Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, kültürde manipüle edilen OO bölgelerinden türetilen gelişmekte olan embriyolar elde etmektir. Bu, öncelikle bir dişiden donör oo bölgelerinin izole edilmesi ve bunların kültürde istenilen şekilde manipüle edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bu sitlerin progesteron kullanılarak olgunlaşmasının stimüle edilmesi ve yumurtlamayı teşvik etmek için potansiyel konak dişilere gonadotropin enjekte edilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, donör sitlerin canlı boyalarla boyanması ve konakçı olarak hizmet edecek bir dişinin hazırlanmasıdır. Prosedürün son adımı, donör sitlerin cerrahi olarak konakçının vücut boşluğuna aktarılması ve birkaç saat sonra aktarılan yumurtaların geri alınarak döllemesidir. Sonuç olarak, deneysel olarak manipüle edilen donörden elde edilen normal bölünme gösteren embriyolar oluşur.

Sitoslar, normal embriyolar gibi elde edilebilir ve analiz edilebilir. Merhaba, ben Iowa Üniversitesi'nden Doug Houston. Bugün, konak transfer prosedürünün nasıl gerçekleştirileceğini göstermek için Cold Spring Harbor Xap kursundayız.

Laboratuvarımızda maternal gen ürünlerinin rollerini incelemek ve erken zebra balığı gelişimindeki rollerini belirlemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Cerrahi işleme başlamadan önce, cerrahi alanın dezenfekte edildiğinden, taze medyumun ve steril aletlerin hazır olduğundan emin olun.

Sütür iğnesini, iğne tutucu ile istenen yönde kavrayın. Anestezilen dişi kurbağayı, nemli bir cerrahi mendil üzerine sırtüstü yerleştirin. Küçük iris makasları kullanarak, karnın alt kısmında, orta hattın yan tarafındaki deride bir santimetre uzunluğunda bir insizyon yapın.

Karın kasını kesmeyin. Kas tabakasını ve çevresindeki beyaz renkli fasyayı kaldırmak için pens kullanın. Kas boyunca doğrudan aşağıya doğru tek ve hızlı bir kesi yapmak için iris makası kullanın.

İnsizyonu, overi açığa çıkaracak şekilde bir santimetreye kadar genişletin. Overi kavramak ve bir lobu dışarı çekmek için pens kullanın. Lobu vücut duvarı seviyesinden kesmek için makas kullanın.

Dokuyu, oosit kültür ortamı veya OCM içeren 90 milimetrelik bir kaba yerleştirin ve yumurtalık kalitesini hemen bir disseksiyon mikroskobu altında değerlendirin. Birkaç oosit pensle defoliye edilebilir. Oositler sert, tek tip boyut ve renkteyse, kurbağadan istenilen miktarda yumurtalık dokusunu çıkarın ve OCM içeren 90 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Kesi yerini kapatın. İğneyi, hem kas hem de fasyadan geçtiğinden emin olarak, kesinin birkaç milimetre lateraline yerleştirin. Sütür kuyruğunu tamamen çekmemeye dikkat ederek, iğneyi yönlendirmek için pens kullanın.

Yarayı basit ayrı dikiş paterni ve cerrah düğümleriyle kapatın. Teknik, beraberindeki metinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Dikiş işlemini deri tabakasıyla tekrarlayın.

Dişiyi deiyonize su ile durulayın ve serin suyla dolu bir iyileşme kovasına yerleştirin. Cerrahi işlem biter bitmez, yumurtalığı alt bölümlere ayırmak için makas kullanın. Münferit lobları kesin, düzleştirin ve iki santimetrekarelik parçalar halinde kesin.

Temiz besiyeri ile durulayın ve pens kullanın. Münferit sitleri izole etmek için beş ila altı parçayı, OCM içeren yeni bir 90 mm'lik kaba aktarın. Parçalardan birini küçük bir besiyeri kabına aktararak başlayın ve diseksiyon mikroskobuna götürün.

Üç ila 500 oosit toplamak için saatçi pensi kullanın. Tam gelişmiş altıncı evre bir oositin stok yakınındaki çevresini saran bağ dokusu tabakasını ikinci bir pensle tutun. Oositin bitişiğindeki ovaryumu ilk pensle kavrayın.

Folikül tabakasını yırtmak için oosit üzerinden hafifçe çekme işlemi yapın. Oositi dokudan nazikçe ayırın. Defolike oositlerde görünür kan damarları yoktur ve intakt foliküllü oositlere göre daha gevşektirler.

100 ila 150 oositlik grupları, sekiz mililitre OCM içeren 60 milimetrelik kültür kaplarına aktarmak için pamukla tıkalı, ateşle cilalanmış bir pipet kullanın. Oositleri kaplarında 18 °C'de saklayın. Oositler artık istenildiği gibi herhangi bir protokol uyarınca antisense oligonükleotidler veya mRNA'lar ile mikroenjekte edilebilir ve ardından 18 °C'lik bir inkübatörde, OCM içinde kültüre edilebilir.

Transfer için oositleri izolasyondan sonraki 96 saat içinde, transferi gerçekleştireceğiniz günden önceki akşam kullanın. Gerekli oositleri olgunlaştırmak için progesteron ile inkübe edin; oositlerin bulunduğu ortama, final konsantrasyonu 2 µM olacak şekilde 16 µL 1 mM progesteron ekleyin. Aynı akşam 18 °C'de 10 ila 12 saat boyunca inkübe edin, yumurtlama sağlamak için üç ila beş dişiye kurbağa başına 1000 ünite insan koryonik gonadotropini enjekte edin.

Transfer sabahında dişileri oda sıcaklığında veya 18 °C'de gece boyunca bekletin. Kültürlenen sitlerin olgunlaştığından emin olmak için disseksiyon mikroskobunda kontrol edin. Vital boyaları hazırlayın ve 10.000 ×g'den daha yüksek hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Kalıntılardan kaynaklanan arka plan gürültüsünü azaltmak için, oositlerin her bir deneysel grubuna 80 µL uygun canlılık boyası ekleyin. Oda sıcaklığında, bir sarsıntılı platform (rocker) üzerinde 15 dakika inkübe edin. Boyanmış yumurtaları, taze o cm içeren 90 mm'lik bir kaba aktarın ve yıkamak için kısa bir süre dairesel hareketlerle karıştırın.

Sitleri transfer etmek için bir pipet hazırlayın. Konik kısmın yaklaşık iki santimetre altına elmas uçlu kalemle bir çizik atın ve düzgünce kırın. Bu işlem, bir oositin sığabileceği kadar geniş, 1,5 mm açıklığa sahip bir pipet oluşturmalıdır.

Ucun ağzını kapatmadan, kenarlar pürüzsüz hale gelene kadar ucu cilalayın. Oosit transplantasyonu. Cerrahi işlem mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir.

Anestezize edilmiş, kaliteli yumurtalar veren bir dişiye daha önce yapıldığı gibi bir insizyon yapın. Bu insizyon, transfer borusunun sığabileceği minimum uzunlukta olmalıdır. Bir santimetreden daha az pipetleyin.

Deneysel oositlerin bulunduğu kabı, oositleri kabın merkezinde toplamak için dairesel hareketlerle sallayın. Hazırlanan pastur pipeti kullanarak mümkün olduğunca çok oositi çekin. Kurbağaya aktarılan sıvı miktarını en aza indirmek için oositlerin pipetin ucuna çökmesini bekleyin.

Kas ve fasyanın bir flebini kavramak ve kaldırmak için pens kullanın. Pipetin ucunu insizyona yerleştirin ve oositlerin vücut boşluğuna yavaşça süzülmesini sağlayın. Tüm oositler transfer edilene kadar işlemi tekrarlayın.

Oositlerin insizyondan dışarı taşmasını önlemek için kas tabakasını serbest bırakmayın. İnsizyonun her iki yanını kavramak ve sitlerin vücut boşluğuna yerleşmesini sağlamak için pens kullanın. İlk düğüm bağlanana kadar yukarı doğru gerginliği korumaya dikkat ederek, kas ve fasya tabakasını daha önce olduğu gibi dikmeye başlayın.

Cildi dikin. Kurbağayı deiyonize su ile durulayın ve daha önce olduğu gibi iyileşmesine izin verin. Kurbağa, ameliyattan iki ila üç saat sonra, operasyon sonrası normal şekilde yumurtlamaya başlamalıdır.

Dişi yumurtlamayı bırakana kadar, her yarım saatte bir normal sıkma yöntemiyle yumurtaları bir toplama kabına alın. Toplanmış yumurtalara, 1X MMR içerisinde taze toplanmış sperm süspansiyonundan dört mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin. Yumurtaları oda sıcaklığındaki sıvı ile bolca yıkayın ve durulayın.

Aktivasyon ve parçalanmaya izin vermek için XMMR oda sıcaklığında inkübe edilir. Jöle katmanlarını temizlemek için herhangi bir aşamada sistein kullanın. Aktarılan embriyolar daha sonra renklerine göre ayrı kaplara ayrılabilir ve normal embriyolar gibi kültüre edilebilir.

Genellikle, transfer edilen yumurtaların üçte ikisinden fazlası, döllenmeden sonraki dakikalar içinde aktive olarak animal kutupta güçlü bir kortikal kontraksiyon sergiler. Çoğu deneyde, transfer edilen yumurtaların yarısından fazlası normal birinci bölünmeyi gerçekleştirir. Bazı durumlarda bölünme, elimizdeki konak yumurtalara kıyasla 20 dakika kadar gecikebilir.

Transfer edilen embriyoların %30 ila %60'ı normal bir şekilde gastrülasyona girer ve nöral aşamanın ötesinde hayatta kalır. Transfer edilen embriyolar, gelişimin birçok günü boyunca canlı boya renklerini koruyacaktır. Enjekte edilmemiş kontrol oositlerden elde edilen embriyolar, beklendiği gibi normal görünecektir.

Buna karşılık, örneğin beta katenin ve antisense oligolar enjekte edilen oositlerden elde edilen embriyolar, merkezileşmiş bir görünüme sahip olacaktır. Kültürde manipüle edilmiş oositlerden nasıl embriyo elde edileceğini az önce göstermiş olduk.

Bu prosedür uygulanırken, sağlıklı, tam gelişmiş donör oositlerle başlamak ve yüksek kaliteli yumurtalara sahip konakı dişiler kullanmak önemlidir. Ayrıca, yöntemin başarısı, oositleri izole etme ve cerrahi işlemleri gerçekleştirme hızınızla ilişkili olma eğilimindedir. Bu nedenle, tutarlı sonuçlar elde etmeden önce biraz pratik yapmak gerekebilir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.