DNA Onarım Protein Eylem Mekanizması Soruşturma Durduruldu akış Kinetiği Yöntemleri Uygulama

Bu çalışma, bir DNA uyumsuzluk onarım proteini olan MutS2-MutS6'nın reaksiyon kinetiğini ölçmek için kullanılan iki durdurulmuş akış (stopped flow) yönteminin sunumudur. MutS2-MutS6, DNA'daki baz çifti uyumsuzluklarını tanır ve ATP ile desteklenen bir reaksiyon aracılığıyla onarımı başlatır. İlk yöntem, DNA'daki bir GT uyumsuz çiftinin yanına yerleştirilmiş bir 2-aminopürin bazının floresan artışı aracılığıyla MutS2-MutS6'nın DNA'ya bağlanmasını ölçer. Reaktifler bir durdurulmuş akış cihazında karıştırılır ve hız sabitini belirlemek için zamanla izlenir.

İkinci yöntem, floresan bir fosfat bağlayıcı protein raporlayıcısı kullanarak Mush2-Mush6 ATPaz aktivitesini ölçer. Reaktanlar bir durdurulmuş akış (stopped flow) düzeneğinde karıştırılır ve zaman içinde izlenir. ATP hidrolizi ve fosfat salınımı için hız sabitlerini belirlemek amacıyla, elde edilen kinetik veriler Mush2-Mush6'nın DNA uyumsuzluk onarımındaki etki mekanizmasını aydınlatır.

Merhaba, ben Wesleyan Üniversitesi moleküler biyoloji ve biyokimya bölümündeki MONI Laboratuvarı'ndan Noah Biro. Merhaba, ben de Wesleyan Üniversitesi'ndeki Man Laboratuvarı'ndan DJ J. Ve ben de JI'S Laboratuvarı'ndan Chris Dset.

Bugün size, milisaniye zaman ölçeğinde bir reaksiyonun kinetiğini izlemek için kullanılan floresan tabanlı iki deneyi göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu yöntemleri, DNA mismatch repair (yanlış eşleşme onarım) proteini MutS'nin DNA'daki yanlış eşleşmiş baz çiftlerine nasıl bağlandığını ve onarımı nasıl başlattığını incelemek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.

Bu prosedüre başlanmadan önce, gerekli protein ve DNA reaktifleri hazır bulundurulmalıdır. Daha önce E. coli'de aşırı eksprese edilmiş, iyon değişimi ve afinite kromatografisi ile saflaştırılmış s visier mush two mush six proteini temin edin. DNA reaktiflerini oluşturmak için, floresan nükleotid analoğu 2-aminopürin ile modifiye edilmiş tek zincirli DNA satın alın; zincirleri denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile saflaştırın ve GT uyumsuzluğuna komşu bir 2-aminopürin içeren uyumsuz dupleks DNA oluşturmak için bunları birleştirin.

Benzer şekilde, modifiye edilmemiş tek zincirli DNA'dan işaretlenmemiş DNA hazırlayın. Burada kullanılan DNA dizileri, bu protokolün yazılı bölümünde bulunabilir. Bu prosedür boyunca, floresan safsızlıkları en aza indirmek için yüksek kaliteli kimyasallar kullanarak yüksek deneysel bütünlük sağlayın.

Ayrıca, durdurulmuş akış (stopped flow) cihazını tıkayabilecek partikülleri uzaklaştırmak için tüm stok çözeltileri 0,2 mikrometrelik bir membrandan süzün. DNA bağlanma deneylerini kurmak için, her numune başına yaklaşık 10 kinetik iz için yeterli olan 400 microliters final hacminde numuneler hazırlayın. Numuneleri buz üzerinde muhafaza edin.

Protein aktivitesini korumak için, DNA örneğini 0,12 µM ve Mush2-Mush6 örneğini DNA bağlanma tamponunda 0,8 µM konsantrasyonda hazırlayın. Bu işlem, stop-flow cihazında bire bir karıştırma sonrası 0,06 µM DNA ve 0,4 µM Mush2-Mush6 nihai konsantrasyonları ile sonuçlanacaktır.

Bir durdurulmuş akış cihazı, reaktant çözeltilerini sürücü şırıngalardan bir karıştırma düzeneğine eş zamanlı ve hızlı bir şekilde itmek için bir tahrik motoru kullanır. Karıştırılan çözelti, ardından veri toplama işlemi için bir gözlem hücresine akar; cihazı hazırlamak için öncelikle bilgisayarın ve kontrol ünitesinin kapalı olduğundan emin olun.

Ardından, lambayı soğutmak için sirkülasyonlu su banyosunu çalıştırın ve lambayı yakın. Monokromatörü, 315 nanometre olan istenen eksitasyon dalga boyuna ayarlayın. İki amino purin için, SL genişliğini istenen değere ayarlayın.

İki amino purin floresan sinyalini toplamak için fotomultipliyer tüpe veya PMT'ye 350 nanometre kesim filtresi yerleştirin. Kontrol cihazını ve bilgisayarı açın. Ardından sirkülasyonlu su banyosunu çalıştırın.

Bu işlem, deney boyunca istenen sıcaklığın korunması için sürücü şırıngalarının etrafındaki su ceketini doldurur. Son olarak, P-M-T-H-V kontrol menüsü altındaki durdurmalı akış (stop flow) programını çalıştırın. Başlangıçta PMT hassasiyetini ayarlamak için değiştirilebilen ancak daha sonra sabit tutulması gereken PMT voltajını ayarlayın.

Deney sırasında, arka plan elektriksel gürültüsünü düzeltmek için karanlık akımı ölçün. Ardından, durdurulmuş akış itici şırıngaları ve gözlem hücresini yıkayın. Örnek yükleme valfini yükleme konumuna getirin.

Bir mililitrelik bir şırıngayı deiyonize filtrelenmiş su ile doldurun. Şırıngayı, sürücü şırınganın altında bulunan yükleme portuna takın ve iki şırınga arasına su itin. İşlemi her biri için iki kez tekrarlayın.

Deneyde kullanılacak olan sürüş şırıngası. Ardından, gözlem hücresini yıkamak için sürüş şırıngalarını su ile doldurun. Numune yükleme valfini ateşleme konumuna getirin.

Sürücü plakayı indirmek, gözlem hücresinden su geçirmek ve suyu çıkış hattına itmek için şırınga sürücüsünü ayarla komutunu kullanın. Pistonu sürücü şırınganın en sonuna kadar itmemeye dikkat edin. Son olarak, sürücü plakayı kaldırın ve valfi yükleme konumuna getirin.

Bir kez reaksiyon tamponu ile yıkayın ve şırıngaları boşaltın. DNA bağlanma deneylerine başlamak için, her örneği tüpten yeni bir bir mililitrelik şırıngaya aktarın. Her şırıngayı bir yükleme portuna takın ve çözeltiyi sürücü şırıngaya itin.

Çözeltiyi iki şırınga arasında aralıklı duraklamalarla manuel olarak iterek tüm hava kabarcıklarını giderin. Ardından, sürücü plakayı sürücü şırıngaların üst kısmına temas edene kadar indirin. Veri toplama işlemi için, ayarlanmış zaman kanalları penceresini açın.

Veri analizinin veri toplama kanal modunu ve toplanacak iz sayısı seçin. 1000 veri noktasının toplanacağı veri toplama süresini girin. Ardından, valfi ateşleme konumuna getirin ve veri topla butonuna tıklayın.

Bu işlem; mush two, mush six ve DNA'nın karıştırılmasını başlatır, ardından reaksiyonun gözleme girişini sağlar. İki amino purinden kaynaklanan hücre floresan emisyonu izlenir. Yüksek kaliteli bir veri seti elde etmek için en az beş kinetik iz toplayın ve deney tamamlandığında dosyayı kaydedin.

Her bir veri dosyasını açın ve birden fazla kinetik izleğin ortalamasını alın. Ardından, ortalama veri dosyasını kaydedin ve analiz için bir grafik programına aktarın. Son olarak lambayı kapatın, şırıngaları ve gözlem hücresini suyla iyice yıkayın.

Ardından, sirkülasyonlu su banyosu dışındaki diğer tüm ekipmanları kapatın. Lambanın soğuması için bu cihaz 15 dakika daha açık bırakılır. MUSH2-MUSH6'nın hatalı eşleşmiş DNA'ya bağlanmasına ilişkin kinetik veriler, saniyede molar başına 10⁷ mertebesinde hızlı bir birleşme hızı veren tek bir eksponansiyel fonksiyonla en iyi şekilde uyuşmaktadır; benzer durdurulmuş akış (stopped-flow) deneyleri, saniyede 0,01 ila 0,02 oranında çok yavaş gerçekleşen MUSH2-MUSH6 hatalı eşleşmiş DNA kompleksinin ayrışma hızını verir.

Bu sonuçlar, MutS2-MutS6 kompleksinin DNA onarım reaksiyonu sırasında uyumsuz bir baz çiftine bağlanma hızının ve afinitesinin doğrudan bir ölçümünü sağlar. Bir sonraki aşamada, MutS2-MutS6'nın ATPase aktivitesini ölçmek için bir durdurulmuş akış (stopped-flow) deneyi gerçekleştirilecektir.

Bu analiz için ön çalışma durumu koşulları altında, arka plan fosfat seviyelerini minimize etmek amacıyla, protein ve DNA saflaştırması da dahil olmak üzere reaktif hazırlama aşamalarının tamamında cam kullanımından kesinlikle kaçınılmalıdır; E. coli'den saflaştırılmış ve MDCC floroforu ile işaretlenmiş fosfat bağlayıcı protein veya PBP, bir ATP hidrolizini takiben fosfat salınımını ölçmek için bir raporlayıcı olarak kullanılır. M-D-C-C-P-B-P, ön çalışma durumu ATP hidrolizi ve fosfat salınım kinetiği için güçlü bir raporlayıcıdır. Fosfata hızla ve yüksek afinite ile bağlanarak MDCC floresanında büyük bir artış sağlar.

Dört mikromolar mush, iki mush altı protein ve varsa altı mikromolar uyumsuz DNA içeren bir örnek hazırlayın. Kirletici fosfatı temizlemek için bir milimolar yeni çözülmüş HEP ve 20 mikromolar M-D-C-C-P-V-P içeren başka bir örnek hazırlayın. Örneklere purin nükleozid fosforilaz ve yedi metil guanin ekleyerek en az 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Durdurulmuş akış (stopped flow) cihazını daha önce açıklandığı şekilde hazırlayın. Ek olarak, sürüş şırıngalarındaki fosfat kontaminasyonlarını purin, nükleozit, fosforil ve yedi metil guanin ile temizleyin. 20 dakika boyunca inkübe edin. Eksitasyon dalga boyunu 425 nanometreye ayarlayın ve M-D-C-C-P-B-P floresansının tespiti için PMT ile birlikte 450 nanometrelik bir kesme filtresi (cutoff filter) kullanın.

Sürücü şırıngalarını daha önce açıklandığı şekilde numunelerle doldurun. Veri toplama parametrelerini ayarlayın ve mush two mush six'yı bir TP ve M-D-C-C-P-B-P ile karıştırmak için veri topla seçeneğine tıklayın; mush two mush six tarafından fosfat salınımını ve M-D-C-C-P-P-P floresansındaki eş zamanlı artışı izleyin. Zaman içinde, yüksek kaliteli bir veri seti elde etmek için en az beş kinetik iz toplayın ve dosyayı kaydedin; daha önce açıklandığı şekilde birden fazla kinetik izi ortalayın ve analiz için veri dosyasını dışa aktarın. Fosfat konsantrasyonu ile M-D-C-C-P-P-P floresansı arasındaki doğrusal ilişkiyi belirlemek için bir kalibrasyon eğrisi hazırlayın; öncelikle, durdurmalı akış (stopped flow) cihazında M-D-C-C-P-P-P'yi aynı deneysel koşullar altında farklı fosfat konsantrasyonları ile karıştırın.

Ardından, kalibrasyon eğrisi için maksimum M-D-C-C-P-P-P floresansını her bir fosfat konsantrasyonuna karşı grafiğe dökün ve mush two mush six reaksiyonlarındaki fosfat konsantrasyonunu belirlemek için eğimi kullanın; fosfat konsantrasyonunu zamana karşı grafiğe dökün ve verileri eksponansiyel ve lineer bir fonksiyona uydurun. Bu fonksiyon, ön durum (pre-steady state) ATP hidrolizi ve fosfat salınımıyla karakterize olan bir patlamayı ve ardından reaksiyonun lineer kararlı durum (steady state) fazını tanımlar. Kinetik veriler, mush two mush six'nın ATP'yi hidroliz ettiğini ve ilk katalitik döngüde saniyede 1,4 oranında hızla fosfat saldığını göstermektedir.

Bunu, sonraki devirleri saniyede 0,2'lik yedi kat daha yavaş bir kararlı durum katalitik sabitiyle sınırlayan reaksiyondaki yavaş bir adım izler. Ancak, mush to mush six yanlış eşleşmiş DNA'ya bağlandığında, bir ATP hidrolizi ve fosfat salınımı patlaması baskılanır. Bu sonuçlar, yanlış eşleşmiş bir baz çiftine ve DNA'ya bağlandığında mush too mush six'nın ATP bağlı bir duruma geçtiğini doğrudan göstermektedir.

Bu geçiş, DNA onarım reaksiyonunda kritik bir adımdır. Size, bir reaksiyonun kinetiğini gerçek zamanlı olarak ölçmek için stop flow cihazının nasıl kullanılacağını göstermiş olduk. Bu tür ölçümler; MASH iki, MASH altı etki mekanizması ve DNA yanlış eşleşme onarımı konusundaki anlayışımızı geliştirmiştir.

Bu tür deneyler yapılırken, çok saf DNA ve protein dahil olmak üzere yüksek kalitede ajanların kullanılması gerektiğini hatırlamak ve ATP analizlerinde fosfat kontaminasyonuna karşı özel dikkat göstermek önemlidir. İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.