Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, ilgilendiğiniz genin veya proteinin normal ekspresyon modellerini bozarak gen protein fonksiyonunu belirlemektir. Bu, önce aros kalıbı ve enjeksiyon iğneleri yapılarak gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, tek hücre aşamasında orta embriyoların toplanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, bir hücre aşaması embriyolarının enjeksiyon için doğru pozisyonda yönlendirilmesidir. Prosedürün son adımı, hücre izleyicilerinin, mRNA'ların veya antisens oligonükleotidlerin tek hücre aşamalı midar embriyolarına enjekte edilmesidir. Sonuç olarak, enjekte edilen maddeden etkilenen protein ile ilişkili morfolojik, fizyolojik veya moleküler değişiklikleri gösteren mikroskobik gözlem yoluyla sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Bath Üniversitesi Biyoloji ve Biyokimya Bölümü'nden Dr.Makoto Fki'nin laboratuvarından Sean Brazinski. Ben de tam Seki laboratuvarından geliyorum. Bugün size Meca embriyolarının hücre izleri, mRNA'lar ve antisens oligonükleotidler ile mikroenjeksiyonu için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarımızda, ilgilenilen genin işlevini in vivo olarak tek bir hücre düzeyinde incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Zebra balığı, erkek ve dişi balıkların aksine, maka dimorfik yüzgeçleri ile kolayca ayırt edilebilir.

Dişi yüzgeçler, pürüzsüz bir kenar boşluğu olan yuvarlak bir şekle sahiptir. Erkeğin hem anal hem de sırt yüzgeçleri dişininkinden daha büyüktür ve sırt yüzgeci son iki ışın arasında derin bir çentiğe sahiptir. Eşleşen bir çift meca'yı su akışı olan veya olmayan bir çiftleşme tankında tutun.

Bu P, iki aya kadar akan su ile tankta tutulabilir Günlük enjeksiyon için, meka günde 40'a kadar yumurta bırakır ve bu yumurtalar bağlantı filamentleri ile göbekte kümelenir. Bir dişiyi yakalamak ve tanktan çıkarmak için bir ağ kullanın ve balığı ağın içine sabitlemek için bir elinizle tutun. İşaret parmağınızla yumurtaları nazikçe uzaklaştırın.

Dişiyi tanka geri koyun. Yumurtaları embriyo ortamıyla doldurulmuş altı santimetrelik bir Petri kabına aktarmak için forseps veya işaret parmağı kullanın. Diseksiyon mikroskobu altında, bağlantı filamentlerini kesmek ve yumurtaları ayırmak için iki çift forseps kullanın.

Dışkı ve alglerden ayırmak için bir makarna pipeti ile embriyoları toplayın ve en fazla 40 yumurtayı bir tabak taze embriyoya aktarın. Orta. Mikro enjeksiyon yapılıyorsa yumurtaları hemen buzun üzerine koyun. Alternatif olarak, inkübasyon sıcaklığındaki değişikliklerle geliştirme hızını daha sonraki aşamalara manipüle edin.

Enjeksiyon sırasında embriyoları tutmak için agaroz plakaları yapmak için bir pleksiglas kalıp gereklidir. Ayrıntılar için bu protokolün yazılı kısmına bakın. Dokuz santimetrelik bir Petri kabına 0,5 santimetre% 1,5 aros su dökün.

Aase katılaştığında, kalıbın dibe batmaması için kalıptan biraz daha küçük bir alan kesin. Kesilen alanı %1,5 daha fazla aaz ile oluşturun ve pleksiglas kalıbı üzerine yerleştirin. Aris katılaştığında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.

Genellikle oluklar oluşturmak için kalıbı serbest bırakın. Aris'i embriyo ortamı ile örtün. Çanağın üzerini örtün ve kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.

Cam kılcal damar içeren bir filamentten güçlü bir geniş enjeksiyon iğnesi hazırlayın. Enjeksiyon iğnesini fenol kırmızısı da dahil olmak üzere enjeksiyon solüsyonuyla doldurmak için bir mikro yükleyici kullanın İzleyici olarak, iğneyi bir hava pompası enjektör sehpasına bağlayın. Bir diseksiyon mikroskobunun yanına kurun.

Uygun aşamadaki yumurtaları arose enjeksiyon plakasına aktarın. Enjeksiyonu stereo mikroskop altında gerçekleştirirken gelişimi durdurmak için embriyolar 30 dakikaya kadar buz üzerinde tutulabilir. Her çukurda yedi ila 10 yumurtayı hizalamak için forseps kullanın.

Yumurtaları, enjeksiyon iğnesi yumurtalara dik olarak çarpacak şekilde döndürün. Embriyonun bir hücresi, göçük toprak damlacıklarının karşısındadır. Bu nedenle, yağ damlacığı, bir hücre enjeksiyon için sağda olacak şekilde sola doğru yönlendirilmelidir.

Meca'da nükleik asitler ve izleyici boyalar, Corian yoluyla yumurta sarısı yerine embriyonun sitoplazmasına mikro enjekte edilir. Zebra balığı gelince, iğneyi yumurtalara yaklaştırın. İğnenin ucunu Corian'a dokundurun veya iğne ucunu kırmak için mikro forseps kullanın, böylece enjeksiyon çözeltisinin küçük bir miktarı uçtan dışarı akar.

Tıkanma durumunda iğneyi yeniden kırın, Corian'ı delin ve iğneye geri akış olasılığını azaltmak için enjeksiyon iğnesinin ucunu iç katmanın hemen içine hareket ettirin. Enjektörün tutma basıncını keskin bir şekilde yaklaşık 80 ila 100 hektar Pascal'a ayarlayın. Zarı dürtün ve iğneyi sitoplazmaya yerleştirin.

Embriyoyu enjekte edin. Enjekte edilen materyalin sitoplazma içinde eşit dağılımını doğrulamak için embriyoyu yandan görüntüleyin. Sitoplazmaya doğru bir şekilde enjekte edilen sıvılar, yumurta sarısına çok derine enjekte edilen bulanık bir sınır materyaline sahiptir, belirgin bir sınıra sahiptir ve sitoplazmaya aktarılmayacaktır.

Enjekte edilen embriyoları temiz bir embriyo ortamı kabına aktarın ve gerektiği gibi gelişmelerine izin verin Uygun sıcaklıktaki bir inkübatörde panel A, tek hücreli bir aşama Meca embriyosunun sitoplazmasına rumin dekstranın doğru enjeksiyonunun temsili bir görüntüsünü gösterir. Panel B, rumine dex str'nin tek hücreli bir aşamanın yolk kesesine yanlış enjeksiyonunun temsili bir görüntüsünü göstermektedir. Meca embriyosu noktalı çizgiler, bir hücrenin sitoplazmasının ana hatlarını gösterir.

Panel C ve D, enjeksiyondan yaklaşık 30 saat sonra sırasıyla A ve B panellerinden embriyoları gösterir. Panel D'deki embriyonun gövdesinin kırmızı olmadığına dikkat edin, çünkü boya yumurta sarısı torbasına yanlış bir şekilde enjekte edilmiştir. Az önce size nükleik asitleri veya izleyicileri daha koyu embriyoların tek hücre aşamasına nasıl mikro enjekte edeceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, başarılı bir enjeksiyon için doğru şekilde evrelenmiş embriyoya sahip olmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.