JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis

Full Text

12,673 Views

11:00 min

May 16, 2010

DOI: 10.3791/1932-v

Andrea S. Viczian¹, Michael E. Zuber¹

¹Department of Ophthalmology,SUNY Upstate Medical University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Hayvan kapaklar eksprese gen ürün (ler), gelişmekte olan kanadını nakledilen Xenopus laevis Embriyoların doku tespit olup olmadığının belirlenmesi için.

Transcript

A BT testinin genel amacı, ilgilenilen bir genin veya genlerin belirli bir hücre kaderine yönelik ilkel dermi belirleyip belirleyemeyeceğini test etmektir. Prosedür ilk olarak floresan raportör genin kodlanmasında RNA'ların ve XUS lavis embriyolarının geliştirilmesinde ilgilenilen gen veya genlerin aşırı eksprese edilmesiyle başlar. Bir sonraki adım, aşırı eksprese edilen RNA'ları ifade eden hayvan başlığını veya ilkel odum'u incelemek ve bunları 15. aşamaya kadar büyütmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, evre 15 konakçı embriyonun yan tarafındaki dokuyu çıkarmaktır. Son adım, donör hayvan kapak dokusunun yarısını konakçı embriyonun yan tarafına nakletmek ve konakçıyı evre 42 ila 43'e kadar büyütmektir. Sonuçlar, dokuya özgü belirteçler için kesitleme ve immüno boyama yoluyla göz benzeri yapılar gibi ektopik doku oluşumunu göstermektedir.

Merhaba, ben ve sinüs Upstate Tıp Üniversitesi Oftalmoloji Bölümü'ndeyim. Bugün size Mike Suber ile birlikte geliştirdiğim hayvan şapkası nakli testi adını verdiğimiz prosedürü göstereceğim. Bu testi her iki laboratuvarımızda da göz oluşumu için yeterli olan genleri incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, kapak RNA'larını enjeksiyon, transkribe noggin veya ilgilenilen başka bir gen ve izleyici olarak kullanılacak YFP için hazırlayın. Ayrıca MMR bazlı solüsyonları, sekiz x yumurtlama solüsyonu stoğunu ve embriyoları enjekte etmek için iğneleri hazırlayın.

Embriyo tutma tabakları yapmak için özel yapım bir elastomer kalıp kullanılır. Bir mikrodalgada 0,4 XMMR'de %1 AROS eriterek deney koşulu başına bir enjeksiyon plakası oluşturun. Çözeltinin yaklaşık altı mililitresini 60 milimetrelik bir plakaya aktarın.

Kabarcıkları önlemek için solüsyonun üzerine nazikçe bir elastomer kalıp yerleştirin ve yaklaşık 20 dakika soğumaya bırakın. Oda sıcaklığında, enjeksiyon plakaları için az önce gösterildiği gibi kalıplarla %1 AGROS artı 0.7 XMMR kullanarak deneysel koşul başına bir kapak izolasyon plakası oluşturun. Her zaman noktası için ekstra plakalar hazırlayın.

Zaman noktalarının hesaplanmasıyla ilgili ayrıntılar için ekteki yazılı protokole bakın. Sonra izole edin. Bunları bir erkek kurbağadan test edin ve dokuyu mililitre Gentamisin başına 50 mikrogram ile takviye edilmiş bir XMMR'lik steril bir çözelti içinde dört santigrat derecede saklayın.

Bu, deneyin başlamasından bir hafta öncesine kadar yapılabilir, ancak spermin mikroenjeksiyondan önceki gün geç saatlerde zamanla etkinliğini kaybettiğini unutmayın. Dişilere 500 ünite insan koryonik gonadotropin enjekte edin. Dişileri gece boyunca 16 ila 18 santigrat dereceye yerleştirin.

Artık ertesi gün mikroenjeksiyon için her şey hazırdır. Hormonal olarak indüklenen dişileri çıkararak başlayın ve bunları bir XEL içeren ayrı tanklara yerleştirin. Ucunu keserek iğneyi mikroenjeksiyon için hazırlayın.

25 ila 35 mikrometre çap elde etmek için, iğneyi PLI 100 pico enjektörüne yerleştirin ve enjeksiyon başına 10 nanolitre dağıtacak şekilde kalibre edin. Bir inkübatörü 14 santigrat dereceye ayarlayın ve RNA enjekte ettikten sonra bu düşük sıcaklığa çıkın, embriyonun gelişimi yavaşlar ve döllenmeden yaklaşık bir saat önce bir deneyde çok daha fazla nakil yapılabilir, yumurtaları tanktan çıkarın. Dişiler bir saat daha yumurtladıktan sonra, yeni bırakılan yumurtaları tanktan çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın.

ELS çözeltisinde iki saatten uzun süredir bulunan yumurtaları kullanmamanız gerektiğini unutmayın. Yumurtaların kalitesi düştüğü için yumurtaları 60 milimetrelik petro tabaklarına yerleştirin. Yemeğin yaklaşık% 80'i tek bir yumurta tabakasıyla doludur.

Yumurtalardan mümkün olduğunca çok ELS çıkarın ve bir XMMR ile değiştirin. Yumurtalar bir XMMR'de bir saate kadar kalabilir. Daha sonra in vitro olarak yumurtaları homojenize testislerle dölleyin.

Embriyoları öğlen 11:00 ve 13:00 civarında üç ayrı parti halinde döllemek en iyisidir, böylece istenen aşamaya gelebilirler. Kapak izolasyonu için 8.5 ila dokuz ve transplantasyon için evre 15. Yumurtaları dölledikten bir saat sonra, D jöle Çözeltisi kullanarak yumurtaların üzerindeki jöle kaplamayı çıkarın Bol miktarda 0.1 XMMR ile yıkayın ve ardından döllenmiş yumurtalar iki hücre aşamasına ulaşana kadar bekleyin.

Sıralamaya başlamak için. 0.4 XMMR artı %6 F ccal ile doldurulmuş bir enjeksiyon kabı hazırlayın. Embriyolar iki hücre aşamasına ulaştığında, homojen pigmentli ve eşit şekilde pigmentli embriyoları enjeksiyon kabının kuyucuğuna bölmek için bir transfer pipeti kullanın.

Mikroenjeksiyona devam edin, önce 60 milimetrelik bir petro kabı kapağının üstüne perfil gerdirin. İki mikrolitre RNA örneğini biyofilm üzerine pipetleyin ve aspire edin. Enjeksiyon iğnesini doldurmak için pico enjektörünü kullanın.

Enjeksiyona başlamadan önce iğnenin hala 10 litre numune dağıttığını kontrol ettiğinizden emin olun. RNA, iki hücre aşaması embriyosu üzerinden her iki blastere enjekte edilir. Her biri 500 pikogram Y-F-P-R-N-A ile 20 ila 30 embriyo enjekte edin ve bir kaba yerleştirin.

Her biri 20 pikogram Nain, Y-F-P-R-N-A ile önceden karıştırılmış RNA ile 20 ila 30 embriyo daha enjekte edin ve tabağa yerleştirin. Ek olarak, FICO çözeltisini içeren başka bir enjeksiyon kabına zaman noktası başına 100 ila 200 enjekte edilmemiş embriyo yerleştirin. Bu embriyoları, enjekte edilen embriyolarla aynı anda inkübatörün içine ve dışına taşıyın.

Bunlar, enjeksiyondan sonra kapakların nakli için kullanılacak konakçılardır. Tüm embriyoları gece boyunca 14 santigrat derecede inkübe edin. Planlanan tüm zaman noktaları için tekrarlayın.

Gece boyunca kuluçkaya yatırıldıktan sonra hayvan kapağı izole edilebilir. Embriyoları evrelemek için sabah erkenden gelin. Enjekte edilmemiş konakçı embriyoları da inkübatörden çıkarmayı unutmayın.

En erken zaman noktası dokuzuncu aşamada olmalıdır. İlk olarak, hayatta kalamayan embriyoları çıkarın. Hayvan kapaklarını canlı embriyolardan izole etmeye devam edin, her bir zaman noktası gruplar halinde bir kapak izolasyon kabına çalışın.

Bol miktarda 0.7 XMMR artı gentamisin çözeltisi ekleyin. Daha sonra enjekte edilen embriyoları içeren her plakadan fol solüsyonunu dökün ve 0.7 XMMR artı Gentamisin solüsyonunu geri ekleyin. Bir transfer pipeti kullanarak embriyoları enjeksiyon kabı kuyularından çıkarın ve taze hazırlanmış kapak izolasyon kabına yerleştirin.

Hayvan kapaklarını 0.7 XMMR artı Gentamisin solüsyonunda izole etmek için 400 mikrometreye kadar bükülmüş sarı bir uç veya bir çift keskin beş numaralı forseps ile donatılmış gastro master kullanın. Evreleme için iki veya üç sağlam embriyo tutun. Hayvan kapaklarını izole ettikten sonra, kapakların konakçı embriyoların yan tarafına nakledildiği ertesi güne kadar konakçı embriyolarla birlikte 14 santigrat derece inkübatöre geri koyun.

Kapakları çıkarın ve embriyoları 14 santigrat derece inkübatörden ilk zaman noktasından çıkarın ve embriyoları tek tip floresan pozitif kapaklar için sıralayın. Kapak sayısını sayın ve çıkarın. 0.7 XMMR artı keskin beş numaralı forsepsli Gentamisin çözeltisi ile taze hazırlanmış bir enjeksiyon kabına konakçı embriyo sayısını ikiye katlayın.

Her konakçı embriyodan Lene zarını çıkarın. Bunları kapaklarla birlikte plakaya aktarın, ancak lene zarları olmadan dikkatli olun. Embriyolar, en yüksek ayarda 200 ila 250 mikrometre bükülmüş tel ile sarı bir uç ile donatılmış gastro master kullanarak veya beş numaralı forseps kullanarak su yüzeyinde hızla ayrışabilir.

14 ila 15. aşamada embriyonun yan tarafındaki 200 mikrometrelik bir kareyi çıkarın. Sonra tekrar gastro master veya beş numaralı forseps kullanarak. Bir kapağı ikiye bölün ve dokuyu konakçı embriyoda açılan deliğe yerleştirin.

İyileşmeyi sağlamak için embriyoyu kuyuya doğru döndürün. Bunu, 15. aşamadayken mümkün olduğunca çok sayıda embriyo için yapın. Tüm zaman noktaları için tekrarlayın.

Embriyo genellikle 30 dakika içinde iyileşir. Ve beş numaralı forseps ile hafif fırçalama hareketiyle beyaz görünen ölü hücreleri çıkarın. Nakledilen embriyoları gece boyunca 18 santigrat derecede büyütün.

Gece boyunca inkübasyondan sonra, floresan olarak işaretlenmiş nakledilen doku ile embriyoları sıralamak için diseksiyon floresan mikroskobu altında çalışın. Seçilen embriyoları 42 ila 43. aşamaya kadar büyümek için 18 santigrat dereceye geri koyun. Hayvanlar istenilen aşamaya geldiklerinde trica içinde uyuşturun ve floresan diseksiyon mikroskobu altında muayene edin ve fotoğraf çekin.

Nakledilen embriyolar daha sonra sabitlenebilir, kesitlere ayrılabilir ve immüno boyanabilir veya ilgilenilen bir doku için belirteçler kullanılarak in situ hibridizasyon gerçekleştirilebilir. İşte transplantasyondan bir gün sonra floresan izleyici ve noggin eksprese eden donör dokusu olan bir konakçı kurbağa yavrusunun temsili sonuçları. Dokunun kurbağa yavrusunun yanında nasıl toplandığına dikkat edin.

Sadece floresan izleyiciyi eksprese eden kontrollü donör dokusu alan konakçı embriyolar, hayvan kapak hücrelerini yanlarına dahil etmeye başlar. Birkaç gün sonra, nain eksprese eden donör hücreleri alan kurbağa yavruları, yanlarında göz benzeri yapılar oluştururken, kontrol donör dokusunu alan kurbağa yavrularının derilerinin yüzeyinde floresan hücreler bulunur. Size Zaps Lavis'te hayvan şapkası nakli testini nasıl yapacağınızı gösterdik.

Bu tahlil yapılırken. O günkü işlemden önce her şeyin hazır olduğunu hatırlamak önemlidir, böylece embriyolar onlara ulaşabileceğinizden daha hızlı gelişmez. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

Explore More Videos

Gelişimsel Biyoloji Sayı 39 kurbağa transplantasyon hayvan kap eksplant ektoderm Xenopus laevis noggin hücre kaderi kararlılık