Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

Manyetik modülasyon BİYOSENSÖRLEME veya MMB, biyolojik moleküllerin tespiti için geliştirilmiş yeni bir tekniktir. Burada, antikor kaplı manyetik boncukların bulunduğu bir reaksiyon karışımına interleukin sekiz (IL sekiz olarak da adlandırılır) eklendiğinde, biotinize anti IL sekiz antikoru ve floresan işaretli streptavidin kullanılarak interleukin sekizin tespit edildiği bir prensip kanıtlama deneyi gösterilmektedir. Floresan molekülü manyetik boncuğa etkili bir şekilde bağlayan moleküler bir sandviç yapısı oluşturulur.

Reaksiyon, bir küvet ve alternatif manyetik alan içerisine yerleştirilir. İki elektromanyetik kutup üzerinden uygulanan gradyanlar, boncukların salınımlı bir hareket yapmasını sağlar. Boncukla bağlı floresan proteinlerin dik bir lazer ışınına periyodik olarak girip çıkması, bir PMT tarafından toplanan ve demodüle edilen bir floresan sinyali üretir.

Bir lock-in amplifikatörü kullanılarak, PMT yerine bir CCD kamera ile boncukların hareketi görselleştirilebilir; manyetik boncukların IL 8 aracılığıyla floresan proteinlere bağlandığı örneklerde senkronize hareket görülür. Merhaba, ben Tel Aviv Üniversitesi Fiziksel Elektronik Bölümü'ndeki Doğrusal Olmayan Optik ve Lazer Laboratuvarı'ndan Adia. Ben Chicago'daki Illinois Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden NoGo ve ben de Tel Aviv Üniversitesi Hücre Araştırmaları ve İmmünoloji Bölümü'nden Marcelo Erlich.

Bugün size, manyetik modülasyonlu bir biyosensör sistemi kullanarak biyolojik assaylerin hızlı ve homojen tespiti için bir yöntem göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, düşük konsantrasyonlardaki spesifik proteinleri ve DNA sekanslarını tespit etmek için kullanıyoruz. Haydi başlayalım.

Bu prosedüre, hedef örnek ve hedef dışı kontrol örneği dahil olmak üzere her reaksiyon için bir tüp hazırlayıp etiketleyerek başlayın. Her tüpe bio plex Precision Pro sitokin analizinin şu bileşenlerini sırasıyla ekleyin: kuplenmiş manyetik boncuklar, deteksiyon IL eight antikoru, streptavidin PE ve IL eight Target. Hacmi analiz tamponu ile 100 microliters'e tamamlayın, ardından kompakt bir orbital çalkalayıcıda 30 dakika boyunca çalkalayın.

Numuneler oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalandıktan sonra, analiz için doğrudan küvetlere yerleştirin. MMB sistemine ait şeffaf küvetleri lens temizleme mendili ve %70 etanol kullanarak temizleyin. Analiz için kullanılan cihaz, eksitasyon ışık kaynağı olarak kullanılan ve 562 nanometrelik bir dikroik ışın ayırıcı aracılığıyla mikroskop objektif lensine yönlendirilen 488 nanometrelik bir frekans duble lazerden oluşmaktadır.

Mikroskop objektif lensi, lazeri 400 µm genişliğinde bir BO silikat cam tüp içerisinde 27 µm'lik bir ışın beline odaklar. Yayılan ışık, birbirini izleyen iki bant geçiren filtre kullanılarak spektral olarak filtrelenir, bir fotomultipliyer veya PMT tarafından algılanır ve bir lock-in amplifikatör kullanılarak demodüle edilir. Her bir elektromıknatısa sırasıyla kare dalga iletmek için ev yapımı bir akım modülatörü kullanılır.

Boncuklar her döngüde lazer ışınına iki kez girip çıktığı için genlik 1,4 amps, frekans ise bir ila altı hertz olmalıdır. Lock-in amplifikatöründeki demodülasyon frekansı iki ila 12 hertz arasındadır. 488 nanometre lazer anahtarını açık konuma getirip gücü açarak sistemi başlatın.

Ardından lazer gücünü yaklaşık dört ila altı milliwatt olacak şekilde minimuma ayarlayın. Osiloskobu açın, ardından PMT'yi açın. Sonrasında numune küvetini iki elektromanyetik kutup arasına yerleştirin.

Lazer ışınının vete içerisinden geçtiğinden ve vete duvarlarına çarpmadığından emin olmak için vete'nin döner tablasını kullanın. Vete'nin objektif lensi ve elektromanyetik kutuplara göre konumunu değiştirmek için vete'nin XY, Z öteleme tablasını kullanın. Floresan ışığın dedektöre kuplajını optimize etmek için vete, kutup hattının biraz arkasına konumlandırılmalıdır.

Şimdi osiloskobu zaman izleme ölçümüne ayarlayın. PMT kazanç kontrolünü 0,5 volt olarak ayarlayın. Ardından akım modülatörüne güç verin ve frekansı üç hertz'e ayarlayın.

Boncukların agregasyonu ve yoğunlaşması için 30 saniye bekleyin. Manyetik boncuklar, tüpün ön kısmına doğru hareket ederek salınmaya başlayacaktır. Lazer ışını salınım yapan boncuklara çarptığında, boncuklardan yansıyan lazer ışığının titremesi görülmelidir.

Akım modülasyonu artırıldığında boncukların daha hızlı, azaltıldığında ise daha yavaş hareket ettiğine dikkat edin. Boncukların tüp içindeki konumu, mikrometre kontrollü tablalar kullanılarak ayarlanabilir. Kutupları hareket ettirmek için, PMT yerine yerleştirilen bir CCD kamera kullanılarak boncuk hareketleri görselleştirilebilir.

Osiloskop, floresan kuplü boncuklardan gelen periyodik sinyali tespit eder ve osiloskobun zaman izini kaydeder. Kaydedilen veriler MATLAB kullanılarak analiz edilebilir; IL sekiz içeren ve içermeyen reaksiyon karışımları MMB ile analiz edilmiştir. Hedefin bulunduğu tüm reaksiyonlarda, boncuklar lazer ışınına senkronize bir şekilde girip çıkan tek bir yoğun agregat oluşturmuştur.

Buna karşılık, hedef madde olmadığında boncuklar daha az kümeleşmişti ve hareketleri daha az koordineliydi. Burada, sarı ile gösterilen kutup modülasyon saati ve magenta ile gösterilen PMT çıkış sinyali, her bir kutup için iki hertz olan modülasyon frekansını betimlemektedir. Bu nedenle, demodülasyon frekansı teorik olarak beklendiği üzere dört hertz değerindedir.

Boncuklar lazer ışınının önünden geçtiğinde, PMT floresan ışığı tespit eder ve PMT sinyali ile çift modülasyon saati lock-in amplifikatöre beslendiğinde PMT çıkış voltajında bir pik oluşur. Hassas faz dedektörü, senkronizasyonu ve sonuçları yüksek voltajla sağlar. İki farklı renk, aynı hedef konsantrasyondaki iki farklı taramayı belirtmektedir.

Siyah çizgiler her bir sinyalin ortalamasını temsil etmektedir. Kontrol örneği test edildiğinde lock-in amplifikatör herhangi bir sinyal tespit etmemiştir. Bu durum için lock-in amplifikatör herhangi bir kilitli sinyal sağlamamıştır.

Bu gerçek, agregasyondaki görsel farkla birlikte, MMB sisteminin ve PMT çıkış sinyalinin zaman izleme ölçümlerindeki farkın ILH hedefini net bir şekilde tanımlayabileceğini göstermektedir. Magnetik modülasyon kullanarak biyolojik moleküllerin nasıl hızlı ve homojen bir şekilde tespit edileceğini, IL eight örneği üzerinden göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, lazer güvenlik prosedürlerine uymayı hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.