Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris

Aşağıdaki protokol, metil atrofik maya opus kullanılarak protein ekspresyonunu açıklamaktadır. Elektro-kompetan maya hücrelerinin hazırlanması ve ilgilenilen genin vektör ile PPA'lara transformasyonu gösterilmiş, ardından genin maya genomuna doğru şekilde entegre edildiğini kontrol etmek için maya DNA saflaştırma adımı anlatılmıştır. Son olarak, rekombinant proteinin ekspresyonunu gerçekleştireceğiz.

Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Steven Hallam laboratuvarından Maria. Ben de Helm Lab'den Marcus. Bugün size TRO maya PQ.Past stories'de rekombinant proteinleri eksprese etme prosedürünü göstereceğiz.

Çevresel DNA'nın ekstrakte edilip arşivlendiği ve meta genomik kütüphanelerin bulunduğu, tanımlanmamış mikroorganizmalardan proteinleri incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Metilotrofik maya Pichia pastoris'te rekombinant proteinlerin ekspresyonu, ilgilendiğiniz genin bir Pichia parent vektörüne çerçeve içi (in frame) klonlanmasını gerektirir.

Deneyimizde, PPIC Z alpha A vektörünü kullanıyoruz. Bu vektör; ilgilenilen genin metanolle indüklenen sıkı denetimli ekspresyonu için AO X one promotörünü, rekombinant proteinin sekresyonu için alfa faktör sekresyon sinyalini, hem e coli hem de pic'te seleksiyon için zaas ve direnç genini, C terminalinde c-mic epitopu içeren bir peptidi ve rekombinant proteinin saptanması ve saflaştırılması için bir poli histidin etiketini içerir. Transformasyon öncesinde, ilgilenilen geninizi içeren vektörü restriksiyon sindirimi ile lineerize edin. Biz PME one enzimini kullanıyoruz, ancak insertinizde bu restriksiyon bölgesi bulunmadığı sürece diğer restriksiyon bölgelerinin kullanımı da mümkündür.

Yeterli miktarda doğrusal vektör DNA'sı elde etmek için, ayrı tüplerde üç ila dört adet 50 µL'lik restriksiyon sindirim reaksiyonu hazırlayın; sindirim işleminden sonra tüm solüsyonları birleştirin ve konstrüktünüzü konsantre edin. PPA dous hücrelerine transformasyon gerçekleştirmek için, bir AmCon santrifüj filtre ünitesi ve bir MicroCon santrifüj filtre ünitesi kullanarak, 5 ila 10 µL steril su içerisinde 5 ila 20 µg doğrusal DNA'ya ihtiyacınız olacaktır. Elektrokometan PPA dous hazırlamak için, planlanan transformasyondan dört gün önce hücreleri SN içermeyen A-Y-P-D-S plakasına ekleyin; transformasyondan iki gün öncesine kadar, tekil koloniler oluşana dek veya bir ila iki gün boyunca 30 °C'de inkübe ederek büyütün.

PPA'nın veya suşun 5 ml'sini, 50 ml'lik bir Falcon tüpü içerisinde, YPD besiyerinde 30 °C'de gece boyunca büyütün. Transformasyondan bir gün önce, Falcon tüpünü çalkalayıcıya sabitlemek için bir erlene yerleştirin. 2 litrelik bir erlendeki 500 ml taze YPD besiyerini inoküle etmek için gece boyunca büyütülen kültürden 0,25 ml kullanın.

Bir çalkalayıcıda 30 °C'de, OD 600 değeri 1,3 ile 1,5 olana kadar gece boyunca tekrar büyütün. Transformasyon gününde buz, soğuk steril su ve 1 M sorbitolü hazır bulundurun. Hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 1500 G'de santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra, peleti 500 mililitre buz gibi soğuk, steril su ile süspande ederiz. Santrifüj tüplerinin kapasitesine bağlı olarak, hacmi iki ayrı tüpe bölmeniz veya birden fazla işlem yapmanız gerekebilir. Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti 250 mililitre buz gibi soğuk, steril su ile yeniden süspande edin.

Santrifüj tüplerinin kapasitesine bağlı olarak, ayrı hücre peletlerini tek bir tüpte birleştirebilirsiniz. Santrifüj sonrası hücreleri tekrar süspande ederken, bu kez peleti yeniden süspande edin. Resüspande edilen hücreleri 20 mL buz gibi soğuk 1 M sorbitol ile 50 mL'lik bir falcon tüpüne aktarın ve santrifüjleyin.

Son santrifüj işleminden sonra, peleti yaklaşık 1,5 ml nihai hacme ulaşana kadar bir mililitre buz gibi soğuk, bir molar sorbitol içerisinde yeniden süspande edin. Mikro santrifüj tüplerindeki yeniden süspande edilmiş hücreleri, transformasyon için kullanılana kadar buz üzerinde veya dört santigrat derece sıcaklıkta saklayın. Konsantre lineerize edilmiş yapıların PPA stok hücrelerine transformasyonundan önce, aşağıdaki reaktifleri ve cihazları hazırlayın.

Bir mikrosantrifüj tüpünü bir mililitre bir molar sorbitol ile doldurun ve buz üzerine yerleştirin. 0.2 santimetre electroporation. Buz üzerinde Vet.

Steril bir 15 mililitrelik cam tüpü etiketleyin ve pipetinizin yanında steril bir cam pastör pipeti bulundurun. Daha önce hazırlanan elektrokometan hücrelerden 80 mikrolitre miktarını buz soğuğundaki 0,2 santimetrelik elektroporasyon küvetine aktarın.

Plazmid DNA çözeltisini hücrelere ekleyin ve pipet ucunu yanlara hareket ettirerek karıştırın. Elektroporasyon küvetine aktarın. Hücrelerin bulunduğu küveti beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Ardından, küvetin dışını peçete ile silin ve hücreleri, kullandığınız spesifik elektroporasyon cihazı üreticisinin tomurcuklanan mayalar için önerdiği parametrelere göre pulse edin. Bu gösterimde, aşağıdaki koşullarla bir BioRad gene Pulser kullanılmıştır: 1500 volt şarj voltajı, 25 micro ferres kapasitans ve pulse işleminden hemen sonra 200 ohms direnç.

Vete bir mililitre buz gibi soğuk, bir molar sorbitol ekleyin. Vete içeriğini steril bir cam pastör pipeti kullanarak steril 15 mililitre tüpe aktarın. Tüpü çalkalamadan 30 °C'de 1,5 saat inkübe edin.

1,5 saat sonra, elektropore edilmiş hücreler ekime hazır hale gelir. Her biri 100 micrograms per milliliter Zain içeren, etiketlenmiş dört YPTS plağının her birine beş ila 10 adet sterilize edilmiş cam boncuk ekleyin. Elektroporasyon karışımından 250 microliters miktarında yayınız.

Her plakada karıştırın ve hücrelerin eşit şekilde yayılması için plağı yatay olarak sallayın. Plakaların 15 dakika boyunca kurumasını bekleyin ve ardından plakaları ters çevirerek agar üzerindeki boncukları çıkarın. Işığa duyarlı Zain'in bozulmasını önlemek için plakaları siyah plastik ile sarın ve koloniler oluşana kadar plakaları ters bir şekilde 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin.

12 koloni seçin. Klonları, mililitre başına 100 mikrogram zein içeren taze YPDS plaklarına ekerek saflaştırın. Protein ekspresyonu için PPA hücrelerini hazırlamak amacıyla, saflaştırılmış pichia kolonilerinden tek bir koloni seçin ve steril 250 mililitrelik bir flask içerisindeki 25 mililitre VMGY ortamına inoküle edin; kültür OD 600 değeri iki ile altı arasına ulaşana kadar 30 degrees Celsius sıcaklıkta çalkalamalı inkübatörde büyütün.

Hücreler uygun OD 600 değerine ulaştığında, saklama için hücrelerin gliserol stokunu hazırlayın. Hücre kültürünün 800 microliters kısmını iki mililitrelik kriyojenik tüpe aktarın ve 200 microliters sterilize gliserol ekleyin. Gliserol stokunu minus 80 degrees Celsius sıcaklıkta saklayın.

Ek olarak, hücre kültürünün 1.5 mililitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri, oda sıcaklığında bir dakika boyunca 1300 GS'de santrifüj ederek hasat edin. Peleti dört derece Celsius'ta saklayın.

Bu hücreler, hedef genin pichia genomuna entegre olduğunu doğrulamak amacıyla, inserta özgü primerlerle PCR sonrası agaroz jelde pichia izlerini analiz etmek için yapılacak maya DNA saflaştırmasında kullanılacaktır. 25 mililitrelik kültürün geri kalanını 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında 3000 Gs'de beş dakika santrifüj ederek hasat edin, süpernatanı dökün ve kalan medya kalıntılarını temizlemek için tüpü bir peçete üzerine ters çevirin. Hücre peletini yıkamak için 20 mililitre BMMY besiyerinde vorteksleyerek veya pipetle yukarı aşağı çekerek resüsпендируйте ve santrifüjleyin.

Süpernatant dekante edildikten sonra, hücre peleti vorteksleme veya pipetle yukarı aşağı çekme yoluyla BMMY ekspresyon indüksiyon besiyerinde 1,0 OD 600 değerine ulaşana kadar tekrar süspanse edilir. Kültürü bir litrelik bölmeli (baffled) erlene aktarın ve erleni 200 mililitrelik bir tıpayla kapatın.

Kültüre daha fazla oksijen sağladıkları için bölmeli erlenlerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Metanol indüksiyonu sırasında verimli protein ekspresyonu için, büyümeyi 30 °C'de sürdürmek amacıyla erleni inkübatöre yerleştirin. İnkübatörünüzün sıcaklığı dalgalanıyorsa, sıcaklığın 30 °C'yi aşmaması önemlidir.

Sıcaklığı 28 °C olarak ayarlayın. Ekspresyonun başlamasından sonra belirli zaman noktalarında indüksiyonu sürdürmek için her 24 saatte bir, final konsantrasyonu %0,5 metanol olacak şekilde steril saf metanol ekleyin; kültürden 1 mL alarak 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1300 ×g'de 2,5 dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, süpernatanı ayrı bir 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Süpernatanları ve hücre peletlerini, ileri analizlere kadar -80 °C'de saklayın. İndüksiyon sonrası protein ekspresyonu için optimal zaman aralığını belirlemek amacıyla farklı zaman noktalarından alınan örnekler analiz edilecektir. Şimdi, konakçı sistem olarak PIA Pastis kullanılarak rekombinant proteinlerin başarıyla eksprese edildiğine dair bazı temsili sonuçları sunuyoruz.

Bu western blot görüntüsü, 24 saatlik ekspresyon sonrası eksprese edilen dört proteini göstermektedir. İmmunobloting için kullanılan antikor, acemic HRP antikoru idi. İkinci şerit bir negatif kontroldür ve ana vektörle transforme edildikleri için rekombinant protein eksprese etmeyen hücrelerden elde edilen süpernatan ile yüklenmiştir.

Ökaryotik konak PQ.Plus kullanarak rekombinant proteinlerin nasıl eksprese edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, ilgilendiğiniz genin klonlandığını ve çerçeveye oturduğunu doğrulamak için konstrüktünüzün dizilemiş olması ve işleme başlamadan önce tüm plaklarınız ile reaktiflerinizin hazır olması önemlidir. Ayrıca, metanol indüksiyonu ile protein ekspresyonu öncesinde yüksek sayıda transforman elde etmek için yeterli miktarda lineerize plazmit hazırlamanız önemlidir. Protein ekspresyonunuzu inhibe edebilecek gliserol kalıntılarını temizlemek için hücre pelletinizi iyice yıkadığınızdan emin olun.

İşte hepsi bu. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.