik bir açıklama burada sunulmuştur.

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Bu yöntem ilk kez karbon düzenlenir Kaynak Rehberleri P istihdam Pichia pastoris (Komagataella phaffii), verimli indüklenebilir metanol-Alerjik Rekombinant protein üretimi için güvenilir deneysel yordamlar açıklanır DCve PDF  küçük ölçekli deneylerde ekimi sırasında parametreleri online izlenebilir ve sürekli gliserol besleme uygulanır.

Metanol bağımsız ifade tarafından de-baskı teknolojilerinden yararlanan Pichia Pastoris

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik kontrolü, fermantasyon süreçleri üzerinde esnek dinamik kontrol sağlar. Buradaki protokol, farklı hacimsel ölçeklerde kimyasal ve protein üretimi için mavi ışık ayarlı fermantasyonların nasıl kurulacağını göstermektedir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Bu protokol, ilgilenilen bir antijene bağlanan protein varyantlarını zenginleştirmek için maya yüzeyi teşhir seçimi kampanyalarının yürütülmesi için temel adımları açıklar.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Öğrenin, Pichia pastoris mayasında rekombinant protein ifadesi için elektrokompetent hücre hazırlama, transformasyon, DNA saflaştırma ve Western blot analizi yöntemlerini. Bu protokol yüksek verimli protein üretimi sağlar.

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris

Daha fazla video keşfet