Name: Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Öğrenin, GFP işaretli blastomerlerin nakli yoluyla kimerik zebra balığı embriyoları oluşturmayı ve retina ile beyin gelişimini canlı görüntüleme teknikleriyle incelemeyi. Bu yöntem genetik değişikliklerin hücre davranışları üzerindeki etkilerini anlamanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Erişmiş R01EY016099 ve Araştırma Körlük Kariyer Geliştirme Ödülü Engellenir: Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Çekirdek Grant (5P30EY008098) ve aşağıdaki fonlar XW tarafından desteklenmiştir. Kira Lathrop konfokal görüntüleme yardım için teşekkür ederim.

1. Gün. Hazırlık 1. Balık haçlar Akşam zebrafish ikili haç ayarlayın. Istenilen süre önce rastgele çiftleşme önlemek için, kadın ve erkek balık çiftleşme kasetleri ayrı bölücüler kullanın. GFP ifade transgenik balık donör blastomer kaynağı olarak kullanılır. Pt104 transgenik hattı (Zou ve ark, 2008), burada kullanılan EF1 promotör kontrolü altında yayg GFP ifade eder. GFP ifade donör hücreleri canlı görüntüleme görselleştirme sağlar. Uygun floresan proteinleri ifade transgenik balık hatları belirli ihtiyaçları için kullanılıyor olabilir. 2. Embriyo tutmak için kama şeklindeki agaroz kuyuları hazırlayın E3 yumurta su (Westerfield 2007) hazırlanan erimiş% 1 agaroz, bir Petri kabı içine dökün. Agaroz çözüm kama şeklinde çıkıntılar vardır ve agaroz çözümü tamamen katılaşmaya plastik bir kalıp Float. Kalıp dikkatlice çıkarın ve E3 su ile agaroz yatak batırmayın. 3. Transplantasyonu iğneler hazırlayın Cam kapiller pipetler (Dünya Hassas Çalgı) çekerek iğne yapmak 11,5 ayar güçte bir dikey İğne çektirmesi (David Kopf Aletleri) kullanın. İyi iğne uçları, uzun miller ile konik olmalıdır. , Iç çapı 40-45μm Eğimli açıklıkları (Şekil 1A) elde edilir kadar Micro Öğütücü (Marishige) ile 45 derecelik bir açıyla iğne uçları Grind. Iğne uçları temizlemek için, iğne künt ucu bir hortum takmak, bir şırınga hortum bağlayın ve sonra emmek ve tüm görünür enkaz çıkarılana kadar% 10 hidroflorik asit çözeltisi bırakın. Daha sonra,% 100 etanol ile takip ipuçları, saf su ile yıkayın. Tüm etanol buharlaşır kadar iğne Hava kurulayın. Artık etanol yüksek sıcaklık parlatma adımı sırasında iğne berbat: ipuçları tamamen kuru olduğundan emin olmak için çok önemlidir. Iğne uçları pürüzlü kenarlarını yumuşatmak ve parlatmak için, iğne uçları filament Micro Forger (Marishige) tarafından üretilen ısı ile pişirin. Iğne uçları parlatma sırasında filament dokunmasına izin vermeyin. Filament iplik ve iğne uçları arasındaki mesafe olsa da geçen elektrik miktarı istenilen ısıtma koşullarını elde etmek için ayarlanabilir. Sıcaklığı çok yüksek olmamalıdır: Bu erime ve iğne uçları deforme olacaktır. Pürüzlü kenarlar düzeltilir sonra, dikkatli bir iğne ucu ile ısıtılan filaman dokunun ve sonra yavaşça iğne, sivri bir uç oluşturmak için (Şekil 1B) uzak filament çekin. , Keskin, pürüzsüz ve temiz bir iğne sağlam donör blastomer elde etmek için ve ev sahibi embriyolar zarar için kritik öneme sahiptir. 4. Bir embriyo konumlandırma prob hazırlayın Düzeltilir bir ucu ile ince bir cam probu elde etmek için bir gaz alev üzerine cam bir pipet çekin. Bu prob önce nakli uygun yönlendirmeyi embriyoları yerleştirmek için kullanılır. 2. Gün. Blastomer nakli 1. Toplayın ve dechorionate embriyolar Ertesi gün, arkadaşı balık izin çapraz kasetleri bölücüler çıkarın. E3 su ile dolu bir Petri kabındaki embriyoların yerleştirin. Daha sonra, ince forseps bir çift elle embriyoların chorions koparıp dechorionate embriyolar. Dikkatle agaroz kuyulara dechorionated embriyo transferine bükük şaft bir cam pipet kullanın. Embriyoların hava ile herhangi bir temastan kaçının, patlamaya embriyolar neden olur. Embriyolar 28.5 geliştirelim ° C agaroz kuyuları, 3 saat gübreleme, ya da hpf kadar. 2. Nakli aparat Embriyoların geliştirirken, mineral yağ dolu mikro pompa sistemi transplantasyonu iğne bağlayarak nakli aparat kurdu. Sistem kaçak değildir ve herhangi bir hava kabarcığı sistem içinde sıkışıp kalırlar emin olun. Geri mineral yağ ile 0,5 hariç tüm nakli iğne doldurmak alan 1 ul ucu açılışında. 3. Blastomer Nakli Blastomer nakli için, 3-4-hpf embriyoların blastomer tarafında yukarı doğru yönlendirmek amacıyla cam konumlandırma prob kullanın. Sonra, yavaşça bir donör embriyo nakli iğne yerleştirin ve yavaş yavaş iğne 5-20 blastomer emmek. Bir dizi embriyo içine blastomer dolu bir iğne takın ve blastomer yavaşça bırakın. Onların soyu daha sonra gelişim evreleri yerde lokalize blastomer yayımlanan site etkileyecektir. Retina ve beyin gelişimi, hayvan kutup hücreleri serbest analiz etmek. Nakli sırasında, iğne ucu hava teması olmadığından emin olun. Mekanik zararları en aza indirmek için, ev sahibi embriyolar ertesi güne kadar 28.5 ° C'de agaroz kuyularda sol olacaktır. Sonra, tHer iyi bir embriyo ile,% 1 agaroz 0.5 ml ile ön kaplı 24-kuyucuğu mozaik embriyolar ransfer. E3 yumurta su 1 ml her kuyuya eklenir. Bakteriyel enfeksiyonları önlemek için, 10 ul 100X penisilin ve streptomisin E3 yumurta su ekleyin. 3. Gün. Gömme ve mozaik embriyoların canlı görüntüleme 1. Gömülmesi embriyolar E3 yumurta suda% 1.5 düşük erime noktası agaroz (LMP) hazırlayın ve 30 ° C su banyosunda çözüm tutmak. 0.17mm kalınlığında bir cam alt FluoroDish doku kültürü çanak (Dünya Hassas Aletler) bir mozaik embriyo transferi. E3 asgari bir miktarı kapsadığı embriyo bırakmak aşırı E3 suyu çıkarın. Embriyo 30-50 ul erimiş% 1.5 LMP ekleyin. Agaroz çözüm katılaşır önce cam dibine mümkün olduğunca yakın olarak göz veya beyin hızla yerleştirin. Çözüm soğuduktan sonra, embriyolar daha yerinde sabitlemek için ek agaroz çözüm ekleyin. Daha sonra, 2-3 ml E3 yumurta su ile katılaşmış agaroz blok bırakın. 2. Konfokal Görüntüleme Konfokal mikroskopi için, büyük odak derinliği ile su daldırma ters objektif (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japonya) kullanılır. Amaç üzerine bir damla su eklenir ve daha sonra objektif bir FluoroDish doku kültürü çanak yerdir. Görüntü geliştirme için, embriyoların her 5 dakikada bir fotoğraf çekmeye zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirin. Deney doğasına bağlı olarak, çekimler arasında zaman aralıkları ayarlanabilir olmalıdır. Temsilcisi sonuçları Şekil 2 temsilcisi, 24-hpf mozaik zebrafish göstermektedir. GFP ifade yeşil donör hücreleri vurgulamaktadır. Retina nöroepitelyal hücrelerin tüm retina duvar kalınlığı kapsar. Film 24 hpf ev sahibi beyin donör hücreleri hareketlerini gösterir. Bildirimi hücrelerinin morfolojileri zamanla değişir. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 nakli iğne uçları Şekilleri. A., bir iğne ucu kesik bir açılış hidroflorik asit yıkar sonra enkaz serbest bırakıldı. B. iğne ucunda sivri ucunu oluşturulmuştur. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Görselleştirme GFP-24 hpf kimerik zebrafish embriyolar donör hücreleri ifade. Sol panelinde, beyin ve retina GFP sinyalleri gösterir. Orta panel, parlak bir alan resim embriyo. Sağ panelde Birleştirilen görüntüyü gösterir. Film 1 GFP pozitif donör hücreleri görüntüleme, beyin nöroepitelyal hücrelerinin gelişimi sırasında morfolojileri kapsamlı değişiklikler gösterdi Canlı . 24 ve 25 hpf arasında her 5 dakikada bir filmin kareleri tek tek toplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">film görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

Bu video, blastomer nakli zebrafish retina ve beyin gelişimini analiz etmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu protokol aynı zamanda ilgili yerlere sadece ev sahibi embriyolar donör blastomer bırakmadan diğer doku ve organların gelişimini analiz etmek için kullanılabilir. GFP molekülleri ile etiketleme, floresan boya konjuge Dextran&#39;ın (Ho ve Kane 1990) ile etiketleme daha temiz bir arka plan verir. Bu ölü donör hücreleri Dextran&#39;ın boyaların enkaz böylece görüntüleme (Catalano ve ark, 2007) ile çık...

E3 yumurta su: <ul><li> 5 mM NaCl </li><li> 0.17 mM KCl </li><li> 0.33 mM CaCl 2 </li><li> 0.33 mM MgSO 4 </li><li> % 0.1 &#39;lik metilen mavisi </li></ul>

transplantasyon gfp of-kimerik zebra balığı embriyolar retina ve beyin gelişimi canlı görüntüleme blastomer ifade

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Hücreler embriyogenez sırasında konumlarını ve mal yaygın olarak değişir. Bu değişiklikler hücre ve çevreleri arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenir. Farklı genetik arka plan hücreleri oluşur Kimerik embriyolar, genler tarafından ilgi aracılı hücre-hücre etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlardır. Erken gelişim aşamasında zebrafish embriyonik şeffaflık, hücresel düzeyde, doku ve organların morfolojilerinden doğrudan görselleştirme izin verir. Burada, zebrafish embriyolar kimerik retina ve beyin oluşturmak ve donör hücreleri canlı görüntüleme gerçekleştirmek için bir protokol göstermektedir. Protokol nakli iğneler, nakli hazırlık kapsar GFP ifade GFP-negatif ana donör blastomer ve canlı konfokal mikroskobu altında donör hücre davranışlarının incelenmesi. Hafif değişiklikler, bu protokolü de embriyonik gelişim zebrafish diğer doku ve organları incelemek için kullanılan olabilir. Etiket donör hücreleri GFP kullanmanın avantajları da tartışılır.

Biz embriyogenez sırasında canlı görüntüleme hücresel davranışı için kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir protokol ortaya koymaktadır.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Embriyogenez sırasında hücrelerin konumları ve özellikleri kapsamlı bir şekilde değişir. Bu değişimler, hücreler ile ... arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenir.

Blastomerler, gelişimin bölünme aşamasında oluşan embriyonik hücrelerdir. Burada, GFP ile işaretlenmiş blastomerler bir transplantasyon iğnesi kullanılarak bir zebra balığı embriyosundan diğerine aktarılmaktadır. Bu yöntem, farklı genetik arka plana sahip blastomerlerin davranışlarının ve kaderlerinin, normal bir embriyo içerisinde veya tam tersi şekilde canlı mikroskobik görüntüleme yoluyla takip edilmesine olanak tanır.Merhaba, ben Dr. Zoran, Pittsburgh Üniversitesi Oftalmoloji Bölümü'ndeki Dr. Shawe'nin laboratuvarındanım. Bugün size zebrafish embriyolarında blastomer taşınımı prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü retina ve beyin gelişimini incelemek için kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Rastgele çiftleşmeyi önlemek için akşam saatlerinde zebra balıkları için ikili çaprazlamalar kurun. İstenilen zamandan önce, dişi ve erkek balıkları ayırmak için bölücüler kullanın. Burada.GFP eksprese eden transgenik balıklar, donör blastomer kaynağı olarak kullanılır. PT 1 0 4 transgenik hattı, EF one promotörünün kontrolünde yaygın olarak GFP eksprese eder; embriyoları tutacak agroz kuyucuklarını hazırlamak için E three yumurta suyunda hazırlanmış eritilmiş %1 agroz çözeltisin

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Nakli ile blastula veya gastrula aşamada hedef kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir adım-adım rehber.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

Zebra balığı hücre nakli, doku spesifik kimeralar üretmek için genetik ve embriyoloji kombinasyonu sağlar. Bu video gastrula laboratuarımızda önbeyin komissür oluşumu sırasında, Astroglial nüfus ve özel rehberlik ipuçları rollerini araştırmak için izin hücre transplantasyon sahnelenen göstermektedir.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Dying hücreler komşu hücrelerle birlikte daralma bariyer fonksiyonunu bozmadan epitel dokuların ekstrüde. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada hücresel çözünürlükte larva zebrafish epidermisin neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemleri açıklanmaktadır.

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir aşamada yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin nakli için bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Öğrenin, GFP işaretli blastomerlerin nakli yoluyla kimerik zebra balığı embriyoları oluşturmayı ve retina ile beyin gelişimini canlı görüntüleme teknikleriyle incelemeyi. Bu yöntem genetik değişikliklerin hücre davranışları üzerindeki etkilerini anlamanızı sağlar.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Daha fazla video keşfet