Name: Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Öğrenin Xenopus oositlerinin ev sahibi transfer yöntemiyle döllenmesini. Bu teknik, kültürde manipüle edilmiş oositlerden gelişen embriyolar elde etmeyi sağlar ve gelişim biyolojisi araştırmalarına katkıda bulunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar yazının eleştirel okuma Houston laboratuar sayesinde üyeleri istiyorum. Araştırma DWH verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM083999) tarafından desteklenen

1. Yumurtalık Doku Cerrahi Kaldırma <ol class="lalpha"><li> Deney büyüklüğüne bağlı olarak 400-800 ml arasında, oosit kültür ortamı yeni bir parti (Malzeme OCM) hazırlayın. Fenol kırmızısı, koyu kırmızı bir renk (5N NaOH altı ya da çok küçük damla) olana kadar, 7,6-7,8 pH ayarlayın. PH pH elektrodu medya kontamine yılından bu yana ayrı bir tüp içinde kontrol etmek için küçük bir miktarını dökün. OCM 18 ° C&#39;de saklanır ve bir hafta içinde kullanılmalıdır. </li><li> ~ 2L tamponlu anestezik solüsyonu (Malzemeleri) 3-5 kadın ve bir yer seçin. Biz gün ya da ameliyat öncesinde beslenen kurbağa kullanarak kaçınmaya çalışın. Kurbağa anestezi yenik düşen iken,% 70 EtOH, cerrahi alan dezenfekte ve cerrahi aletler hazırlamak. </li><li> 250 sıcak bir boncuk sterilizatör 20 saniyelik daldırma cerrahi aletler sterilize ° C. Aşağıdaki araçların yandan edilmelidir: neşter sapı (# 3) ve blade (# 10 veya 11), Dumont forseps, Bonn iris makası (eğri veya düz), Halsey veya Olsen Hegar mikro iğne tutucu ve dikişlerle birkaç çift. Sterilize aletler steril bir Petri kabı yerleştirin veya steril tutmak için dikiş paketi iç. Iğne iğne tutucu başlamadan önce istenilen açıda tutun. Kolu anahtarlama aletleri olmadan sütür kırpmak için kullanılabilir makas bıçakları, içerdiğinden Olsen-Hegar iğnelikler tercih ediyor. </li><li> 10 dakika sonra cerrahi anestezi düzlemde elde edildiğini kontrol edin. Anestezi kurbağa hareket duracak ve ayak tutam yanıt vermez veya devredildi. Anestezi, işlemleri gerçekleştirmek için yeterli zaman daha fazla 15 dakika sürmelidir. Don uygun cerrahi giydirmek. Bu kişisel tercih ve kurumsal hayvan bakımı kurallarına bağlı olarak temiz eldiven (lateks), laboratuar kat, cerrahi maske, içerebilir. </li><li> Aseptik teknik Not: Kurbağa cilt salgıları aseptik teknik mümkün olduğunca uyulmalıdır rağmen, genellikle ameliyat sırasında kontaminasyon insidansını azaltmak antimikrobiyal peptidler içerir. Cerrahi örtüler kullanılabilir, ancak kurumsal IACUCs tarafından gerekli olmayabilir ve pek yarar sağlamaz. Elinde steril aletleri, dikiş materyali veya kesi sitesi ipuçları dokunmatik Genellikle &quot;ucu tekniği&quot;. Araçlar (boncuk sterilizatör) cilt aşağıdaki kesi tekrar steril edilebilir ve steril bir alana yerleştirerek araçların (örneğin, bir Petri kabında ya da dikiş paketi gibi) benchtop muhafaza edilmelidir. Kurumsal gereksinimleri önemli ölçüde farklı olabilir, bu nedenle kurumların yönergeleri takip edin ve performans ameliyatları öncesinde uygun eğitim alma. </li><li> Anestezik kurbağa ve bir nemli bir cerrahi silin sırt yatma yeri çıkarın. Not. Seyreltilmiş povidin iyot (1:20) veya klorheksidin (% 0.75) durulama cilt temizlenir. Ancak, bu amfibiyenlerin hassas cildine zarar verecek, ticari cerrahi scrubs, sabun ve% 70 izopropil alkol kaçının. </li><li> Orta hatta lateral karın, alt kısmında ciltte kesi ya da küçük bir neşter iris makası kullanarak, küçük bir (1,5 cm 1). Alternatif tarafta aynı kurbağa sonraki kesiler yapılmalıdır, birbirinden aralıklı. Kesikler ya paralel ya da dik orta hatta yapılabilir. </li><li> Iki aşamada deri ve karın kas kesiler olun. Cilt kestikten sonra, kas tabakası ve forseps ile çevreleyen beyaz renkli fasya kaldırın ve yükseltilmiş bir kas kesi yapmak. Makas kullanın ve deneyin bir hızla kesim temiz yara kenarları bırakarak vücut boşluğunda maruz yapmak, düz kesmek. Sadece fasya kesilirse, geri çekilecektir ve dikilmesi daha zor hale getirecek. Kas kaldırma, yanlışlıkla herhangi bir iç organların yaralama önlemeye yardımcı olacaktır. Ayrıca, kas tabakaları içinde görünen herhangi bir lenf kalpleri ve kan damarları aracılığıyla kesme önlemek için deneyin. Bu over kolayca çekilebilir böylece kesi makas ile uzatmak. </li><li> Kesi yapıldıktan sonra Over açıkça görünür olmalıdır. Yumurtalık temin etmek, forseps ile kavramak ve yumurtalık dokusu dışa. Istenilen miktarda doku kaldırılır ve vücut duvarı düzeyinde kesilmiş. Bu, enfeksiyon veya başka komplikasyonlara bir kaynak olabilir, coelomic boşluğuna geri doku şeyler yapmayın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında küçük bir parça yumurtalık hemen gözlemlemek ve onların kalitesini test etmek için bir kaç oosit defolliculate. Sağlam olmalı ve eşit boyda ve renklenmesi. Eğer kabul edilebilir, yumurtalık dokusunun istenilen miktarda kaldırmak ve kesi sütür. 90 mm Petri kabı dolduracak kadar genellikle çoğu deneyler için yeterli. Oosit kalitesi şüpheli ise, kurbağa sütür ve farklı bir kadın ile işlemi tekrarlayın. </li><li> Ilk kas ve fasya tabakası dikilmesi kesi kapatın. N takın<html> fasya tabakası geçmesine de dikkat ederek, bir kaç milimetre kesi lateral eedle. Sütürleri sadece kas dokusu gözyaşı ve gevşek gelebilir. Forseps kesi karşı tarafında aşağıda iğneyi yardımcı olmak için kullanın. Özen aracılığıyla tüm yol çekmek için değil, vücut dışından iğne yeniden kavramak ve ile dikiş kuyruk kalır ya da birkaç santim kadar çekin ve bırakın. </li><li> Dikiş basit bir kesintiye desen yara kapatın. Biz cerrah kare knot (resif knot) yapmak için temel bir araç kravat kullanırlar. Döngü iğne tutucu çevresinde dikiş, kuyruk uzun sonuna kavramak ve döngü içinde kendinize doğru çekin ve sıkın. Döngü ve tekrar üzerinden çekin, bu kez sizden uzağa iğne tutucu çekin. Üçüncü bir atış (ilk olarak aynı yönde), ek güvenlik için kullanılabilir. Dikiş, kesin, kısa kuyruk bırakarak ve birkaç milimetre ötede başka bir dikiş kas yapmak. İki sütür küçük sütürler için yeterli; üç büyük olanlar için. Deri tabakası için tekrarlayın. Temel sütür tekniği YouTube&#39;da video gösterileri mevcuttur &quot;alet kravat&quot; için arama; temel tekniği aynı olmasına rağmen, pek çok seçim için vardır. </li><li> Kadın deiyonize su ile durulayın ve serin (18 ° C) su ile dolu bir kurtarma kova onun yerine. Laboratuarda iken, kurbağa kloraminler kaldırmak için Amquel ile tedavi musluk suyu tutulur. Her birkaç dakika hafifçe su kurbağa kaldırın ve anestezi kurtarma göstergesidir gulping ya da şişkin göz hareketleri, bakın. </li><li> Not: kadın operasyonların bir sayıdan sonra iyi oosit üretmek için devam edecek olsa da Survival cerrahi, yumurtalık dokusu elde etmek için kesinlikle gerekli değil. Hayatta kalma ameliyat yapılması da kullanılan hayvanların sayıları aşağı kesecek. Omurgalı hayatta kalma cerrahi yöntemleri, post-op bakım ve izleme hayvan bakım ünitesi ve bir birey izin ameliyatları sayısı için yönergeleri izleyin emin olun. </li></ol> 2. Kültürleme ve Defolliculating Oosit <ol class="lalpha"><li> Ameliyat bittikten hemen sonra, 90 mm ​​çanak başına 5-6 adet küçük parçalara (~ 2 cm 2) ve taze OCM saklamak, yumurtalık alt bölümlere. Bireysel yumurtalık loblar, açık kesilerek dışarı basık ve kare şeklinde parçalara ayrılır. Bu temiz OCM durulanır ve kültür için yemekler konur. Düzleştirme ve yumurtalık kadar bölünebilen kültür ömrünü uzatmak ve defolliculation kolaylaştırır. </li><li> OCM küçük bir yemek için bir lob hareket ettirin ve elle 300-500 oosit defolliculate. Transferi oosit, yangın cilalanmış steril bir pipet kullanarak. Biz pamuk takılı çeşitli kültürlerin kontaminasyonu en aza indirmek için gerekli olduğunu bulduk. 18 oosit Mağaza ° C (orta yemekleri (Falcon 1007)) 100-150 grupları 8 mL OCM. Uygulama ile, 1-2 saat içinde yeterli sayıda oosit defolliculate mümkün olmalıdır. Fertilizable değildir beri Collagenased oosit konak transferi için uygun değildir. </li><li> Yöntemi Defolliculating. Smith ve ark. Açıklanan temel yöntem aşağıdaki saatçiler &#39;forsepsi (İnce Bilim Araçları, 5s Dumont # 4s veya #), (1991) defolliculate. Forseps bir çift (baskın elinde) kullanarak, tam yetiştirilen sahne VI oosit folikül yumurtalık (sap) eklenir yere yakın çevresindeki teka bağ doku tabakası kavramak. Forseps diğer çifti ile ilk çifti bitişik yumurtalık kavramak. Oosit üzerinden çekerek hafifçe folikül katmanı açmak gözyaşı. Doku yavaşça dışarı oosit tease. Başarıyla defolliculated oositlerin oosit sadece folikül katmanı çıkarmadan çıkardı ve görünür kan damarları yoksun olacak daha floppier. </li><li> Not: karşılamak için ipuçları, forseps ipuçları için yeterli ancak çok hafif bir basınç korumak için şarttır. Çok sıkı sürükleyici yeni başlayanlar arasında ortak ve sağlam folikül çekti oosit neden olacaktır. Defolliculating forseps iyi bir çifti için özel olarak tutun. Ipuçları tam olarak yerine getirmeli ve Xenopus embriyolar (Şekil 1) eksplantlar yapmak için forseps biraz blunter olmalıdır . </li><li> Progesteron ve deney iptal ile yaklaşık 20 olgunlaşma oranı düşükse rutin olgun testi (oda sıcaklığında 6-7 saat sonra &lt;% 50). </li><li> Bu noktada, oosit, oligo, morfolino veya mRNA mikroenjeksiyon gibi manipüle edip istediğiniz gibi kültür olabilir. Enjeksiyon prosedürleri laboratuar başına değişir, bu nedenle burada bu tarif olmaz. Oosit OCM bir hafta kadar korunur, ancak izolasyon 96 saat içinde transferi için bunları kullanmak en iyisidir, böylece genel sağlık düşüşler olabilir. </li><li> Hayati boyalar sınırlamalar nedeniyle sadece beş-altı grupları (kontrol dahil), tek bir kadın transfer edilebilir olduğunu aklınızda tutun, buna göre deneyler planı. </li></ol>&quot;&gt; 3 Oosit Olgunlaşma ve Aday Ana Dişiler uyarılması <ol class="lalpha"><li> Oligo tükenmesi bir kurtarma yapmak durumunda oligo ~ 24-48 saat sonra mRNA (genellikle 50-300 pg RNA) enjekte edilir. Oligos bu zamana kadar bozulmuş olacak ve enjekte edilen RNA zarar vermemelidir. </li><li> Akşam transferi gerçekleştirmeden önce, orta yemekler 8 mL OCM (son progesteron konsantrasyonu ~ 2 mcM) oosit progesteron çalışma çözümü (EtOH 1mm) 16 mcL ekleyin. 18 az 10-12 saat inkübe ° C oosit olgunlaşması için izin vermek. </li><li> HCG kurbağa başına 1000 adet ile 3-5 kadınlarda yumurtlama neden enjekte edilir. Bizim deneyleri oosit olgunlaşma ve aynı zamanda etrafında hCG enjeksiyonu yapılır (örneğin, 22:00 -10 PM) ev sahipliği içine implantasyon öncesinde yaklaşık 12 saat, daha iyi çalışmak için görünüyor. RT veya 18 ° C gecede kadın bırakın. </li></ol> 4. Hazırlık ve Oosit Vital Boya Boyama <ol class="lalpha"><li> Transfer sabahı, ~ 45-60 &#39;kurmak ve yordamı gerçekleştirmek için izin verir. Bu noktada, olgun oosit, mRNA demonte veya protein ifadesi etkinliğini daha sonraki analiz için dondurulur. Ayrıca, oosit enfekte olup olmadığını kontrol edin ve iyi bir olgunlaşma oranı (% 50) olduğunu. Enfekte oosit döller. Hayati boyalar (Malzeme) çözülme ve 5 dakika maksimum hızda dönmeye. </li><li> 15 &#39;sallanan oosit yemekleri ve inkübe uygun vital boya (ler) 80 mcL ekleyerek Rengi farklı deneysel gruplar. Bu süre zarfında, ev sahibi kadın ve anestezi başlayın. Yavaş yavaş normal veya hafif bir sıkma ile bol yumurta üreten bir yumurtlayarak bir kurbağa seçin. Konak Yumurta iyi kalite olmalıdır. Dizeleri, yumurta veya ezilmiş yumurta döşeme kadın kaçının. </li><li> Renkli yumurta, taze OCM büyük bir çanak, yıkama ve transfer etmek için önce onları bir kenara kısaca girdap aktarın. </li><li> Oosit nakli için bir oosit (~ 1.5 mm) karşılamak için yetecek geniş delikli steril bir Pasteur pipeti hazırlayın. Elmas kalemle pipet Puan ve temiz kırmak. Yangın cilası, kenarları düzgün kadar özen açılış kapalı eritmek için değil. </li></ol> 5. Oosit Nakli Sahne <ol class="lalpha"><li> Oosit nakli, Bölüm I açıklandığı gibi aynı cerrahi işlemler, yumurtalık kaldırarak yerine, manipüle oosit bir pipet ile vücut boşluğuna tanıtıldı olmasına rağmen kullanır. İdeal olarak, transfer işlemi mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilir ve insizyon boyutu mümkün olduğunca küçük tutulmalıdır. </li><li> Ev sahibi kadın Anesthesize ve cerrahi aletler, I. Bölüm I. kesi daha küçük olabilir açıklandığı gibi olun ve kesi Bölüm açıklanan hazırlamak, ancak transfer pipeti (Şekil 2A) delik sığacak kadar büyük olması gerekir. </li><li> Oosit nakli için, kavramak ve yükseltmek, kas ve fasya flep ve forseps ile yukarıda hazırlanan Pasteur pipeti kullanarak deneysel oosit tanıtmak. Swirl çanak oositlerin merkezi haline onları toplamak ve mümkün olduğunca çok emmek. Tanıtılıyor aşırı sıvı önlemek ve kesi içine pipet ucu yerleştirin ve yavaş yavaş oosit vücut boşluğuna (Şekil 2B) damlama izin oosit pipetin ucunu yerleşmelerine izin verir. Her oosit transfer edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Dikilmesi başladı, ya da oosit kesi dökülebilir kadar, herhangi bir zamanda kas tabakası bırakmayın. </li><li> Oosit transfer edildikten sonra, kesi her iki taraf forseps ile kavramak ve bunları bir araya getirmek, oosit vücut boşluğuna yerleşmelerine izin verme. Açıklandığı gibi, ilk düğüm (Şekil 2C) bağlıdır kadar kas ve fasya yukarı doğru gerilimi tutmak için özen dikilmesi başlayın. Bu atılmaktan oosit tutacak ve kesi kenarları eşit olarak iyileşmek için izin verecek. Kas / fasya tabakası başka bir sütür ekleyin ve sonra cilt sütür. </li><li> Kadın deiyonize su ile durulayın ve soğutmalı (18 ° C) Amquel arıtılmış su ile dolu bir kurtarma kovası onu yer. Yukarıdaki gibi anestezi onu kurtarma Monitör. O ameliyattan sonra normal yumurtalarını başlamalıdır. </li><li> Testisler normal prosedürleri kullanarak bir erkek kurbağa alın. Kadar gerekli OCM veya L15 testisler saklayın. Transferi deneyler gübreleme zaman taze testis tercih ediyor. </li></ol> 6. Oosit, Kurtarma ve in vitro Fertilizasyon <ol class="lalpha"><li> Periton kirpikler vücut boşluğunda ön siyon hatası açıklıklar transfer yumurta (ve konağın normal coelomic yumurta) sürücü olacaktır. Renkli yumurtalar normal sıkarak transferi 2-3 saat sonra başlayan geri kazanılabilir. Kadın döşeme durana kadar Yumurta her yarım saatte bir ya da elde edilebilir. </li><li> Gübreleme de bir SPE4 dakika için rm süspansiyon (~ 4 ml 1x MMR). Sel ve 0.1x MMR ile yoğun durulama. Yumurta normalde aktif hale getirmelisiniz ve tutunmaya ~ 1.5-2 saat gübreleme sonra başlayacak. Aktarılan yumurta biraz daha sonra ev sahibi yumurta daha tutunmaya sık sık olacak. </li><li> Ayrı kaplarına normal ve sıralama embriyolar gibi sistein ile jöle kat çıkarın. Bu deney ihtiyaçlarına bağlı olarak, herhangi bir aşamada yapılabilir. 4-hücreli sahne etrafında çeşitli renk ve geç blastula aşamalarında en zor tanımlamak için genellikle kolay. Temiz 0.1x MMR (orta çanak başına &lt;50), düşük yoğunluklu Kültür yumurta. Bu noktadan sonra, embriyolar tedavi ve normalde manipüle edilebilir. </li><li> Komplikasyonlar için önümüzdeki birkaç gün içinde hayvan tesis etmek ve izlemek için kurbağa dönün. </li><li> Alternatif döllenme yöntemi; yüksek tuz tamponu yumurtlama <ol class="lroman"><li> Kurbağa anestezi kurtarıldı sonra ~ 1L yüksek tuz MMR (1.2x) içine onu yer. Kadın, yaklaşık 4-6 saat boyunca tampon içine yumurtalarını bırakmak için izin verin. 1.2x MMR drenaj ve temiz bir tabak içine renkli yumurta sıralamak, kalan yumurta sıkmak; mümkün olan tüm sıvı çıkarın. </li><li> 0.3x MMR ile iyice yıkayın ve yumurta (10 dakika) aktive kadar 0.3x MMR / sperm süspansiyonu minimal volüm döller. Sel yukarıdaki gibi 0.1x MMR ve kültürü ile. Birçok yumurta aynı sahneyi ya da yumurta manuel ifade donör oosit zarar ihtiyaç vardır, bu seçenek kullanışlıdır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+in+vitro%3A+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li>
<li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li>
<li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+Xdazl%2C+a+germ+plasm-localized+RNA%2C+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li>
<li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+mother+can+help%3A+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li>
<li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRugh%2C+R+%22Experimental+Embryology%3A+Techniques+and+procedures%22">Experimental Embryology: Techniques and procedures</a>. , Burgess. Minneapolis, MN. (1962).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li>
<li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+and+oocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li>
<li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability%2C+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li>
<li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+beta-catenin+establishes+a+%27dorsal+signal%27+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li>
<li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li>
<li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuck%2C+MV+%22A+comparative+methods+approach+to+the+study+of+oocytes+and+embryos%22">A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos</a>. Richter, J. D. , Oxford University Press. Oxford. 341-354 (1998).</li>
</ol>

University Iowa IACUC Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Başarılı bir transfer, gübreleme ve oosit&gt;% 50 (Şekil 3) normal bölünme neden olacaktır. Genellikle% 30-60 arasında transfer edilen oosit neurula aşamaları geçmiş hayatta kalacaktır. Biz genellikle 75-150 çeşitli analiz için yeterli embriyolar verecektir deney grubu başına oosit, (in situ, RT-PCR) gibi fenotip görselleştirme aktarın. Önemli ölçüde daha fazla oosit implantasyon büyük ölçüde verim artışı görünmüyor. Ayrıca, grup başına en az 30 oosit en azından bazı gastrulasyon üzerinden yaptığınız garanti altına alma...

Çözümler ve yemek tarifleri: OCM (Oosit kültür ortamı, Wylie ark değiştirilmiş, 1996.) <table border="0"><tbody><tr><td> % 70 Leibovitz L-15 orta (L-glutamin içeren) </td><td> (Invitrogen 11.415-064) </td></tr><tr><td> 0.4 mg / ml Sığır serum albumini (BSA, fraksiyon V) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x Penisilin-Streptomisin </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> 5N NaOH ile pH 7,6-7,8 ayarlayın </td></tr><tr><td colspan="2"> 18 ° C&#39;de taze haftalık, mağaza olun </td></tr></tbody></table> 10X MMR (Marc Modifiye Zil Çözüm; Zuck ve ark, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> pH 7,6-7,8 uyum </td></tr><tr><td> Mağaza, 4 ° C </td></tr></tbody></table> Anestezik çözümü <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-aminobenzoik asit Etil Ester (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0.7 g / L sodyum bikarbonat </td></tr><tr><td colspan="2"> Amquel arıtılmış su içinde çözülür </td></tr><tr><td colspan="2"> Taze haftalık olun </td></tr></tbody></table> Progesteron stokları <table border="0"><tbody><tr><td> % 100 Etanol 10 mM Progesteron (Sigma P-0130) </td></tr><tr><td> 500x bir hisse senedi için% 100 EtOH 1 mM sulandırınız / çalışma çözümü </td></tr><tr><td> -20 ° C&#39;de muhafaza </td></tr></tbody></table> Vital boyalar (Heasman ve ark, 1991 modifiye) <table border="0"><tbody><tr><td> Mavi:% 0.1 Nil Mavi. </td><td> (121.479 Aldrich-5G), </td></tr><tr><td> Kırmızı:% 0.25 Sabit Kırmızı </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown:% 1 Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Yeşil (80 ul mavi + 80 ul kahverengi), </td></tr><tr><td colspan="2"> Leylak (80 mavi + 80 ul ul kırmızı). </td></tr><tr><td colspan="2"> Altıncı renk, Orange (80 ul kırmızı + 80 ul kahverengi) de kullanılabilir, ancak kahverengi ayırt etmek genellikle zordur. </td></tr></tbody></table> Mavi, Kırmızı ve Brown stokları deiyonize su, 50 ml tüpler oluşur sallanan ile 20 dakika inkübe ve klinik santrifüj eğirilir. Süpernatantlar mikrofuge&#39;de tüpler içine aliquotted ve -20 ° C&#39;de saklanır

gübrelenmesi xenopus oositleri host transfer yöntemi kullanılarak

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Erken gelişim omurgalı maternal miras moleküllerin katkısının incelenmesi genellikle etkisi anne-mutant hayvanlar üretmek için gerekli zaman ve masraf tarafından engellenmektedir. Ayrıca, pek çok teknik Xenopus ve zebrafish gibi organizmaların gen fonksiyonu eksprese veya etkisizleştirmek için yeterince Wnt sinyal gibi kritik anne sinyalizasyon yolaklar hedef başarısız. Xenopus, kültürlü oosit gen işlevi manipüle ve daha sonra onları gübreleme, bu sorunların bir ölçüde iyileştirebilir . Oosit donör yumurtalık dokusu elle defolliculated istediğiniz gibi enjekte veya kültür tedavi ve sonra olgunlaşma ikna etmek için progesteron ile uyarılır. Sonra, ev sahibi fallop borusunda transloke ve modifikasyon ve gübreleme için gerekli jöle kat kazanmak olacak bunun üzerine oosit yumurtladığımı ev sahibi kadın kurbağa vücut boşluğuna tanıtıldı. Oluşan embriyolar daha sonra istenilen aşamaya kaldırdı ve hiçbir deneysel tedirginlikler etkileri için analiz edilebilir. Bu konak-devret yöntemi erken gelişiminin temel mekanizmaları ortaya çıkarılması son derece etkili ve herhangi bir diğer omurgalı model organizmada mevcut değil deneysel olanakları geniş bir yelpazede sağlar.

Gübreleme için Prosedürü<em&gt; Xenopus oositleri</em&gt; Ana aktarma yöntemi.

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Anne soyundan aktarılan moleküllerin omurgalıların erken gelişimine olan katkısının incelenmesi, genellikle ... için gerekli olan zaman ve maliyet nedeniyle zorlaşmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, kültürde manipüle edilmiş OO bölgelerinden türetilen gelişmekte olan embriyolar elde etmektir. Bu işlem, öncelikle bir dişiden donör oo bölgelerinin izole edilmesi ve bunların kültürde istenilen şekilde manipüle edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bu sitlerin progesteron kullanılarak olgunlaşmaya teşvik edilmesi ve yumurta döşemeyi uyarmak için potansiyel konakçılar olan dişilerin gonadotropin ile enjekte edilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, donör sitlerin vital boyalarla boyanması ve konakçı olarak görev yapacak bir dişinin hazırlanmasıdır. Prosedürün son adımı, donör sitlerin cerrahi olarak konakçının vücut boşluğuna aktarılması ve birkaç saat sonra aktarılan yumurtaların geri kazanılıp dölletilmesidir. Sonuçta, deneysel olarak manipüle edilen donörden elde edilen normal şekilde bölünen embriyolar oluşur.Sitositler, tıpkı normal embriyolar gibi elde edilebilir ve analiz edilebilir. Merhaba, ben Iowa Üniversitesi'nden Doug Houston. Bugün, konak transfer prosedürünün nasıl gerçekleştirileceğini göstermek için Cold Spring Harbor Xap kursundayız.Laboratuvarımızda, maternal gen ürünlerinin rollerini incelemek ve erken zap gelişimindeki rollerini belirlemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Cerrahi işleme başlamadan önce, cerrahi alanın dezenfekte edildiğinden, taze ortamların ve steril aletlerin hazır olduğundan emin olun.Sütür iğnesini iğne tutucu ile istenen yönde kavrayın. Anestezi uygulanmış dişi bir kurbağayı, sırt üstü gelecek şekilde nemli bir cerrahi mendilin üzerine yerleştirin. Küçük iris makasları kullanarak, karnın alt kısmında, orta hattın yan tarafındaki deride bir santimetrelik bir insizyon yapın.Karın kasını kesmeyin. Kas tabakasını ve etraftaki beyaz renkli fasyayı kaldırmak için pens kullanın. Kas boyunca düz ve tek bir hızlı kesi yapmak için iris makası kullanın.İnsizyonu, yumurtalığı açığa çıkaracak şekilde bir santimetreye kadar genişletin. Yumurtalığı kavramak ve bir lobu dışarı çekmek için pens kullanın. Lobu, gövde duvarı seviyesinden kesip almak için makas kullanın.Dokuyu, oosit kültür ortamı veya OCM içeren 90 milimetrelik bir kaba yerleştirin ve yumurtalık kalitesini hemen bir diseksiyon mikroskobu altında değerlendirin. Birkaç oosit pens ile ayrılabilir. Oositler sert, tek tip boyut ve renkteyse, kurbağadan istenilen miktarda yumurtalık dokusunu çıkarın ve OCM içeren 90 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.Kesi yerini kapatın. İğneyi, hem kas hem de fasyadan geçtiğinden emin olarak, kesinin birkaç milimetre lateralinden yerleştirin. Sütürün kuyruk kısmını tamamen çekmemeye dikkat ederek, iğneyi yönlendirmek için forseps kullanın.Yarayı, basit ayrı dikiş paterni ve cerrahi kare düğümlerle kapatın. Teknik, beraberindeki metinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Dikiş işlemini cilt tabakasıyla tekrarlayın.Dişiyi deiyonize su ile durulayın ve serin suyla dolu bir iyileşme kovasına yerleştirin. Cerrahi işlem biter bitmez, yumurtalığı alt bölümlere ayırmak için makas kullanın. Münferit lobları açın, düzleştirin ve iki santimetrekarelik parçalar halinde kesin.Temiz besiyeri ile durulayın ve pens kullanın. Bireysel sitleri izole etmek için beş ila altı parçayı, OCM içeren taze bir 90 mm'lik kaba aktarın. Parçalardan birini küçük bir besiyeri kabına aktararak başlayın ve bir diseksiyon mikroskobuna getirin.Üç ila 500 oositi manuel olarak ayırmak için saatçi pensi kullanın. İkinci bir pens çiftiyle, stok yakınındaki tam gelişmiş altıncı evre oositini çevreleyen bağ doku tabakasını tutun. İlk pens çiftiyle oosite bitişik olan yumurtalığı kavrayın.Folikül tabakasını yırtmak için oositin üzerinden hafifçe çekin. Siti dokudan dikkatlice ayırın. Folikülleri uzaklaştırılmış sitlerde görünür kan damarları yoktur ve bunlar, folikülleri sağlam olan sitlerden daha gevşektir.100 ila 150 oosit grubunu, sekiz mililitre OCM içeren 60 milimetrelik kültür kaplarına aktarmak için pamukla tıkanmış, uçları ateşle cilalanmış bir pipet kullanın. Oositleri kapları içerisinde 18 °C'de saklayın. Oositler artık istenilen sayıda protokol uyarınca antisense oligonükleotidler veya mRNA'lar ile mikroenjekte edilebilir ve ardından 18 °C'lik bir inkübatörde OCM içerisinde kültüre edilebilir.Transfer için oositleri, izolasyondan sonraki 96 saat içinde, transferin gerçekleştirileceği günden önceki akşam kullanın. Gerekli oositleri olgunlaştırmak için, oositleri içeren ortama, son konsantrasyon iki mikromolar olacak şekilde 16 mikrolitre bir milimolar progesteron ekleyerek inkübe edin. Aynı akşam 18 derece Celsius'ta 10 ila 12 saat boyunca inkübe edin ve yumurtlamayı başlatmak için üç ila beş dişiye kurbağa başına 1000 ünite insan koriyonik gonadotropini enjekte edin.Transfer gününün sabahında dişileri oda sıcaklığında veya 18 °C'de gece boyunca bekletin. Kültürlenen sitlerin olgunlaştığından emin olmak için diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Vital boyaları ekleyin ve 10.000 G'den daha yüksek bir hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.Kalıntılardan kaynaklanan arka planı azaltmak için, her bir oosit deneysel grubuna 80 µL uygun canlılık boyası ekleyin. Bir sallayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Boyanan yumurtaları 90 mm'lik taze o cm içeren bir kaba aktarın ve yıkamak için kısa süre boyunca dairesel hareketlerle karıştırın.Sitositlerin aktarımı için kullanılacak bir pipet hazırlayın. Konik kısmın yaklaşık iki santimetre altına bir elmas kalemle çizik atın ve temiz bir şekilde kırın. Bu işlem, bir oositin sığabileceği büyüklükte, 1,5 milimetre açıklığa sahip bir pipet oluşturmalıdır.Ucu kapatmadan, kenarlar pürüzsüz hale gelene kadar uç kısmını cilalayın. Oosit transplantasyonu. Cerrahi işlem mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir.Anestezi uygulanmış, kaliteli yumurta veren bir dişiye daha önce yapıldığı gibi bir insizyon yapın. Bu insizyon, transfer borusunun sığabileceği minimum uzunlukta olmalıdır. Bir santimetreden daha az bir derinlikte pipetleme yapın.Deneysel oositlerin bulunduğu kabı, oositleri kabın merkezinde toplamak için hafifçe çalkalayın. Hazırlanan pastür pipetiyle mümkün olduğunca çok oositi çekin. Kurbağaya aktarılan sıvı miktarını minimize etmek için oositlerin pipetin ucuna çökmesini bekleyin.Kas ve fasyanın bir flebini kavramak ve kaldırmak için pens kullanın. Pipetin ucunu insizyona yerleştirin ve oositlerin vücut boşluğuna yavaşça süzülmesini sağlayın. Tüm oositler aktarılana kadar işlemi tekrarlayın.Oositlerin insizyondan dışarı taşmasını önlemek için kas tabakasını serbest bırakmayın. İnsizyonun her iki yanını tutmak ve oositlerin vücut boşluğuna yerleşmesini sağlamak için pens kullanın. İlk düğüm atılana kadar yukarı doğru gerginliği korumaya dikkat ederek, kas ve fasya tabakasını daha önce yapıldığı gibi dikmeye başlayın.Cildi dikin. Kurbağayı deiyonize su ile durulayın ve daha önce olduğu gibi iyileşmesine izin verin. Kurbağa, ameliyattan iki ila üç saat sonra normal şekilde yumurtlamaya başlamalıdır.Dişi yumurtlamayı bırakana kadar her yarım saatte bir normal sıkma yöntemiyle yumurtaları toplayıp bir toplama kabına alın. Toplanan yumurtalara, 1X XMMR içinde taze toplanmış sperm süspansiyonundan 4 mL ekleyin ve oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin. Yumurtaları oda sıcaklığındaki sıvı ile bolca yıkayıp durulayın.Aktivasyon ve parçalanmanın gerçekleşmesi için XMMR oda sıcaklığında inkübe edilir. Jöle tabakasını kaldırmak için herhangi bir aşamada sistein kullanılabilir. Aktarılan embriyolar daha sonra renklerine göre ayrı kaplara ayrılabilir ve normal embriyolar gibi kültüre edilebilir.Genellikle, aktarılan yumurtaların üçte ikisinden fazlası döllenmeden sonraki dakikalar içinde aktive olur ve animal kutupta güçlü kortikal kontraksiyon sergiler. Çoğu deneyde, aktarılan yumurtaların yarısından fazlası normal ilk bölünme sürecini gerçekleştirir. Bazı durumlarda bölünme, elimizdeki konakçı yumurtalara kıyasla yaklaşık 20 dakika gecikebilir.Transfer edilen embriyoların %30 ila %60'ı normal şekilde gastrülasyona girecek ve nöral aşamanın ötesinde hayatta kalacaktır. Transfer edilen embriyolar, gelişimin birçok günü boyunca canlı boya renklerini koruyacaktır. Enjekte edilmemiş kontrol oositlerden elde edilen embriyolar, beklendiği gibi normal görünecektir.Buna karşılık, örneğin beta katenin ve antisense oligoları enjekte edilmiş oositlerden elde edilen embriyolar, merkezileşmiş bir görünüme sahip olacaktır. Kültürde manipüle edilmiş oositlerden nasıl embriyo elde edileceğini göstermiş olduk.Bu prosedür uygulanırken, sağlıklı ve tam gelişmiş donör oositlerle başlamak ve yüksek kaliteli yumurtalara sahip konak dişiler kullanmak önemlidir. Ayrıca, yöntemin başarısı oositlerin izole edilme ve cerrahi işlemlerin gerçekleştirilme hızıyla ilişkili olma eğilimindedir. Bu nedenle, tutarlı sonuçlar elde etmeden önce belirli bir pratik yapmak gerekebilir.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

fertilization-of-xenopus-oocytes-using-the-host-transfer-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Xenopus, yumurta, parçalanmış, bozulmamış ve / veya fraksiyone çeşitli deneyler için yararlıdır laevis. Bu protokol, yumurtlama neden yumurtaları toplamak ve dejelly ve herhangi bir hasarlı yumurta kaldırmak için yumurta sıralamak nasıl gösterir.

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon...

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Bu video protokol transgenik üretmek için bir yöntem...

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Xenopus embriyonik ektoderm hücre polarite çalışmaları için cazip bir model haline gelmiştir. Bir tahlil floresan proteinlerin hücre içi dağıtım ektoderm hücreler değerlendirilir olduğu açıklanmıştır. Bu protokol adresi sorular sinyal mekansal kontrolü ile ilgili yardımcı olacaktır.

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Xenopus arasında yüz doku "Extreme Anterior Etki" nakli için bir tekniktir embriyolar geliştirilmiştir laevis'den. Doku kraniofasial gelişimi için ve yüz bölgeleri arasındaki etkileşimleri sinyalizasyon için yerel gereksinimleri çalışma izin, başka içine bir gen ekspresyon kökenli taşınmış olabilir.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Xenopus laevis immatür oositlerini manipüle etme, oositlerin yumurtalara in vitro olgunlaşması ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, bazı maternal proteinlerin bozulmasına ve döllenmede ilgilenilen genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir ve bu nedenle erken embriyonik gelişimde spesifik faktörlerin rollerini incelemek için değerlidir.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Yetkin ektodermde bir yanıtı indükleyebilen genlerin ekspresyon klonlaması için bir Xenopus oosit ve hayvan başlığı sistemini tanımlıyoruz ve bu tür genlerin sonraki analizi için teknikleri tartışıyoruz. Bu sistem, çok çeşitli gen ürünlerinin fonksiyonel olarak tanımlanmasında faydalıdır.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Tek foliküllerin izolasyonu, sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonları, çevre hücre tabakalarının çıkarılması ve Xenopus oositlerinde protein ekspresyonu için optimize edilmiş prosedürler anlatılmaktadır. Ek olarak, ligand kapılı iyon kanalları ile yapılan elektrofizyolojik deneylerde hızlı çözelti değişiklikleri için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

Öğrenin Xenopus oositlerinin ev sahibi transfer yöntemiyle döllenmesini. Bu teknik, kültürde manipüle edilmiş oositlerden gelişen embriyolar elde etmeyi sağlar ve gelişim biyolojisi araştırmalarına katkıda bulunur.

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Daha fazla video keşfet