İki Boyutlu Gabor Filtreler dayanarak Optik Scatter Mikroskopi
2 Haziran 2010
Biz Gabor gibi tek bir canlı hücre içinde hücre içi dinamiklerini ölçmek için filtreleme dayalı bir karanlık alan mikroskobu yöntemi göstermektedir. Teknik mitokondriyal parçalanma gibi organellerin yapısında değişiklikler, duyarlı.
Bu videoda, apoptoz sırasında mitokondriyal parçalanmayı ölçmek için optik saçılma mikroskobu kullanılmıştır. Optik saçılma mikroskobu normalde bu protokolde floresan gerektirmese de, doğrulama amacıyla floresan görüntüler elde edilecektir. Görüntüleme sisteminin kurulumunu takiben, hücreler MIT izleyici yeşili ile etiketlenir ve apoptozu indüklemek için stor sporin ile muamele edilir.
Hücresel organellerin oryantasyonundaki değişiklikleri iki saat içinde tespit etmek için optik veriler elde edilir. Mitokondriyal parçalanmanın başlangıcı, hücre altı parçacıkların oryantasyon derecesinde bir azalma gösteren optik dağınık veriler kullanılarak ölçülebilir. Veriler daha sonra optik dağınık verilerin mitokondri içeren floresan bölgelerle ilişkilendirilmesiyle doğrulanır.
Merhaba, ben Rutgers Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'ndeki Biyo Optik Laboratuvarı'ndan Nada Bustani. Ben Bio Optics Lab'dan Rob Pak ve yine Bio Lab'den Deen'im. Bugün size floresan boyalara dayanmayan bir yöntem kullanarak hücre altı morfolojik dinamikleri ölçmek için bir prosedür göstereceğiz.
Laboratuvarımızda bu tekniği, apoptoz veya program hücre ölümü sırasında hücre altı yapıdaki dinamik değişiklikleri incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Eldivenli ellerinizi %70 etanol ile sterilize ederek bu işleme başlayın.
Ardından, hazırlanmış bir 100 nano molar stok solüsyonu miot tracker yeşili ve ön ısıtma, BAEC hücre kültürü ortamı, ışık kapalıyken davlumbaza yerleştirin ve tüm yüzeyleri sterilize edin. Daha sonra, kaputun altındaki kapak camına kaplanmış hücrelere sahip altı kuyulu bir kültür kabı yerleştirin. Bir vakum hattına bağlı bir macun pipeti kullanarak.
Hücre ortamını kuyucuklardan çıkarın. Ardından, hücreleri etiketlemek için hemen her bir oyuğa etiketli ortamdan iki mililitre ekleyin. Mitokondri. Doğrudan oda ışığına maruz kalmayı önlemek için doku kültürü plakasını örtün ve hücreleri hızlı bir şekilde inkübatöre geri yerleştirin.
Hücreler kuluçkaya yatarken 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Optik kurulumu hazırlayın, önce cıva ark kelepçesini açın. Ardından bilgisayarı, mikroskobu, kameraları ve lazer fişini, dijital mikro ayna cihazını veya dönen difüzördeki DMD'yi açın.
Ardından, optik fırlatmanın hizalanıp hizalanmadığını görmek için mikroskop merceğinden bakın. Görüş alanı lazer ışığı ile parlak bir şekilde aydınlatılmalıdır. Numuneyi yüklemek için, tamamen aşağıdayken 63 x yağa daldırma hedefinin üzerine bir ila iki küçük damla daldırma yağı yerleştirin.
Daha sonra sahneye, gradi adı verilen düzenli 10 mikrometre aralıklarla bir çizgi ızgarasından oluşan bir slayt monte edin ve objektifi, yağın odağını tutması için kaldırın. Ardından, kondansatör alanının altıgen kenarına odaklanın. Merkezi Kohler aydınlatmasında hizalanacak şekilde durun.
Altıgen kenar, göz merceğinde ortalanmalı ve keskin bir şekilde odaklanmalıdır. Ardından, kondenser alanı durdurma konumu düğmelerinin ortasını kullanarak, kondenser alanı, görüş alanı üzerinde durun. IP lab'ı başlatın ve kamerayı çalıştırmak için ayarları girin.
Fotoğraf makinesinin kare aktarım moduna ayarlandığından emin olun. Canlı önizlemeyi başlatmak için odak al komutunu çalıştırın. Ardından dizin önekini ve görüntülerin kaydedileceği dosya konumunu ayarlayın.
Ardından, RS görüntüsünü başlatın. Havalı fotoğraf makinesini çalıştırmak için ayarları belirleyin. Saat modu normale ayarlanmalıdır.
DMD yazılımını başlatın. Karanlık alan irisini komut dosyası menüsüne yerleştirin. Ardından yükle ve sıfırla'ya tıklayın.
Komut dosyasını manuel olarak çalıştırmak için, görüntü alanındaki mikroskop optiv çubuğunu LSM olarak ayarlayın. Bu, görüntüyü hizalanmış optiklerdeki DMD aracılığıyla gönderecektir. Karanlık alan görüntüsünü Cascade beş 12 kameranın CCD'sine yansıtma.
Karanlık alan görüntüsü, IP laboratuvarındaki canlı önizlemede görünmelidir. Gerekirse, görüntüyü canlı önizlemeye odaklayın. Görüntüde en az 10.000 sinyal sayısı olmasını sağlamak için pozlama süresini yeterince yükseğe ayarlayın.
Ardından, alımdan sonra tek al komutunu kullanarak görüş alanının anlık görüntüsünü alın. Görüntüyü diske kaydetmek için dizinlenmiş olarak kaydet komutunu kullanın. GTI'nin görüntüsü, görüş alanının boyutunu ölçer.
Şimdi GTI örneğini görüş alanının dışında olacak ve yalnızca arka plan görünecek şekilde taşıyın. En az 5.000 sayım elde etmek için yeterli pozlama süresiyle alanın bir arka plan görüntüsünü yakalayın. Bu görüntü, filtrelenmemiş görüntülerin arka planda çıkarılmasına yardımcı olacaktır.
Şimdi, arka planın Gabor filtrelenmiş görüntülerini elde etmek için, Gabor Filtre Bankası komut dosyasını DMD kontrol yazılımına yükleyin. Filtreleri DMD'nin yerleşik belleğine tamponlamak için komut dosyasının tamamını çalıştırın. Bu, tüm komut dosyası arabelleğe alındıktan sonra birkaç dakika sürebilir.
Bir seferde yalnızca bir Gabor Like filtresine karşılık gelen bir filtre setinin yüklendiğinden emin olmak için DMD yazılımı içindeki başlat ve durdur işaretlerini kullanın. Arka planın filtrelenmiş görüntülerini almak için komut dosyasını çalıştırın. Canlı görüntü önizlemesi, karanlık alandan filtrelenmiş görüntüye değişmelidir.
Bu filtre için, diskten IP lab'de edinme betiğini açın. En az 2000 sayım elde edildiğinden emin olmak için pozlama süresini ayarlayın. DMD betiği çalışırken, IP lab'deki canlı önizlemeyi iptal edin ve alım betiğini çalıştırın.
Bu, dizini otomatik olarak alacak ve filtrelenmiş görüntüyü diske kaydedecektir. İlk görüntü elde edildikten sonra, komut dosyasının DMD'de çalışmasını durdurun. Kullanılan komutları komut dosyasından silin.
Ardından, bir sonraki filtre setinin başındaki ve sonundaki başlatma ve durdurma işaretlerini değiştirin. Tüm filtre bankası kullanılana ve filtrelenen tüm görüntüler alınıp kaydedilene kadar IP laboratuvarında edinme işlemini tekrarlayın. Laboratuvar tezgahına bir havya takarak ve L 15 ortamını 37 santigrat dereceye ısıtarak hücreleri kaplamaya hazırlanın.
Dökülen ortamları emmek ve alanı temiz tutmak için bir kağıt havlu ve Kim mendili ile bir iş istasyonu yapın. Kimm mendillerini yırtarak ve döndürerek birkaç fitil hazırlayın. Fitiller, sıvıyı hücre plakasından çekmek için kullanılacaktır.
Ardından, bir hücreli sandviç oluşturmak için metal numune tutucuyu kullanın. İşlenmiş metal plakadaki deliğin üst çevresine, her iki taraftaki olukların uçlarının yaklaşık yarısına kadar uzanan ince bir boncuk vakumlu gres uygulamak için bir şırınga kullanın. Temiz bir numaralı bir kapak kızağını gresin üzerine nazikçe geçirin.
Plakayı ters çevirin ve gresi deliğin etrafına sürün. Etanol ile sterilize edilmiş NI deneme sınavı eldivenleri giyerek oda ışıklarını kapatın. Hücreleri inkübatörden alın.
Deney için kullanılacak olan kapak fişini altı Kuyulu plakadan çıkarın. Kapak kızağını dikkatlice kurulayın. Ardından, kapak kayma hücresi tarafı aşağı bakacak şekilde, görüntüleme deliğinin üzerindeki yağlanmış metal plakaya bastırın.
Hücreleri plakanın içine sıkıştırmak. Hava boşluğu kalmadığından ve ortamın yüklenebilmesi için gresin su geçirmez bir conta oluşturduğundan emin olun. Şimdi plakayı bir seferde 200 mikrolitre pipetlemek için geri çevirin.
Sıvı neredeyse diğer taraftaki oluğa ulaşana kadar, üst kapak sürgüsü ile metal plaka arasındaki oluktan sandviçin içine ön ısıtma L 15 medium'u ekleyin. Daha sonra, karşı olukta bir fitil tutarak ve sandviçin içine 200 mikrolitre daha fazla orta pipetleyerek hücreleri yıkayın. Fitil eski ortamı uzaklaştırdığı için ortam bir taraftan diğer tarafa akacaktır.
Bu adım sırasında sıvının içinde herhangi bir kabarcık oluşmasını önlemeye dikkat edin. Her durulama için yeni bir fitil kullanarak bu işlemi iki ila üç kez tekrarlayın. Şimdi, sıvıyı hücre haznesine hapsetmek için plakayı kenarlardan destekleyerek plakayı bir kez daha ters çevirin.
Havyanın bir kısmını hızlı bir şekilde eritmek için havyayı damar kabına batırın, bu daha sonra havya ucuna yapışacaktır. Havya ucunu kullanarak, alt kapak kaymasının kenarlarına dikkatlice kalıplama damarını uygulayın. Kapak kayma çevresine tamamen daldırmaya ve uygulamaya devam edin, metal plakaya sızdırmaz hale getirin.
Bu, iyi bir mekanik sızdırmazlık oluşturur, böylece kapak kızağı görüntülendiği gibi plakadan ayrılmaz. Alttaki kalıntıları temizleyin. Bir kim mendil püskürterek ve kapağı temizleyerek kayma yüzeyini örtün.
Kapak kaymasının görüntüleneceği merkezde en temiz olmasını sağlamak için tek bir kayma hareketiyle kaydırın. Altı duvar plakasını inkübatöre geri koyun. Kaplanmış hücreleri optik laboratuvarına götürün ve objektife monte edin.
Daha önce olduğu gibi, sağlıklı görünen hücrelerden oluşan bir alan bulun ve görüş alanının karanlık bir alan görüntüsünü elde edin. Ardından mikroskobu DIC'de hizalayın ve maruz kalma sürelerinin yeterli olduğundan emin olun. Kaskad kamera ile bir DIC görüntüsü elde edin.
Bu kurulumda, mikroskop hala DIC'de hizalıyken soğuk SNAP kamera kullanılarak floresan görüntüler elde edilir. Mikroskop VAR'ı bir x konumuna ve görüntü alanını %100 dürbüne ayarlayın ve görüntüyü göz merceğinden kameraya yönlendirin. Alanı aydınlatmak için kondansatörün üzerine mavi bir LED yerleştirin.
Ardından, RSS görüntüsünde görüş alanını önizleyin ve ince odağı ayarlayın. Gerekirse, bir DIC görüntüsü alın ve diske kaydedin. Görüş alanının kademeli kameradan elde edilenden ne kadar farklı olduğuna dikkat edin.
Bu görüntülerin, deneyin analiz aşaması sırasında kaydedilmesi gerekecektir. Ardından, floresan filtre küpünü yerine getirin ve mikroskop deklanşörünü kullanarak floresan uyarımını kısaca açarak bir floresan görüntüsü elde edin ve ardından çekim tamamlanır tamamlanmaz kapatın. Foto ağartmayı en aza indirmek için, floresan görüntüyü diske kaydedin.
Filtrelenmiş görüntüler elde etmek için mikroskobu alana sıfırlayın ve ışığı LSM bağlantı noktasından gönderin. Daha önce olduğu gibi, hücreler hala sahnedeyken ve görüş alanını bozmadan bir zaman noktası için veri alımını tamamlamak için tüm Gabor filtre bankası komut dosyasını daha önce olduğu gibi çalıştırın. Normal L 15 ortamını, bir mikromolar STS çözeltisi içeren aynısıyla değiştirmek için fitilleme yöntemini kullanın.
Deney sırasında, ortamı sahneden çıkarmadan veya görüş alanını bozmadan hücre plakasının oluğuna pipetleyerek kurumasını önlemek için ek ortam ekleyin. Şimdi, deneme tamamlanana kadar sonraki zaman noktaları için bu adımları tekrarlayın. Toplanan veriler, hücre altı yapısal verileri çıkarmak için işlenmesi gereken çok sayıda filtrelenmiş görüntü içerecektir.
Burada iki örnek deney gösterilmiştir. Bu şekil, bir deniz diatom alg örneğinin sıralı görüntülerini göstermektedir. Yönlendirilmiş özellikler açıkça görülebilir.
Karanlık alan görüntülemede. Beş eşittir sıfır derece ile beş eşit 160 derece olarak etiketlenmiş optik olarak filtrelenmiş görüntüler, numunenin filtrelenmemiş görüntüsünün yanında gösterilir. Karşılaştırma için, diatomun dokuz Gabor filtreli görüntüsünden oluşan set, nesne oryantasyonu için piksel piksel işlendi.
Her pikselde, maksimum sinyal, bir en-boy oranı değeri vermek için filtre oryantasyonunun bir fonksiyonu olarak ortalama sinyale bölündü. Burada, tercih edilen tepki açısının olmadığı alanlarda mavi ile gösterilen en boy oranına yakın bir en-boy oranı mevcuttur. Kırmızı ile gösterilen daha büyük değerler, daha yüksek bir tercih edilen açı yanıtının mevcut olduğu alanları gösterir.
Toplam GABOR filtre yanıtının parlaklığı ve kod önemi, filtre yönü, her pikselde maksimum sinyali veren, alttaki nesne oryantasyonuna dik olan yöne karşılık gelir. Alt yapı parçacık oryantasyonu, her satırın filtrelenmemiş karanlık alanda görülebilen temel yerel nesne oryantasyonu ile yakından uyuştuğu bir titreme grafiğinde kodlanmıştır. Titreme grafiği, tepki yoğunluğu maksimumun %10'undan daha büyük olan nesnelerin yönünü gösterir.
Canlı sığır endotel hücreleri içeren bir alanın bu karanlık alan ve optik olarak filtrelenmiş görüntüleri, filtrelenmiş görüntüler daha sonra apoptoz indükleyici stor sporin ile tedaviden sonra üç saatlik bir süre boyunca her 20 dakikada bir elde edildi. Burada, üst paneldeki en boy oranı haritası ve alt paneldeki mitokondrinin floresan görüntülemesi zamanın bir fonksiyonu olarak gösterilmektedir. Renk tonu, oryantasyon derecesini temsil eder, çünkü bu zaman grafikleri, s thoro sporin ile tedavi edilen endotel hücrelerinde parçacıkların en boy oranının oryantasyon derecesindeki azalmayı karşılaştırır, bireysel izler, tek hücreler içindeki zaman grafiklerini temsil eder.
Düşme yönelimi, floresan bölgelerle kaydedilen hücrelerin bölgeleriyle sınırlıdır. Şimdi, floresansa karşı doğrulama elde edildi. Arşiv haline gelir.
Böylece sonraki deneylerde mitokondriyal ölçümler, floresan görüntüleme adımları atlanarak ve doğrudan optik saçılma yöntemi kullanılarak yapılabilir. Gabor filtrelerine dayalı ışık saçılma imzalarını kullanarak apoptoz sırasında mitokondriyal parçalanmayı nasıl izleyeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, iyi bir yaşam tarzı hazırlığına sahip olmak ve optik kurulumun iyi hizalandığından ve kalibre edildiğinden emin olmak önemlidir.
Öyleyse, UI deneyleri ile izlemeyi ve CoLab'ı mantıklı bir şekilde ele alalım.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, yaşayan hücrelerde subsellüler dinamikleri değerlendirmek için Gabor benzeri filtreleme kullanan bir karanlık alan mikroskobu yöntemini gösterir. Teknik, özellikle apoptoz sırasında mitokondriyal parçalanma gibi organel yapılarındaki değişikliklere duyarlıdır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Mikroskopi Teknikleri
Arka Plan
- Mitokondriyal parçalanma, apoptozun önemli bir göstergesidir.
- Geleneksel mikroskopi yöntemleri genellikle floresans gerektirir, bu da uygulamalarını sınırlandırır.
- Optik saçılma mikroskobu, non-invaziv bir alternatif sunar.
- Organel dinamiklerini anlamak, hücre sağlığı hakkındaki bilgiler için çok önemlidir.
Çalışmanın Amacı
- Optik saçılma mikroskobu kullanarak mitokondriyal parçalanmayı ölçmek.
- Optik verileri floresan görüntüleme teknikleri ile doğrulamak.
- Apoptoz sırasında subsellüler dinamikleri daha iyi anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- MIT izleyici yeşili ile etiketlenmiş hücreler.
- Apoptozu indüklemek için stor sporin ile tedavi.
- Organel yönelimini izlemek için optik verilerin elde edilmesi.
- Doğrulama için optik verilerin floresan görüntülerle ilişkilendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Optik saçılma mikroskobu, mitokondriyal parçalanmayı etkili bir şekilde tespit eder.
- Veriler, subsellüler partiküllerin yöneliminde bir azalma gösterir.
- Floresan doğrulama, optik ölçümlerin doğruluğunu onaylar.
- Bu yöntem, apoptoz sırasında organellerin dinamikleri hakkında bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Gabor benzeri filtreleme yöntemi, karanlık alan mikroskobunun hassasiyetini artırır.
- Bu teknik, çeşitli hücresel süreçleri incelemek için uygulanabilir.
- Mitokondriyal dinamikleri anlamak, terapötik stratejiler geliştirmek için esastır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Optical scatter microscopy using two-dimensional Gabor filters enables label-free quantification of subcellular structural dynamics, such as mitochondrial fragmentation during apoptosis, providing a non-invasive method to assess organelle morphology and function in living cells. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by offering quantitative, reproducible readouts of subcellular changes that correlate with functional outcomes, without reliance on fluorescent labels or complex inverse scattering models. The technique’s compatibility with existing microscopy platforms and rapid screening capability facilitate translational continuity from discovery to preclinical studies, enhancing predictive confidence in pathway modulation and compound screening efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying organelle orientation changes as a functional readout of subcellular stress or death pathways.
- Operational Value: Provides label-free, live-cell compatible measurements that reduce experimental variability and support reproducible target engagement assessments.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking compound-induced morphological changes to apoptotic progression through correlatable optical signatures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative aspect ratio maps from Gabor-filtered images that serve as objective, high-content morphological parameters for compound screening.
- Operational Value: Enables rapid acquisition of filtered images across hundreds of cells without high sampling rates, supporting scalable assay formats.
- Assay Readiness: Outputs are derived directly from the object's field transform, avoiding discretization artifacts and enabling consistent, label-free morphological profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Correlates optical scatter data with fluorescent validation to establish a translatable biomarker of organelle dynamics applicable across model systems.
- Preclinical Utility: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing early, measurable indicators of compound-induced subcellular reorganization.
- Mechanistic Insight: Offers distinctive morphometric parameters that reflect organelle size, shape, and orientation without requiring theoretical scatter models for non-spherical structures.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling label-free assessment of subcellular dynamics from early hypothesis testing through lead optimization, where morphological changes serve as functional proxies for pathway modulation and cellular health.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying organelle orientation shifts linked to apoptosis and differentiation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., aspect ratio, orientation maps) that enable comparison of compound effects across populations.
- Analytics: Provides statistical distributions of morphological parameters that help teams compare conditions and identify significant shifts in subcellular organization.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through correlatable optical and fluorescent signals, supporting biomarker alignment for organelle stress responses.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability on existing microscopes, reducing dependency on specialized fluorescence infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, label-free measurement of organelle dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via platform-agnostic implementation and minimal sample preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early detection of subcellular changes that precede functional outcomes, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing objective, quantitative morphological data to inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical setup alignment, including laser illumination, DMD programming, and Kohler adjustment for optimal signal acquisition.
- Dependent on instrumentation capable of spatial light modulation (e.g., DMD) and synchronized image acquisition systems for sequential filter-based imaging.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition protocols, exposure times, and filter bank sequencing to ensure data comparability.
- Adaptation across model systems may require optimization of illumination intensity and filter parameters based on subcellular refractive index and scattering properties.
- Practical limitations include sensitivity to out-of-focus light and the need for stable environmental control during long-term live-cell imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:50
Introduction
1:26
Protocol
2:18
Preparing the Optical Setup
6:57
Plating the Cells
5:26
Loading the Filterbank and Using the Setup to Acquire Filtered-Background Images
9:44
Performing Optical Scatter Microscopy
11:53
Representative Images
14:28
Conclusion
