Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Bu protokol, video görüntüleme için bir kamera ile donatılmış bir icon bio station CT inkübatöründe toplanan hızlandırılmış videoları analiz ederek insan embriyonik kök hücre koloni büyümesini ölçmek için video biyoinformatik yöntemini gösterir. İnsan embriyonik kök hücre veya HESC kolonileri% 70 co akıcılığına kadar kültürlenir, yeniden kaplanır ve 48 saat boyunca inkübe edilir, daha sonra HESC kolonileri Biot ct'de 48 saat daha filme alınır. Büyüme hızı, CL quant yazılımı ile geliştirilen segmentasyon geliştirme ve ölçüm reçeteleri kullanılarak belirlenir.

Tarifler, her koloniye hassas manuel maske takılmasını sağlayan bir görüntü analiz aracı olan Adobe Photoshop ile karşılaştırılarak doğrulanmıştır. Gelişmekte olan video biyoinformatik alanı, mikroskobik videolardan biyolojik verilerin işlenmesini, analizini ve madenciliğini otomatikleştirmek için kullanılabilir. Merhaba, ben California Riverside Üniversitesi Hücre Biyolojisi ve Sinirbilim Bölümü'nde Dr.Prou Talbot'un laboratuvarından Serena Lin.

Merhaba, ben Sean Fino, aynı zamanda Talbot Lab'den. Merhaba, ben Hücre Moleküler ve Gelişimsel Biyoloji Yüksek Lisans Programından TI Satish. Bugün size video biyoinformatik araçlarını kullanarak insan embriyonik kök hücre koloni büyümesini nasıl ölçeceğinizi göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, çevresel toksik maddelerin insan embriyonik kök hücre davranışı üzerindeki etkilerini ölçmek için bu prosedürü kullanıyoruz. Bu prosedürü yeni kök hücre çekirdek tesisimizde göstereceğiz. Öyleyse başlayalım.

HESC'yi video analizi için hazırlamak için, HESC'yi matrigel kaplı altı kuyucuklu plakada, HESC içeren bir oyuktan% 70 birleşik aspirat ortamı olana kadar büyütün ve bir mililitre PBS ile iki kez durulayın. Bir mililitre Accutane ekleyin ve% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede bir dakika inkübe edin. Daha sonra, kuyuya 10 ila 12 cam boncuk ekleyin ve koloniler tamamen ayrılana kadar plakayı hafifçe sallayın.

Accutane'ı bir mililitre insan embriyonik kök hücre bakımı, orta veya fare embriyonik fibroblastları şartlandırılmış ortam kullanarak nötralize edin. Boncuklar olmadan ayrılmış hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve üç dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. SUP natantını boşaltın ve peleti 500 mikrolitre taze insan embriyonik kök hücre bakım ortamı veya M-T-E-S-R plakası ile 100 mikrolitre HESC süspansiyonu ile 12 kuyulu matrigel kaplı bir plakanın birden fazla kuyucuğuna damla damla kırın.

Plakayı nazikçe ileri geri sallayın ve hücre kümelerinin kuyucuklar boyunca eşit olarak dağılmasını sağlamak için kültürleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Hücrelerin düz ve kolayca görüntülenebilecek kadar büyük olduğundan emin olmak için plakayı 48 saat boyunca 37 derece ve %5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin. 48 saat sonra, ortamı aspire edin ve bağlanmamış hücreleri çıkarmak için kuyuları 500 mikrolitre PBS ile yıkayın, ardından her birine 500 mikrolitre M-T-E-S-R ortamı ekleyin.

Hemen plakayı Biot CT'ye yerleştirin ve hızlandırılmış görüntüleri toplamaya başlayın. Diğer kolonilere dönüşme olasılığı düşük olan gizli tek kolonilere sahip alanları seçmeye çalışın. Bu protokolde, hücreler yedi dakikalık aralıklarla karelerle 48 saat daha video kaydedilir.

Önce segmentasyon tarifini oluşturmak için, kayıt süresi boyunca odaklanmış kalan tek bir koloni içerdiğini doğrulamak için videonun tamamını manuel olarak tarayın. Bundan sonra, CL quants yazılımında segmentasyon sihirbazını açın ve ileri düğmesine tıklayın. Doğru görüntü kanalını seçin ve ileri düğmesine tıklayın.

Yumuşak eşleştirmeyi seçin ve İleri'ye tıklayın. Dış kenarı koloninin merkezi alanına daire içine alarak bir veya iki istenen bölgeyi seçin. Bu alan mümkün olduğunca küçük olmalı, ancak tüm koloniyi temsil etmelidir.

Yanlış bir maske uygulamasına neden olabileceğinden çok fazla bölge seçmeyin. İleri düğmesine tıklayın. Koloninin ve arka planın bir parçası olmayan bölgeleri daire içine alarak Bölgeler istemiyorum'u seçin.

Bu bölgeler, enkaz ve ölü hücreler gibi bastırılması gereken desenlere sahiptir. Sonrakine tıkla. Koloni, enkaz veya ölü hücre olmayan bölgeleri daire içine alarak arka planı seçin.

Arka plan tek tip olmalı ve her karede görünme olasılığı yüksek olmalıdır. Tipik olarak, koloninin etrafındaki gri arka planı seçeriz. İleri düğmesine tıklayın.

Maske ilgilenilen bölgeyi doğru bir şekilde kaplamıyorsa, ilgilenilen bölgenin üzerinde renkli bir maske gösterilmelidir. Ekranın sağ alt köşesindeki segmentasyon eşiği aralığı, maske değişikliği gerekiyorsa artırılabilir veya azaltılabilir. Geçici eşleştirme bölgelerini güncelleştirir'i seçin.

Bu, istemek, istememek veya arka plan alanlarının değiştirilmesine izin verir. Maske tatmin ediciyse, eşiği uygula'yı seçin ve maskemi kaydet'i seçin. Ardından ileri düğmesine tıklayın.

Maske daha sonra farklı bir renkte görüntülenecektir. Son'u seçin. Tarif, yazılımın sağ üst köşesinde segmentasyon tarifi olarak görüntülenmelidir.

İsterseniz sağ tıklayıp yeni bir ad girerek tarifi yeniden adlandırın. Tarifi uygulamak için. Sağ tıklayın ve fareyi üzerine getirin.

Tarifi uygulayın. Kullanılacak kare sayısının seçilmesine izin veren bir menü görünecektir. Maskenin aslına uygunluğunu sağlamak için kare aralığını her 20 kareye ayarlayın.

Döküntülerdeki istenmeyen bölgeleri ortadan kaldıran bir iyileştirme tarifi oluşturmak için maskenin uygulandığı çerçevelerin %10'unu rastgele manuel olarak kontrol edin. Geliştirme tarifi klasörüne sağ tıklayın ve ardından yeni'ye tıklayın. Orijinal görüş alanından yeni bir geliştirme tarifi görüntülenmelidir.

Görüntünün sağında bulunan geçiş geliştirme modülü düğmesini belirlemek için fareyi araç çubuğundaki simgelerin üzerine getirin ve üzerine tıklayın. Etiketleme açılır menüsünü seçin. Bağlı için etiketlemeyi seçin, bağlı ikisi için etiketlemeyi seçin.

Yeni bir görev çubuğu görüntülenmelidir. Segmentasyon tarifinden ilk maskeyi alın ve giriş kutusuna sürükleyin. Çubuk şimdi giriş maskesi numarasını göstermelidir.

Giriş maskesi numarasının bulunduğu simgeyi maske sıfır simgesine sürükleyin. Görev çubuğunda minimum boyutu bulun ve yalnızca ilgilenilen bölge görüntülenene kadar sayıyı ayarlayın. Her montaj denemesi için yürüt düğmesine tıkladığınızdan emin olun.

Minimum boyut ayarı tatmin edici olduğunda, ekranın altındaki önceki geliştirme tarifine tıklayın, tarife kaydet'i seçin. Yazılım şimdi seçilen tarifin üzerine yazmayı ve evet noktasını seçmeyi ister. Nokta kontrol segmentasyonu ile aynı prosedürü kullanarak geliştirme tarifini kontrol edin.

Segmentasyon ve geliştirme tariflerinden memnunsanız, ölçüm şablonunu oluşturmaya devam edin. Seçmeye başlamak için sağdaki araç çubuğunda ölçüm şablonu oluşturun. Ölçüm penceresinde, imleci küçük resim hücre şeklinin üzerine getir'i seçin.

Kontrol tuşunu basılı tutun ve morfoloji bölümünün altındaki hücreyi seçin, varsayılan parametrenin işaretini kaldırın ve alan parametresini kontrol edin. Ardından şablon penceresinden çıkın. Simgeyi seçin.

Ölçüm tarifi oluşturun. Tarifi yeniden adlandırın. Şablon sekmesine gitme ve şablon seçme Sağ üst köşede, önceden oluşturulmuş ölçüm şablonunu ölçüm penceresine sürükleyip bırakın.

Ölçüm tarifi penceresinde devam etmek için evet'e tıklayın, kanal eşlemelerini seçin. Ardından tüm hücre maske eşlemelerini seçer. Ardından tüm hücre seçeneğini seçin Gelişmiş maske için, tarif sekmesi altındaki ölçüm tarifini seçin.

Ana pencerede, ölçüm tarifi penceresindeki kaydet simgesini seçin. Ardından pencereyi kapatın Sonraki kapatın ve görüş alanını yeniden açın. Tarif listesi klasörüne sağ tıklayın ve ardından yeni tıklayın, gerekli uygulama sırasına göre tarifleri tarif listesine sürükleyin, tarif listesini kilitle'yi seçin ve tarifleri Adobe Photoshop kullanarak video verileri üzerinde sırayla çalıştırın.

Aynı kolonilerin her 20. karesi analiz edildi. Adobe Photoshop'ta bir koloni görüntüsünün çerçevesini manuel olarak açın. Araç çubuğundaki sihirli değnek aracına tıklayın.

Koloni bölgesi hariç tüm alanın kaplanması için koloninin etrafındaki alana tıklayın. Koloninin etrafındaki noktalı çizginin koloninin içine değil, çevresine tam olarak oturduğundan emin olun. Noktalı çizgi çevrede değilse, üst araç çubuğundaki tolerans değerini uygun şekilde değiştirin.

Araç çubuğunda hızlı maske modunda düzenle'ye tıklayın ve koloninin seçilmesi için koloniye tıklayın. Pencereye gidin, menüyü aşağı çekin ve histogramı tıklayın. Önbellek bir olarak ayarlanmalıdır.

Önbellek iki ise, önbelleği bir olarak değiştirmek için ifade işareti ünlemini tıklayın. Piksel değerini bir elektronik tabloya kaydedin. Her 20. kare için yukarıdaki işlemi tekrarlayın.

Photoshop ve CL quant yazılımı kullanılarak toplanan veriler daha sonra birlikte çizilebilir. HESC koloni büyümesini ölçmek için protokolümüz, video biyoinformatiğinin biyolojik bir probleme bir uygulamasını göstermektedir. Burada, CL quant yazılımı ve adobe Photoshop kullanılarak belirlenen 48 saat boyunca koloni boyutundaki artışı karşılaştıran bir grafik gösteriyoruz.

Grafik, her biri her iki yazılım paketi tarafından analiz edilen beş farklı koloniyi göstermektedir. Her koloni farklı bir renkle temsil edilir. Düz çizgiler sail quant yazılımı kullanılarak türetilirken, noktalı çizgiler Photoshop kullanılarak toplandı.

Ham verilerin grafiği, her iki ölçüm yönteminin de kolonilerin farklı bir başlangıç boyutuna sahip olduğu gerçeğini hesaba katmak için iyi bir uyum içinde olduğunu göstermektedir. Bu şekil, koloni boyutundaki yüzde artış olarak yeniden çizilen verileri göstermektedir. Büyüme oranları, başlangıç koloni büyüklüğünden bağımsız olarak benzerdir ve her iki analiz ölçüsü de benzer sonuçlar verir.

Aşağıdaki grafik, HESC koloni büyümesi ile ilgili önceki yüzde değişim verilerinin ortalamalarını göstermektedir. Bu grafik, video biyoinformatiği ve Adobe Photoshop kullanılarak yapılan analiz arasında iyi bir uyum olduğunu açıkça göstermektedir. Video biyoinformatik araçlarını kullanarak insan embriyonik kök hücre koloni büyümesini nasıl ölçeceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü faz kontrast mikroskobu kullanarak yaparken, yazılım tarafından hassas koloni seçimi için koloninin etrafına halo eklediğinizden emin olun. Gösterdiğimiz protokolün yerine kültürleme, kuluçka ve video toplama için diğer yöntemlerin kullanılabileceğini hatırlamak da önemlidir. Tarifler geliştirildikten ve doğrulandıktan sonra, manuel analize göre çok daha hızlı ve daha az deneysel varyasyonla analiz yapacaklardır.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.