Name: Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Keşfedin hayvan kap nakli testi ile Xenopus laevis embriyolarında doku kaderi belirlenmesini. Bu yöntem gen ifadesinin hücre kaderini nasıl etkilediğini gösterir ve gelişim biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Körlük (Kariyer Geliştirme MEZ ve ASV Ödüller ve sınırsız ödenekle Göz Hastalıkları Bölümü), E. Matilda Zeigler Vakfı (MEZ ve ASV) ve Ulusal Göz Enstitüsü / NIH (MEZ Önlemek Araştırma hibeleri tarafından desteklenen , hibe R01EY015748 ve R01EY017964).

Bölüm I. ACT Testi için Set-up <ol><li> Kloroform arıtma yöntemi (Uygulamalı Biosystems / Ambion, Austin, Teksas örneğin mMessage mMachine Kit), fenol kullanarak üretici tarafından önerilen enjeksiyon için kapaklı RNA oluşturun. Floresan proteini kodlayan RNA bir izleme olarak kullanılır. Biz ya sarı floresan protein (YFP) veya bir pCS2 + ifade vektör cDNA mCherry 5, yazıya. </li><li> Mikropipet çektirmenin konik cam ipuçları oluşturmak için borosilikat cam kapiller tüplerin çekin. Biz Sutter Mikropipet Çektirme, P-97 (Sutter Instruments, Inc, Novato, CA), daha önce 6 tarif. </li><li> KCl 20 mM, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, pH 7.5 ayarlanır, otoklava ve saklanan bir 10 X Marc Kullanıcı Modifiye Zil Kullanıcı (MMR) çözüm stok (10 mM MgCl 2 Tablo 1'de steril solüsyonların olun RT). </li><li> Testisler erkek kurbağa izole etmek ve doku 1X MMR / gentamisin (50 mg / ml gentamisin sülfat; BioWhittaker, Kedi # 17-518Z) steril bir çözüm 4 ° C'de saklamak. Bu deney başlamadan önce bir hafta kadar yapılabilir, ancak zaman içinde etkinliğini kaybeder. </li><li> Yumurtlama çözümü (1X: 150 mM NaCl, 2.62 mM KCl, 0.8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma baz, 2.62 mM NaHCO 3 ve 2.75 mM MgSO 4; pH 7.6 düzeltilmiş), 8X stok olarak kılınan 4 saklanabilir ° C iki hafta kadar Not: Bu çözüm kirlenme dikkat, bu yumurta kalitesini etkiler. </li><li> Enjeksiyon tabak oluşturun. Bunu yapmak için, yavaşça kabarcıklarını engellemek ve yaklaşık soğuması için çözüm üstünde bir elastomer kalıp (Şekil 1) Penis, 60 mm tabak içine ~ 6 ml erimiş agaroz çözümü eklemek, bir mikrodalga 0.4X MMR% 1 agaroz eritebilir RT 20 dakika. Gerekli sayısını belirlemek için, deneysel koşullar sayısını düşünün (örneğin 1, YFP; 2, YFP + Noggin) ve nakledilen ana embriyoların sayısı gerekli. Deneyler için, biz her deneysel koşul için en az 20 nakledilen ev sahibi embriyolar üretmek. 18-19 ° C, embriyolar yaklaşık bir saat için 15 sahne olması. 20 nakli gerçekleştirmek için bir saat sürer, sonra iki gübreleme zaman noktalarında, ev sahibi embriyolar nakli kabul varsayarak ihtiyaç vardır. Bu nedenle, dört enjeksiyon yemekleri (2 exp x 2 gübreleme zaman noktalarında = 4) ihtiyaç duyulacaktır. Plakalar, bir haftaya kadar 4 ° C'de saklayın. </li><li> Enjeksiyon plaka için gibi kalıpları ile% 1 agaroz + 0.7X MMR kullanarak kap izolasyon plakaları oluşturun. Kap izolasyon enjeksiyon plakaları artı bir ekstra başına döllenme zamanı noktası (4 + 2 gübreleme zaman noktalarında = 6) olarak aynı sayıda olun. </li><li> Insan koryonik gonadotropin 500 adet mikroenjeksiyon önceki gün gün geç kadın enjekte edilir. Mağaza kadın ° C gecede 16-18. </li></ol> Bölüm II. Xenopus laevis embriyoların RNA Mikroenjeksiyon A. mikroenjeksiyon için hazırlanması <ol><li> Hormonal uyarılan kadın çıkarın ve 1X yumurtlama çözümü (ELS) Not içeren bireysel tankları koyun: ELS, yumurta kalitesi düşer olarak iki saatten fazla yumurta kullanmayın . Bu nedenle, sadece yeni yumurtlamada toplanır, böylece yaklaşık bir saat önce in vitro fertilizasyon, tankın tüm yumurta atmak. </li><li> Mikroenjeksiyon için iğne ucu kapalı kırpma 25-35 mikron çapında elde etmek için hazırlayın. Picoinjector yerleştirin ve üzerine iğne, enjeksiyon başına 10 nL dağıtır, böylece kalibre. </li><li> 14 ° C'ye kadar bir inkübatör ayarlayın </li><li> Bir kez kadın yumurtladığı yaklaşık bir saat, bir transfer pipet kullanarak tank yumurta kaldırmak ve 60 mm Petri kapları içine yerleştirin. Mümkün olduğu kadar yumurtaları çok ELS olarak çıkarın ve 1X MMR ile değiştirin. Yumurtalar hemen döllenmiş veya bir saat için 1X MMR kalmak olabilir. Transplant tahlil için, üç ayrı gruplar halinde yaklaşık 11 am, öğle ve 13:00 iki çanak,% 80 kadar yumurta, tek katmanlı bir tam döllemek için en iyisidir. Enjeksiyondan sonra, 14 yaşında alınacaktır ° C kadar kap izolasyonu (evre 8,5-9) ve organ nakli için istenen aşamalarında büyüyecek (evre 15; yukarıda Ben # 6 Part). </li><li> Testislerin kalite kontrol etmek için, biz, ilk sperm uygulanabilir değilse, bize başka bir erkek testis ayıklamak için sağlayan bir sabah erken fertilizasyon (~ 08:00), gerçekleştirir. Not: 1 ml 1X MMR ~ 0.25 testisler homojenize ve oosit plaka başına yaklaşık 5 ila 7 damla ekleyin. </li><li> In vitro homojenize testisler ile yumurtaları döller ve bir saat sonra, de-jöle çözümü kullanarak yumurta jöle kat kaldırmak (164μl 1M DTT + 10 ml 1M Tris, pH 8.8, 50 ml otoklavlanmış nanopure su) . Oda sıcaklığında (22 ° C) ° C veya 1,5 saat 18 yaklaşık 2 saat sürer sıralama, başlamak için iki hücreli aşamaya ulaşmak kadar bekleyin. </li><li> Bir transfer pipet, sıralama, düzgün pigmentli ve eşit olarak bölerek embriyolar, 0.4X MMR +% 6 Ficoll ile dolu bir enjeksiyon çanağı kuyuya, sol hayvan kap Şekil 3'te gösterilmiştir. </li></ol> B. Mikroenjeksiyon <ol><li> 60 mm Petri kabı kapağı üstünden Parafilm gerin. Pipet 2 ul enjeksiyon iğnesi doldurmak için PLI-100 kullanarak Parafilm ve aspirat üzerine ilk RNA örnek. Iğne, enjeksiyon başlamadan önce örnek hala 10 nL dağıtım olduğunu kontrol etmek için emin olun. </li><li> 7 başka bir çanak bir çanak 500 pg YFP RNA ve ilgi gen (örneğin 20 pg Noggin RNA) artı YFP RNA ile 20-30 iki hücreli dönem embriyoların (her iki blastomer) enjekte edilir. </li><li> Ficoll solüsyonu ile başka bir enjeksiyon çanak zaman noktası başına koyun 100-200 olmayan enjekte embriyolar. Inkübatör enjekte edilen embriyolar gibi, aynı zamanda onları içeri ve dışarı. Bu Bölüm IV kullanılmak üzere bilgisayarların. </li><li> Enjeksiyondan sonra, ° C gecede 14 embriyolar inkübe. Tüm zamanların puan için tekrarlayın. </li></ol> Bölüm III. Enjekte edilen embriyolardan hayvan kapakları Isolate <ol><li> Embriyoların sahne için sabahın erken saatlerinde ulaşıyoruz. Erken bir zaman noktasında sahne 9 olmalıdır. Hayatta olmadığını, bu çıkarın. Gruplar halinde her zaman noktası ile çalışan aşağıdaki adımları ile devam edin. </li><li> Her plaka Ficoll çözüm dökün ve geri 0.7X MMR / gentamisin çözeltisi ekleyin. Bir kap izolasyon çanak 0.7X MMR / gentamisin çözüm bol miktarda ekleyebilirsiniz. Bir transfer pipeti yeri ve taze hazırlanmış kapağı izolasyon çanak kullanarak enjeksiyon çanak kuyu embriyolar yerinden oynatın. </li><li> Evreleme için 2 veya 3 sağlam embriyolar tutmak, 0.7X MMR + gentamisin çözüm hayvan kapakları izole edin. Sarı bir ucu 400 mm için eğildi, ya da bir çift keskin sayısı 5 forseps ile donatılmış Gastromaster, Ya kullanılabilir. </li><li> Kapaklar, ertesi güne kadar 14 ° C inkübatör geri koyun. Donör dokusu aynı gelişim aşamasında onları tutmak için kapaklar aynı zamanda ev sahibi embriyolar inkübatör çıkarılmalıdır. </li></ol> Bölüm IV. Kanadını üzerine kapaklar Nakli <ol><li> 14 ° C inkübatör ilk kez noktadan kapakları ve embriyolar çıkarın ve embriyoların aşamasında. Tracer enjekte (Şekil 2) bağlı olarak tek tip sarı veya kırmızı floresan pozitif kapaklar, sıralayın. </li><li> Kapaklar sayısını ve 0.7X MMR / gentamisin çözeltisi ile taze hazırlanan enjeksiyon çanak sahne 12-13 embriyoların sayısı iki katına çıkarmak. Keskin # 5 forseps ile, her vitellin membran çıkarın. Kapaklar plaka aktarabilirsiniz, ancak dikkatli olun. Vitellin membranlar olmadan, embriyolar hızlı su yüzeyinde ayrılabilir. </li><li> Gastromaster (sarı ucu, 200-250μm bükülmüş tel, en yüksek ayar) veya # 5 forseps kullanarak, embriyo aşamasında 14-15 (Şekil 3) tarafında kare 200 mikron çıkarın. Daha sonra, yarım kap kesmek (gastromaster veya # 5 forseps) ve ev sahibi embriyo yapılan delik doku. Iyileşmesini sağlamak için iyi karşı embriyo döndürün. Aşamada 15 yaşında iken, mümkün olduğunca çok sayıda embriyolar olarak bunu yapın. Tüm zamanların puan için tekrarlayın. </li><li> Embriyo genellikle 30 dakika içinde iyileşir. # 5 forseps ile yumuşak bir fırçalama hareketi ile ölü hücreleri (beyaz) çıkarın. 18 ° C gecede bunları büyütün. </li><li> Diseksiyon floresan mikroskop altında floresan etiketli, nakledilen doku tür embriyoların. Onları geri koyalım 18 ° C aşamada 42-43 kadar büyümeye. </li><li> Tricaine hayvanların anestezisi. Bu noktada, floresan diseksiyon mikroskobu altında fotoğraf çekebilirsiniz. Yapıldıktan sonra, bölümünü düzeltmek ve ilgi doku belirteçleri kullanılarak in situ hibridizasyon immunostain veya gerçekleştirmek. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Tasarım embriyonun tutma yemekleri yapmak için kullanılan elastomer kalıp döküm için Pleksiglas. 38 x 38 mm yuvarlak köşeli kare (~ 5 mm derinliğinde) 50 x 50 mm kare ve 25 mm kalınlığında bir parça Pleksiglas yönlendirilir olmuştur. Dairesel, eşit aralıklı kuyuları (1.5 mm çap) 1 mm plastik derinliklerine delinmiştir. Mikroenjeksiyon yemekleri için elastomer kalıp yapmak için, üreticinin talimatlarına göre, Sylgard elastomer Pleksiglas içine dökülür ve katılaşmaya izin. Bu elastomer kalıp, enjeksiyon ve kap izolasyon plakaları yapmak için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Ifadesi değişebilir Hayvan kap nakli için önce sıralama önemlidir. Soldaki Hayvan kapağı doku boyunca eşit mCherry ifade sağda eksplant sivilceli bir ifade vardır ve atılır . <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Bir ev sahibi tadpole, nakledilen hayvan kap hücrelerinden kanadında bir göz gibi bir yapı geliştirmiştir. floresan görüntü aydınlık görüntü üzerine yerleştirilmiştir olmuştur.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

Bu video, hayvan kap nakli tahlil oluşturmak için yeniden düzenlenmiştir Xenopus biyologlar tarafından kullanılan klasik teknikleri, bizim sürümü göstermiştir. Oda sıcaklığında, Xenopus embriyolar evre 9 ve 15 ile çok hızlı bir şekilde gelişir. 14 yaşında yerleştirerek ° C, embriyo gelişimi yavaşladı ve çok daha fazla bir deneyde nakli yapılabilir. Yaşlı aşamaları (42/43) embriyolar büyümek için gerekli ise, o zaman biz büyük tetarlar enjekte floresan protein sinyal kaybolur beri, transgenik Venus YFP ...

<table><tbody><tr><td>mMessage mMachine SP6 Kiti</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat Kapiler Tüpler (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Mikropipet Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin sülfat [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard/elastomer Kiti 1.1lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm polistiren petri kabı</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>insan koryonik gonadotropini</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>Pico-Injector Mikroenjeksiyon Sistemleri</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm İnkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>Dumostar #5 Pens</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

doku belirlenmesi hayvan cap nakli (act) testi xenopus laevis</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Çoğu protein, embriyonik gelişim ikili bir rol oynarlar. Belirli bir doku düzenleyen hücre kaderinin belirlenmesinde de daha geniş bir bölge embriyonun gelişimi etkileyebilir. Bu analiz etmek zor, belli bir doku rolünü tanımlayan hale getirir. Örneğin,<em&gt; Noggin</em&gt; Aşırı ekspresyonu<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar göz dahil olmak üzere, tüm ön bölgenin genişleme neden<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Bu sonucu, Noggin sinir dokusunun bir genişleme neden göz belirlenmesi ya da doğrudan bir rol oynar, Noggin dolaylı göz oluşumunu etkiler bilinmemektedir. Bu karmaşık bir fenotipe sahip hücre kaderinin belirlenmesinde göz özel rolünü analiz etmek zor eğitim yapar. Biz bu sorunun üstesinden bir test geliştirdiler. Pluripotent doğanın yararlanan<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Hayvan kap<sup&gt; 3</sup&gt;, Bizim gibi, gen ürünü (ler) yeteneğini test etmek için bir test geliştirdiler<em&gt; Noggin</em&gt; Ya da göz alan transkripsiyon faktörleri (EFTFs), embriyo yüzüne bu doku nakli, belirli bir doku veya hücre tipleri içine kapakları dönüştürmek için<sup&gt; 4</sup&gt;. Noggin protein tedavisi ya da transkripsiyon faktörlerinin bir toplama ya da hayvan kapakları retinal hücre kaderini belirleyecek olsa da, bu prosedür de diğer dokularda belirterek ilgili gen ürün (ler) tanımlamak için kullanılır.

Hayvan kapaklar eksprese gen ürün (ler), gelişmekte olan kanadını nakledilen<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyoların doku tespit olup olmadığının belirlenmesi için.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Birçok protein, embriyonik gelişimde ikili bir rol oynamaktadır. Belirli bir dokuda hücre kader belirlemesini düzenleyen proteinler, aynı zamanda gelişimi etkileyebilir...

Bir CT deneyinin genel amacı, ilgilenilen bir genin veya genlerin primitif dermi belirli bir hücre kaderine yönlendirip yönlendiremediğini test etmektir. Prosedür, öncelikle floresan raporlayıcı genle kodlanmış RNA'ların ve ilgilenilen gen veya genlerin gelişmekte olan Xenopus laevis embriyolarında aşırı eksprese edilmesiyle başlar. Bir sonraki adım, aşırı eksprese edilen RNA'ları ifade eden hayvan kapağının (animal cap) veya primitif odun (primitive odum) bölgesinin diseke edilmesi ve bunların 15. evreye kadar büyütülmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, evre 15 konak embriyosunun yan kısmındaki dokunun çıkarılmasıdır. Son adım ise, donör hayvan başlığı dokusunun yarısının konak embriyosunun yan kısmına nakledilmesi ve konağın evre 42 ile 43'e kadar büyütülmesidir. Sonuçlar; kesit alma ve dokuya özgü belirteçler için immün boyama yoluyla, göz benzeri yapılar gibi ektopik doku oluşumunu göstermektedir.Merhaba, ben Upstate Medical University Oftalmoloji Bölümü'nden sine. Bugün size, Mike Suber ile iş birliği içinde geliştirdiğim ve hayvan başı nakil deneyi olarak adlandırdığımız prosedürü göstereceğim. Göz oluşumu için yeterli olan genleri incelemek amacıyla bu deneyi her iki laboratuvarımızda da kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, enjeksiyon için cap RNA'ları hazırlayın; noggin veya ilgilenilen başka bir geni ve izleyici olarak kullanılacak YFP'yi transkribe edin. Ayrıca MMR bazlı çözeltileri, sekiz x yumurtlama çözeltisi stokunu ve embriyoları enjekte etmek için iğneleri hazırlayın.Embriyo tutma kaplarının yapımı için özel yapım bir elastomer kalıp kullanılır. Mikrodalgada 0,4 XMMR içinde %1 AROS eriterek her deneysel koşul için bir enjeksiyon plakası oluşturun. Çözeltiden yaklaşık altı mililitreyi 60 milimetrelik bir plakaya aktarın.Kabarcıkları önlemek için solüsyonun üzerine nazikçe bir elastomer kalıp yerleştirin ve yaklaşık 20 dakika boyunca soğumaya bırakın. Oda sıcaklığında, enjeksiyon plakaları için az önce gösterilen kalıpları kullanarak, %1 AGROS artı 0.7 XMMR ile her deneysel koşul için bir adet kap izolasyon plakası hazırlayın. Her zaman noktası için ek plakalar hazırlayın.Zaman noktalarının hesaplanmasına ilişkin ayrıntılar için beraberindeki yazılı protokole başvurun. Ardından izolasyon gerçekleştirin. Bunları erkek bir kurbağadan test edin ve dokuyu, 50 µg/mL Gentamycin ile takviye edilmiş 1X MMR steril çözeltisi içinde 4 °C'de saklayın.Bu işlem deneyin başlangıcından bir hafta öncesine kadar yapılabilir, ancak spermin zamanla etkinliğini kaybettiğini unutmayın; mikroenjeksiyondan önceki günün geç saatlerinde uygulanmalıdır. Dişilere 500 ünite insan koriyonik gonadotropini enjekte edin. Dişileri gece boyunca 16 ila 18 °C'de tutun.Artık ertesi gün yapılacak mikroenjeksiyon için her şey hazır. Hormonal olarak indüklenmiş dişileri çıkararak ve her birini bir XELS içeren ayrı tanklara yerleştirerek başlayın. İğnenin ucunu keserek mikroenjeksiyon için hazırlayın.25 ila 35 mikrometre çap elde etmek için, iğneyi PLI 100 pico enjektörüne yerleştirin ve her enjeksiyonda 10 nanolitre verecek şekilde kalibre edin. Döllenmeden yaklaşık bir saat önce yumurtaları tanktan çıkararak bir inkübatörü 14 degrees Celsius'ye ayarlayın. Dişiler ek bir saat daha yumurta bıraktıktan sonra, yeni bırakılan yumurtaları tanktan çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın. RNA ile enjekte edildikten sonra çıkış kısmını bu daha düşük sıcaklığa yerleştirmek, embriyonun gelişimini yavaşlatır ve tek bir deneyde çok daha fazla transplantasyon gerçekleştirilmesini sağlar.ELS çözeltisinde iki saatten fazla kalmış yumurtaların kullanılmamasına dikkat edin. Yumurta kalitesi azaldıkça, yumurtaları 60 milimetrelik petri kaplarına yerleştirin. Kap, tek bir yumurta tabakasıyla yaklaşık %80 oranında dolu olmalıdır.Yumurtalardaki ELS'nin mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın ve yerine bir miktar XMMR ekleyin. Yumurtalar bir saat kadar XMMR içinde kalabilir. Ardından, yumurtaları homojenize testislerle in vitro olarak dölleyin.Embriyoların istenen evrelere ulaşabilmesi için döllemenin saat 11:00, öğlen ve 13:00 civarında üç ayrı grup halinde yapılması en iyisidir; kap izolasyonu için 8,5 ile 9. evre, transplantasyon için ise 15. evre hedeflenir. Yumurtaların döllemesinden bir saat sonra, D jelly Çözeltisi kullanarak yumurtaların üzerindeki jöle tabakasını temizleyin, bol miktarda 0.1 XMMR ile yıkayın ve ardından döllenmiş yumurtaların iki hücreli evreye ulaşmasını bekleyin.Ayıklama işlemine başlamak için, 0.4 XMMR ve %6 F ccal ile doldurulmuş bir enjeksiyon kabı hazırlayın. Embriyolar iki hücreli evreye ulaştığında, homojen şekilde pigmente olmuş ve düzenli bölünen embriyoları enjeksiyon kabının kuyucuğuna ayıklamak için bir transfer pipeti kullanın.Mikroenjeksiyona geçmek için önce bir 60 milimetrelik petri kabı kapağının üzerine bir gergi profili yerleştirin. Biyofilm üzerine iki µL RNA örneği pipetleyin ve aspire edin. Enjeksiyon iğnesini doldurmak için piko enjektör kullanın.Enjeksiyona başlamadan önce iğnenin hâlâ 10 litrelik örnek verdiğinden emin olun. RNA, iki hücreli evredeki embriyoların her iki blastomerine enjekte edilir. 20 ila 30 embriyoyu, her birine 500 picogram Y-F-P-R-N-A enjekte ederek tek bir kaba yerleştirin.Diğer 20 ila 30 embriyoyu, her birine Y-F-P-R-N-A ile önceden karıştırılmış 20 picogram Nain RNA enjekte ederek bir kaba yerleştirin. Ek olarak, her zaman noktası için 100 ila 200 adet enjeksiyon yapılmamış embriyoyu FICO çözeltisi içeren başka bir enjeksiyon kabına yerleştirin. Bu embriyoları, enjekte edilen embriyolarla aynı zamanda inkübatöre sokun ve inkübatörden çıkarın.Bunlar, enjeksiyondan sonra kapların nakli için kullanılacak konakçılardır. Tüm embriyoları gece boyunca 14 °C'de inkübe edin. Planlanan tüm zaman noktaları için işlemi tekrarlayın.Gece boyu süren inkübasyonun ardından hayvan şapkası izole edilebilir. Embriyoların evresini belirlemek için sabah erken saatte gelin. Ayrıca inkübatörden enjekte edilmemiş konak embriyoları çıkarmayı da unutmayın.En erken zaman noktası dokuzuncu evrede olmalıdır. İlk olarak, hayatta kalmayan embriyoları uzaklaştırın. Canlı embriyolardan hayvan kaplarını izole etme işlemine geçin ve her zaman noktasıyla, bir kap izolasyon kabına grup grup çalışarak devam edin.Bol miktarda 0.7 XMMR artı gentamisin çözeltisi ekleyin. Ardından, enjekte edilmiş embriyoları içeren her plakadaki fol çözeltisini dökün ve tekrar 0.7 XMMR artı Gentamisin çözeltisi ekleyin. Embriyoları bir transfer pipeti kullanarak enjeksiyon kabı kuyucuklarından çıkarın ve yeni hazırlanmış olan kap izolasyon kabına yerleştirin.Hayvan kapaklarını 0.7 XMMR artı Gentamisin çözeltisi içinde izole etmek için ya 400 µm'ye bükülmüş sarı uçlu bir gastro master ya da bir çift keskin 5 numara pens kullanın. Evreleme için iki veya üç adet sağlam embriyoyu saklayın. Hayvan kapaklarını izole ettikten sonra, kapaklar ertesi gün konak embriyoların yan tarafına transplant edilene kadar, konak embriyolarla birlikte 14 °C'lik inkübatöre geri koyun.İlk zaman noktasına ait kapakları ve konak embriyoları 14 degrees Celsius'lik inkübatörden çıkarın, embriyoları evreleyin ve homojen floresan pozitif kapakları seçin. Kapak sayısını belirleyip bunları uzaklaştırın. Keskin uçlu 5 numara pens kullanarak, taze hazırlanmış 0.7 XMMR artı Gentamycin çözeltisi içeren bir enjeksiyon kabına konak embriyoların iki katı kadar embriyo aktarın.Her bir konak embriyosundan Lene membranını çıkarın. Embriyoları kapakların bulunduğu plakaya aktarın, ancak Lene membranları olmadan dikkatli olun. Embriyolar, en yüksek ayarda 200 ila 250 mikrometrelik bükülmüş tel uçlu sarı uç takılmış bir gastro master veya 5 numara pens kullanılarak su yüzeyinde hızla ayrıştırılabilir.14 ila 15. evredeki embriyonun yan tarafından 200 mikrometrelik bir kare çıkarın. Ardından, gastro master veya 5 numara pens kullanarak kapağı ortadan ikiye kesin ve dokuyu konak embriyoda açılan deliğe yerleştirin.İyileşme sağlamak için embriyoyu kuyucuğa yaslayarak döndürün. Embriyolar evre 15'teyken bunu yapabildiğiniz kadar çok embriyo için uygulayın. Tüm zaman noktaları için işlemi tekrarlayın.Embriyo genellikle 30 dakika içinde iyileşir. Ardından, beş numara pens ile beyaz görünen ölü hücreleri hafifçe fırçalama hareketiyle uzaklaştırın. Transfer edilen embriyoları gece boyunca 18 °C'de büyütün.Gece boyunca süren inkübasyonun ardından, floresan işaretli transplant dokuya sahip embriyoları ayıklamak için diseksiyon floresan mikroskobu altında çalışın. Seçilen embriyoları, 42 ila 43. evreye gelene kadar büyümeleri için tekrar 18 °C sıcaklığa yerleştirin. Hayvanlar istenen evreye ulaştığında, onları trica ile anesteziye alın, floresan diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve fotoğraflarını çekin.Nakledilen embriyolar daha sonra fikse edilebilir, kesitlenebilir ve immün boyanabilir veya ilgi duyulan bir doku için belirteçler kullanılarak in situ hibridizasyon gerçekleştirilebilir. Burada, transplantasyondan bir gün sonra floresan bir izleyici ve noggin eksprese eden donör dokuya sahip bir konak iribaşın temsilci sonuçları yer almaktadır. Dokunun iribaşın yan tarafında nasıl topaklandığına dikkat edin.Yalnızca floresan izleyici eksprese eden kontrollü donör doku alan konak embriyolar, hayvan şapkası hücrelerini yan bölgelerine dahil etmeye halihazırda başlamış durumdadır. Birkaç gün sonra, nain eksprese eden donör hücreler alan irbaşlarının yan tarafında göz benzeri yapılar oluşurken, kontrol donör dokusu alan irbaşlarının deri yüzeyinde floresan hücreler görülür. Size, Xenopus laevis'te hayvan şapkası transplantasyon denemesinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk.Bu analizi yaparken, embriyoların siz onlara ulaşamadan daha hızlı gelişmemeleri için o günkü prosedür öncesinde her şeyin hazır olduğundan emin olmak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Xenopus laevis hücre kaderinin şartname ve primer hücre kültüründe bireyin retina hücrelerinin fizyolojik fonksiyonu eğitim için ideal bir model sistem sağlar. Burada retina dokuları diseksiyon ve kalsiyum etkinliği için görüntülü ve in situ hibridizasyon ile analiz edilir primer hücre kültürlerinde üretmek için bir yöntem mevcut.

Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

Xenopus arasında yüz doku "Extreme Anterior Etki" nakli için bir tekniktir embriyolar geliştirilmiştir laevis'den. Doku kraniofasial gelişimi için ve yüz bölgeleri arasındaki etkileşimleri sinyalizasyon için yerel gereksinimleri çalışma izin, başka içine bir gen ekspresyon kökenli taşınmış olabilir.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

El yazması burada Xenopus floresan levhası 'ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

Xenopus embriyolarında, blastocoel'in çatısından alınan hücreler pluripotenttir ve çeşitli dokular oluşturmak üzere programlanabilir. Burada, erken nöral gelişimin temel in vivo ve in vitro özelliklerini araştırmak için bir test sistemi olarak amfibi blastocoel çatı eksplantlarını kullanma protokollerini açıklıyoruz.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Yetkin ektodermde bir yanıtı indükleyebilen genlerin ekspresyon klonlaması için bir Xenopus oosit ve hayvan başlığı sistemini tanımlıyoruz ve bu tür genlerin sonraki analizi için teknikleri tartışıyoruz. Bu sistem, çok çeşitli gen ürünlerinin fonksiyonel olarak tanımlanmasında faydalıdır.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Bu makalede, kesitleri üzerinde imüno-floresansı ile Xenopus embriyo, merkezi sinir sisteminde, farklı nöronal hücre popülasyonları görselleştirmek için uygun ve hızlı bir yöntem sunulur.

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Şeffaf zebra balığı embriyolarının yumurta sarısına ksenotransplantasyon için basit, hızlı bir evreleme yöntemi ile optimize edilmiş bir protokol tarif ediyoruz. Enjeksiyon sonrası analizler, akış sitometrisi ile ksenotransplante edilen hücrelerin sağkalımını ve hastalık yükünün değerlendirilmesini içerir.

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Bu, kapsamlı bir Xenopus örnekleme protokolünün birinci parçasıdır. Örnek alınan dokular kalp ventrikülü, arteriyel gövde, sol karaciğer lobu, safra kesesi, akciğer, pankreas, dalak, gırtlak, yemek borusu, mide, bağırsaklar, testisler, yağ cisimleri, yumurta kanalı, eşleştirilmiş böbrekler, siyatik pleksus, cilt, timus ve tüm gözdür.

Erişkin Xenopus'ta Erişilebilir Dokuların Kapsamlı Örneklemesi için Etkili Teknikler

Keşfedin hayvan kap nakli testi ile Xenopus laevis embriyolarında doku kaderi belirlenmesini. Bu yöntem gen ifadesinin hücre kaderini nasıl etkilediğini gösterir ve gelişim biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis

Daha fazla video keşfet