Name: En yüze Subventricular Bölge: Wholemount Boyama ve ependim Akış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T16:22:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Keşfedin, yetişkin memeli beynindeki subventriküler bölgede nörogenezisi incelemek için lateral ventrikül duvarlarının wholemount preparasyonu ve ependim akışı analizi yöntemini. Bu teknik, sinir kök hücre davranışlarına dair yeni bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH hibe HD-32.116, Sandler Aile Vakfı, John Bowes Kök Hücre Fonu, MEXT, MHLW ve HFSP Yardımcı tarafından desteklenen çalışın. ZM Carlos Baldoceda Vakfı ve UCSF Krevans Bursu tarafından desteklenmektedir. AA-B. Heather ve Melanie donatılmış Başkanı Muss tutar.

<ol><li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14895-14900 (1996).</li>
<li>Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+organize+ependymal+planar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cilia organize ependymal planar polarity.</a> J Neurosci. 30, 2600-2610 (2010).</li>
<li>Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+germinal+layer+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 11619-11624 (1999).</li>
<li>Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain.</a> Science. 311, 629-632 (2006).</li>
<li>Coskun, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+neural+stem+cells+in+the+ependyma+of+mammalian+postnatal+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">CD133+ neural stem cells in the ependyma of mammalian postnatal forebrain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 1026-1031 (2008).</li>
<li>Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+organization+of+neural+stem+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain.</a> Science. 317, 381-384 (2007).</li>
<li>Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+stem+cells+are+heterogeneous+with+respect+to+their+embryonic+origins+and+neurogenic+fates+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb.</a> J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).</li>
<li>Waclaw, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+finger+transcription+factor+Sp8+regulates+the+generation+and+diversity+of+olfactory+bulb+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The zinc finger transcription factor Sp8 regulates the generation and diversity of olfactory bulb interneurons.</a> Neuron. 49, 503-516 (2006).</li>
<li>Kohwi, M., Osumi, N., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+is+required+for+making+specific+subpopulations+of+granule+and+periglomerular+neurons+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6 is required for making specific subpopulations of granule and periglomerular neurons in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 25, 6997-7003 (2005).</li>
<li>Kohwi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+olfactory+bulb+GABAergic+interneurons+is+derived+from+Emx1-+and+Dlx5%2F6-expressing+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors.</a> J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).</li>
<li>Hack, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+fate+determinants+of+adult+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal fate determinants of adult olfactory bulb neurogenesis.</a> Nat Neurosci. , (2005).</li>
<li>Ventura, R. E., Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+radial+glia+generate+olfactory+bulb+interneurons+in+the+postnatal+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain.</a> J Neurosci. 27, 4297-4302 (2007).</li>
<li>Kelsch, W., Mosley, C. P., Lin, C. W., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mammalian+precursors+are+committed+to+generate+neurons+with+defined+dendritic+projection+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct mammalian precursors are committed to generate neurons with defined dendritic projection patterns.</a> PLoS Biol. 5, e300(2007).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+centrosome+inheritance+maintains+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors.</a> Nature. 461, 947-955 (2009).</li>
</ol>

Ventrikül ve subventricular bölgelerde nöron çalışmaların çoğu bu bölgelerde mikroanatomisinin ve hücresel ilişkileri incelemek için klasik kesit alma teknikleri dayanıyordu. Burada sonra anti-mitotik tedavi 6 ve en son kesin apikal çalışma için kullanılan aşağıdaki SVZ progenitör nüfusun yenilenme incelemek için kullanılan ilk SVZ 1 neuroblasts göçmen zincirleri ağ analiz etmek için kullanılan alternatif bir yöntemdir, tarif ve yetişkin SVZ sinir kök hücreleri 2,3,4 bazal hücre-hücre etkileşimleri. İlginçtir ki, bu tekniğin yetişkin SVZ sinir kök hücreleri, ya da tip B1 hücreleri, farklılaştırılmış olmayan bölünmesi ependimal hücreler ile karışık bir neuroepithelium parçası olduğunu ortaya koymuştur. En yüze görüntüleme wholemounts kullanarak bu karışık neuroepithelium ependimal hücreler 4 büyük apikal yüzeyleri ile çevrili tip B1 hücrelerinin apikal sonlar oluşan fırıldak mimarisi olduğunu göstermiştir. Bu tr-yüz analizi hücreleri vasküler bir niş iletişime ventrikül yüzeyinde apikal sonlar ve bazal süreçleri ile oluşan embriyonik ve yetişkin beyinlerinde sinir kök hücrelerinin köken anlayışımıza açıklık vardır. Bu bulgular klasik kesit alma teknikleri kullanarak, neredeyse imkansız olurdu. Wholemounts da ventrikül temas apikal süreci ile nöral kök hücrelerin belirlenmesini kolaylaştıracaktır. Bu kök hücreler için daha spesifik belirteçler olarak, wholemounts sinir kök hücre davranışının belirlenmesi ve analiz ayrılmaz bir parçası olacaktır. Lateral ventrikül duvarları Wholemounts ependimal hücreler düzlemsel polarite çalışmak için ideal bir perspektif sağlamaktadır. Ependimal hücreler koordineli bir şekilde BOS itmek işlevi ventriküller astar multiciliated hücrelerdir. Wholemount tekniği ile, tüm ependim epiteli en-face maruz kalmaktadır ve posterior ve dorsal ventral sınırları boyanmış ve onun anterior kapsamlı incelenebilir. Ayrıca, ependim akış testleri akut disseke, canlı wholemounts sağlam ependim kirpikler tarafından oluşturulan düzlemsel polarize akış göstermektedir. Son çalışmalar wholemount yaklaşımları kullanarak bu ependim düzlemsel polarite 5 hücresel belirleyicileri ortaya çıkardı. İlginçtir ki, wholemount çalışmalar da ependim oluşturulan BOS akım SVZ 7 genç nöronların göç kılavuzu chemorepellents gradyanlar kurar düşündürmektedir. Bu nedenle başlangıçta göçmen nöron zincirleri ağ tespit Wholemount yaklaşımlar zinciri göç düzenleyen mekanizmalar açılımlar sağlamaya devam etmektedir. Wholemount görüntüleme VZ ve SVZ Analizi, hem de gelecekteki çalışmaları ve mevcut çalışmaları anlayışımız açıklığa kavuşturmak için bir yol için yeni bir yaklaşım ekliyor. Örneğin, yeni bir çalışmada, yetişkin SVZ nöral kök hücreler ventrikül 8 ile temas CD133 + / CD24-hücreler olduğunu düşündürmektedir . Bölümlerde kendi immün dayanarak, bu yazarların bu hücrelerin bir ICSI&#39;nin multiciliated ependimal hücreler olduğunu iddia etti. Ancak, bizim çalışmamızda tüm ependim epitel daha kapsamlı bir görünüm verir wholemount yaklaşım kullanarak, bulduğu tüm ependimal hücreler ifade CD24 ve tek ventrikül temas B1 tipi bir alt kümesi + / CD24-CD133 hücrelerin hücreleri 4. Ayrıca, wholemount teknikle, yetişkin beyin 9 sinir kök hücrelerinin son açıklanan mozaik organizasyon inceleyerek gelecekteki çalışmalarda faydalı olmayı vaat ediyor . Çeşitli çalışmalar, yetişkin bir insanın beyninin nöral kök hücreler homojen bir nüfus olduğunu göstermiştir, fakat bölgesel belirtilen ve normal koku alma ampul internöronlar yalnızca belirli alt tipleri üretmek. Bu çalışmalar, nöral kök hücrelerin farklı alt popülasyonlar özel transkripsiyon faktörleri 10,11,12,13,14 ve / veya dorsal-ventral ve ön-arka kapsamlarını boyunca bölgesel localisation ifade ayırt edilebilir olduğunu önerdi lateral duvar 9,15,16. Yetişkin nöral kök hücrelerin bölgesel belirtilen alt popülasyonlar daha moleküler belirteçlerin tespit olarak, wholemount görüntüleme ventrikül duvar boyunca bu farklı progenitör etki bölümlenmesi kapsamlı bir bakış vermelidir. Burada sunulan wholemount diseksiyon ve görüntüleme teknikleri de ventriküler duvarları embriyo analiz etmek için kullanılıyor olabilir. Embriyonik lateral duvar diseksiyonu, adım-adım, aynı şekilde yapılır. Zorluk seviyesinde sadece ufak farklar vardır; embriyonik ventriküller diseksiyonu kolaylaştırır görece daha büyük, ancak doku manipülasyonu daha zor hale yumuşaktır. Özellikle lateral ventrikül benzer bir poz Embry kullanılabiliros kortikal kortikal nöron çalışmada ventrikül duvar incelemek. Son kanıtlar, bu asimetrik centrosome miras kortikal nöron 17 sırasında ventrikül yüzeyinde radyal glia korur göstermektedir . En yüze radyal glial apikal yüzeyleri görüntüleme bu bölünen hücreleri içinde centrosomes asimetrik miras nasıl içgörüler sağlayabilir. Özellikle en hassas becerisi içeren bu teknikleri, olduğu gibi, ustalık pratik gerektirir. Ancak, daha iyi sonuçlar için anahtar diseksiyonu birkaç elemanları vardır: 1) aydınlatma gölgeler oluşturmak için örnek aydınlatma ayarlama gibi forseps kullanarak), aksi takdirde 2 nispeten homojen doku diseksiyonu sırasında paha biçilmez bir kontrast sağlar birlikte çimdik veya doku almak için kullanılan bu tekniğin iki böcek pimleri forseps asla, ama manevra pimleri dokuyu stabilize etmek için sürekli yeniden olabilir), nazik retraksiyon bir denge 3 kesme ve kesme bıçak olmamalıdır olarak kullanılır sadece kesmek için değil, aynı zamanda bu diseksiyon çoğunluğu aslında sadece aralıklı kesme nazik retraksiyonu ile gerçekleştirilir olduğunu hatırlayarak, medial ve lateral duvarlar ayrı nazik retraksiyon sağlamak için kullanılır.

en yüze subventricular bölge: wholemount boyama ve ependim akış

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

Lateral ventriküllerin duvarları en büyük yetişkin memelilerin beyin germinal bölge içerir. Bu duvarlar subventricular bölgesi (SVZ), davranış ve sinir kök hücrelerinin, yetişkin nöron düzenlenmesi anlamak için yoğun çalışılan bir model sistem. Geleneksel olarak, bu çalışmalar, histolojik analizi için klasik kesit teknikleri konusunda yararlanmıştır. Burada, bu germinal bölgenin kapsamlı, en-yüz görünümü sağlar wholemount tekniği, alternatif bir yaklaşım sunuyoruz. Bölümlerini, wholemounts SVZ içinde, tam hücre mimarisini ve hücresel ilişkileri korumak. Bu yaklaşım son zamanlarda yetişkin sinir kök hücreleri, ya da tip B1 hücreleri, lateral ventriküller astar farklılaştırılmış ependim hücreleri ile karışık bir neuroepithelium parçası olduğunu ortaya koymuştur. Buna ek olarak, bu yaklaşım ventrikül üreten ependim hücreleri ve beyin omurilik sıvısı akış düzlemsel kutuplaşma incelemek için kullanılır olmuştur. Yetişkin sinir kök hücrelerinin bölgesel belirtilen heterojen bir nüfus olduğunu son kanıtlar, wholemount yaklaşım muhtemelen bu kök hücre nişinin organizasyon ve Parselasyon anlamak için önemli bir araç olacaktır.

Lateral ventrikül duvarları en büyük yetişkin memelilerin beyin germinal bölge içerir. Geleneksel olarak, bu bölgedeki nöron çalışmaları klasik histolojik analiz için kesit alma teknikleri dayanıyordu. Burada, bu germinal bölgenin kapsamlı, en-yüz görünümü sağlar wholemount tekniği, alternatif bir yaklaşım sunuyoruz.

En yüze Subventricular Bölge: Wholemount Boyama ve ependim Akış

Lateral ventriküllerin duvarları, yetişkin memeli beynindeki en büyük germinal bölgeyi içerir. Bu duvarlarda bulunan subventriküler zon (SVZ), bir ...

Merhaba, ben Zaman. Yanımda Arturo Alvarez var. Bugün, Nöroşirürji Bölümü ile Eli Edith Broad Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırmaları Merkezi'nin bir parçası olan Arturo'nun laboratuvarındayız ve size lateral ventrikül duvarlarının tüm montajlarının (whole mount) nasıl hazırlandığını göstereceğiz.Bu bütün monte örnekler, ya immün boyama için fikse edilmiş olarak ya da penal akışı analiz etmek için canlı preparatlar şeklinde kullanılabilir. Mann'in bugün size göstereceği bütün monte tekniği, laboratuvarda yıllar içinde geliştirilmiş ve penal hücreler ile nöral kök hücrelerin bulunduğu subventriküler bölgedeki alttaki germinal aktivite dahil olmak üzere, lateral ventrikülün tüm duvarını incelemek için mükemmelleştirilmiştir. Bu teknik başlangıçta Fiona Dutch tarafından geliştirilmiş, ardından HIE Victor ve Casu Moto tarafından mükemmelleştirilmiştir.Bunların hiçbiri artık laboratuvarda değildir. Aşağıdaki diyagramlar, lateral ventrikülün lateral duvarının tam preparatının nasıl hazırlanacağını göstermektedir. Beyin öncelikle iki hemisfer olarak ikiye ayrılır.Hippocampus'u ve burada mor renkle gösterilen enine kesiti açığa çıkarmak için posteriordan koronal bir kesi yapılır. Ardından, hippocampus'u örten ve mor renkle gösterilen medial duvar, stray aum'u örten ve pembe renkle gösterilen lateral duvardan soyularak ayrılır. İki duvar, bir kitap açılıyormuş gibi birbirinden uzaklaştırılır ve lateral duvar açıkta kalacak şekilde medial duvar kesilerek uzaklaştırılır.Bu videonun ilk bölümü bütün monte diseksiyona odaklanmaktadır, ancak bu ilk adım olmayabilir. Kronolojik olarak, eğer planlar bir penal akış analizini içeriyorsa, lütfen ayrıntılar için yazılı protokole başvurun. Her diseksiyondan önce, tüm aletlerin steril olduğundan ve elinizin altında olduğundan emin olun. 37 °C sıcaklıkta L 15 leitz medyum içeren altı santimetrelik bir diseksiyon kabını floresan bir diseksiyon stereo mikroskobunun altına yerleştirin ve taze diseke edilmiş bir fare beynini stereo mikroskop altındaki kaba koyun.Olfactory bulb'ları ayırmak için ince pens kullanın. Beyni iki hemisferine ayırmak için bir stab bıçağı kullanın. Hemisferlerden birinin posterior ucundan koronal kesi yapın.Kordal hipokampusu ve kesitini açığa çıkarmak için, korteks ile hipokampus arasındaki küçük ventriküler boşluğa saplama bıçağını yerleştirin ve korteksin dorsal olarak hipokampusa bağlandığı yeri serbest bırakmak için kesin. Köşeden kama şeklinde bir korteks parçasını kesin ve ince pens yardımıyla korteksi yavaşça hipokampustan soyun. Korteks hipokampusun ventral kenarına doğru sarılmaya devam ettikçe soyma işlemine devam edin.Hipokampüsü korteksin ventral kısımlarından ayırmak için bir bistüri kullanın. Hipokampüsü korteksten uzaklaştırmak için bistüri ve ince pens kullanın. Ventrikül duvarlarına zarar vermeden dikkatli bir şekilde anteriora doğru ilerleyin.İki duvar birbirinden uzağa doğru açılmalıdır. Bir kitap gibi, bıçakla lateral duvarın üzerine sarkan korteks kısımlarını kesin. Retraksiyon direnci arttıkça bu yüzeyi daha iyi görselleştirmek için iki ek kesi yapılması gerekecektir.Bir kesi dorsalde medial ve lateral duvarların birleştiği yere, benzer bir kesi ise ventral bölgeye yapılır. Bu kesileri yapmak için bistürinin ucuyla küçük darbeler kullanın. Bu ek kesiler, ventrikülün anterior kısmını açığa çıkarmak için medial duvarın daha fazla geri çekilmesine olanak tanır.Gölgeler medial ve lateral duvarlar arasındaki birleşme noktasını, iki duvar arasında bir vadi gibi ortaya çıkaracak şekilde aydınlatmayı ayarlayın. Tam olarak bu vadiden kesmek için bıçağı kullanın, talamusu ve sarkan korteks kısımlarını uzaklaştırın.Delikli montaj, penal akış analizi için hemen kullanılmalıdır. İmmün boyama için delikli montajların diseksiyonu yapılacaksa, tamamlandıkça tespit çözeltisine daldırılmak kaydıyla birçok delikli montaj tek bir seansta diseke edilebilir. Videonun bir sonraki bölümü, ependimal hücre sillerinin oluşturduğu sıvı akış analizlerinin nasıl gerçekleştirileceğini gösterecektir.Floresan mikroboncukların kullanımı. Taze diseke edilmiş lateral duvar deliği eriyiği, öncelikle iki adet böcek iğnesi ile diseksiyon kabına sabitlenir. Ardından, floresan mikroboncuklarla doldurulmuş bir cam mikro pipetin ucu, bütün montajın yüzeyine indirilir ve zaman atlamalı görüntüleme sırasında floresan boncuklar yüzeye nazikçe bırakılır.Video, append akış analizi için boncukların hareketini kaydeder. Bu protokolün yazılı kısmında açıklandığı üzere, bütün montaj diseksiyonundan önce bir cam mikro pipet hazırlanmalıdır. Tamamlanmış pipet, pürüzsüz, sığ bir konikliğe ve yaklaşık 100 micrometers iç çaplı 45 derecelik bir eğime sahip olmalıdır.Mineral yağı bulunan pipeti, kılcal hareketle yaklaşık yarıya kadar doldurun. Pipetin arka kısmına vakum gresi sürülmüş bir piston yerleştirin. Ardından, yağın menisküsünü pipet ucuna kadar ilerletmek için pistonu içeri itin.Pistonlu pipeti, ayarlanabilir bir kol üzerindeki mikro manipülatöre sabitleyin. Pipeti ön taraftan %50 floresan mikroboncuk, %5% gliserol ve %45 su içeren bir solüsyonla doldurun. Daha önce gösterildiği gibi taze bir delikli montaj (hole mount) hazırlayın ve bunu ventrikül tarafı yukarı gelecek şekilde 37 degrees Celsius ile doldurulmuş temiz bir disseksiyon kabına aktarın.Leitz ortamı içerisinde, talamus ve anterior dorsal kortekse iki adet böcek iğnesi yerleştirerek tüm düzeneği diseksiyon kabına sabitleyin. Mikro manipülatörü tutan sabit kolun tabanını stereo mikroskobun yanına yerleştirin ve mikropipet iğnesinin kırılmasını önlemek için kolu yukarıda tutun. Mikropipetin ucundaki mikro boncukları temizlemek için ucunu bir ortam tüpüne daldırın.Ucun kırılmamasına dikkat ederek, pipetlerin ucunu yan duvarın dorsal yüzeyinin üzerine konumlandırın ve pipet ucunu doku yüzeyinin hemen üzerine getirmek için kolu indirin. Delik montajının ön yarısını kapsayan bir görüş alanına odaklanın ve istenilen görüntülerin kaydına başlayın.Mikro boncukların yaklaşık beş litresini delik montaj yüzeyine püskürtmek için pistonu kullanın. İlk boncuk kümesi bir kanal akışı ile yüzeyden temizlendikten sonra, pistonu kullanarak beş nanolitrelik ek mikro boncuk turları püskürtün. Akış, yön ve hız, kaydedilen video kullanılarak analiz edilebilir.Bu videonun son bölümü, tüm vücut preparatlarının (hole mounts) nasıl immün boyandığını ve konfokal görüntüleme için lamlara nasıl monte edildiğini göstermektedir. Taze olarak diseke edilen tüm vücut preparatları önce 24 kuyucuklu bir plakaya aktarılır ve paraformaldehit içerisinde daldırma yöntemiyle fikse edilir. Bunu, aradaki yıkama işlemleriyle birlikte, önce primer ve ardından floresan konjuge ikincil antikorlarda gerçekleştirilen bir dizi inkübasyon takip eder.Boyamadan sonra, subventriküler zonu içeren lateral duvarın yalnızca ince tabakasını, altındaki stratum ve korteksi içeren bütün mountun geri kalanından ayırmak için bütün mountlar sub-diseksiyon işlemine tabi tutulur. Bu ince, düz doku parçası daha sonra bir lama aktarılır ve immün boyama için bütün mountları sabitlemek amacıyla lamelle kapatılır. Buz üzerinde %4 paraformaldehit ve %0,1 Triton X 100 içeren 24 kuyucuklu plaka.Bir kimyasal çeker ocak içerisinde, diseke edilmiş bir delik montajı (hole mount) ventrikül tarafı yukarı gelecek şekilde plakanın bir kuyucuğuna nazikçe daldırın. Örneği dört santigrat derecede gece boyunca sabitleyin, sabitleyiciyi aspire edin ve bir transfer pipeti kullanarak delik montajını %0,1 Triton X içeren bir XPBS ile beşer dakikadan toplam 3 kez dikkatlice yıkayın. Tüm sıvı taşıma adımlarında, delik montajının ters dönmesini ve dokunun zarar görmesini önlemek için pipetleme işlemini kuyucuğun kenarında nazikçe gerçekleştirin.Triton X ve %10 Normal keçi serumu içeren bir bloklama çözeltisini XPBS içerisinde hazırlayın; antikor penetrasyonunun gereken derinliğine bağlı olarak %2'ye kadar Triton X kullanın. Tüm örneği bloklama çözeltisi içerisinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından bloklama çözeltisini uzaklaştırın.Bloke edici çözelti ile seyreltilmiş primer antikorları ekleyin ve hedef antijene bağlı olarak 4 °C'de 24 veya 48 saat boyunca inkübe edin; ardından triton X içeren 1X PBS ile iki kez hızlıca durulayın ve bunu oda sıcaklığında 20'şer dakikalık üç yıkama ile takip edin. Bloke edici çözelti ile seyreltilmiş sekonder antikorları ekleyin ve primer antikor için uygulanan sürenin aynısı kadar 4 °C'de inkübe edin; primer antikorlarda olduğu gibi aynı şekilde yıkayın. Sonraki adım serisi, tüm mount örneğinin geri kalanından sadece lateral duvarın tek bir düz örnek olarak nasıl diseke edileceğini göstermektedir. Bu örnek, daha sonra yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mount edilebilir.İmmün boyanmış tüm beyin montajının ventrikül bölgesini, stereo mikroskop altında, arkadan öne doğru hareket ederek XPBS ile doldurulmuş temiz bir diseksiyon kabına yerleştirin. Subventriküler bölge ile striatum arasındaki ara yüzeyi görüntülemek için bir stab bıçağı kullanarak dorsal korteksi ve altındaki beyaz korpus kallozumu çıkarın. Ardından, tüm montajın ventral kısmına doğru uzun, yatay bir kesi yapın.Dokunun dorsal yüzeyi yukarı bakacak şekilde, ince pensler kullanarak dokuyu bu yeni düz kenara yönlendirin. Subventriküler zon homojen pembe dokudan oluşan ince bir banttır, striatum ise beyaz madde kordonları ile infiltre olmuştur. Ventrikül duvarına zarar vermeden dokuyu sabitlemek için pensleri stri AUM'de iki iğne gibi kullanın.Anterior kısımdan başlanarak; stab bıçağı kullanılarak striatum ile subventriküler zon arasında dikkatlice kesme işlemine başlanır. Kesimlerin ventriküler yüzeye paralel tutulması ve diseke edilen dokunun kalınlığının korunması önemlidir.Subventriküler zon posterior olarak inceldikçe, delik montajlarında ventrikül duvarının parçası olmayan tüm çevre dokuları dikkatlice temizleyin. Delik montajı 200 ve 300 mikrometre arasında tekdüze bir kalınlıkta olmalıdır.Pens yardımıyla doku parçasını alttan kaldırarak bir lam üzerine aktarın. Montaj ortamını uygulayın, ardından bir lamelle kapatın. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.Örneklerin görüntülenmesinden önce lamellerin yerleşmesine izin vermek için lamları bir lam kitabında, dört derece Celsius'ta bir ila iki gün boyunca yatay olarak saklayın. İşte bütün montaj (whole mount) immün boyama ve ek akış analizleri için bazı temsili sonuçlar. İlk görüntü, yetişkin subventriküler bölgedeki göç eden genç nöron zincirlerinin ağını gösteren bir nöroblast belirteci olan doublecortin için yapılan bütün montaj boyamasının düşük büyütmeli görünümüdür.Sıradaki görüntü, KI 67'nin yeşil ve kan damarlarının kırmızı renge boyandığı bir bütün mount örneğinin düşük güçteki görünümüdür; bu görüntü, daha yüksek güçte subventriküler zon'daki bölünen hücreler ile vaskülatür arasındaki yakın etkileşimin yakın zamanda tanımlanan durumunu göstermektedir. Bir sonraki resim, ventrikül yüzeyinin konfokal görüntüsünü göstermektedir; burada ventrikülü döşeyen hücrelerin apikal yüzeyleri yeşil beta caten boyaması ile belirlenmiş, bu hücrelerin bazal gövdeleri ise kırmızı gamma tubulin ile işaretlenmiştir. Son yüksek güçteki görüntü, GFAP için yapılan bütün mount boyamasından alınan konfokal bir yığının maksimum projeksiyonudur ve ventriküler yüzeydeki CSF akışını, yönünü ve hızını analiz etmek için S vz tip B1 hücrelerinin uzun GFAP pozitif bazal liflerini göstermektedir.Ek akış videolarından alınan ardışık kareler, tek bir kompozit görüntüde birleştirilebilir. Bu kompozit görüntüler, tekil boncukların ek veya yüzey boyunca ilerlerken farklı zaman noktalarındaki konumlarını gösterir. İşte sonuçların tamamlandığında nasıl göründüğüne dair bir örnek.Lateral ventrikülün lateral duvarının subventriküler zonundan bütün mountların (whole mount) nasıl hazırlanacağını gördünüz. Bu yöntem, tüm duvarın bütün mount görünümünü sağlar ve bu ventriküler zonun zincirleme migrasyon için bir yol ağ şeklinde organize olduğu gözlemi de dahil olmak üzere yıllar boyunca birçok keşfe olanak tanımıştır. Ayrıca bu yöntem, servis panel sıvısının bu duvar üzerinde nasıl aktığını incelememize imkan tanımış ve dolaylı olarak bu hücrelerin, oldukça kapsamlı olan bu yol ağları üzerinden migrasyonlarını nasıl yönlendirdiklerine dair ipuçları sunmuştur.Yakın zamanlarda bu teknik, subventriküler zonun, kök hücrelerin bu pinwheel (çark) yapılarının merkezinde yer aldığı pinwheel'ler şeklinde organize olduğunu keşfetmemizi sağlayarak bu yapı içindeki kök hücrelerin optik uçlarını ortaya çıkarmıştır. Whole mount (tam preparat) yöntemi, ventriküler zonun tamamına dair bütüncül bir perspektif sunduğu için kesitlerin sağlayamadığı bir görünüm sunar ve bu nedenle, birçok diğer çalışma için faydalı olacağı düşünülerek herkesin kullanımına sunulmaktadır. Whole mount preparatları hazırlarken, diseksiyonlarınızı geliştirecek hatırlanması gereken birkaç temel nokta vardır.Birincisi, uygun aydınlatmaya sahip olmaktır; montaj deliğine gölge düşürecek şekilde aydınlatmanızı ayarlayın. Bu, kontrast sağlayacak ve kesimleri nereden yapmanız gerektiğini size gösterecektir. İkincisi ise pensi iki adet hareketli pim olarak kullanmaktır.Dokuyu sıkıştırmak veya kaldırmak için pensleri kullanmamalısınız. Bunun yerine, kesme işlemi sırasında dokuyu sabitleyecek iki hareketli pim gibi kullanın. Üçüncüsü ise, genel retraksiyon ve kesme işlemlerini kombinleyerek kullanmaktır.Diseksiyonlarda fark edeceğiniz üzere, aslında çok az doku kesimi yapılır. Diseksiyonun büyük bir kısmı, tüm montajın geri kalanından lateral duvarı ayırdığınız ikinci disseksiyon aşamasındaki genel retraksiyon ile gerçekleştirilir.En önemli nokta, kesimlerinizi ventriküler yüzey düzlemine paralel bir düzlemde yönlendirmektir. Bu, lateral duvar boyunca anteriordan posteriore tek bir kalınlık elde etmenizi sağlayacaktır. Ayrıca bu durum, konfokal yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaparken tüm görüntülerin tek bir düzlemde odaklanmasını sağlayacaktır.Bu videonun çalışmalarınız için yararlı olacağını umuyoruz. Deneylerinizde başarılar dileriz.

the-subventricular-zone-en-face-wholemount-staining-and-ependymal-flow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Nöral devreler topografik spesifik moleküler profilleri ile fonksiyonel bölme halinde düzenlenmiştir. Burada, çok yönlü bir wholemount immünohistokimyasal yaklaşımını kullanarak global beyin topoğrafya ortaya çıkarılması için pratik ve teknik adımları sağlar. Bu iyi anlaşılmış cytoarchitecture ve beyincik devre kullanarak yöntemin yardımcı göstermektedir.

Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

Kayıt kalsiyum aktivitesi için gösterge kalsiyum boyalar ile subventrikuler alanin (SVZ) hücreleri yüklemek için bir yöntem tarif edilmektedir. Postnatal SVZ nöral progenitör hücreler ve nöroblast gibi sıkıca paketlenmiş hücreleri içerir. Aksine banyo yükleme kullanmaktan daha biz daha iyi boya difüzyon sağlayan doku içinde basınç boya enjekte.

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

MRI taramaları (insan), 3D görüntüleme yazılımı ve immünohistolojik analiz kullanarak, beynin lateral ventriküllerindeki değişiklikleri belgeliyoruz. Lateral ventrikül hacim değişikliklerinin uzunlamasına 3D haritalanması ve yaşlanma veya hastalık nedeniyle insan beyninde meydana gelen periventriküler hücresel değişikliklerin karakterizasyonu daha sonra farelerde modellenir.

İnsanlar ve Mouse Periventriküler Doku Yanal ventrikülleri ve histolojik Karakterizasyonu 3D Modelleme

Burada, erişkin ventriküler-subventriküler nörojenik nişteki nöral kök hücrelerin ve/veya bunların bitişik ependimal hücrelerinin uzun vadeli genetik modifikasyonu için lentiviral partiküllerin kullanımına dayanan ve nöral kök hücreler üzerindeki hücre otonom ve otonom olmayan, nişe bağlı etkilerin ayrı ayrı analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Burada mikroskobu tabanlı bir protokol için yüksek çözünürlüklü görüntü ve fare üç boyutlu rekonstrüksiyon nörovasküler birim ve kan - beyin bariyerini beyin serbest yüzer bölümleri kullanarak mevcut. Bu yöntem, görselleştirme, analiz ve BBB, hücre içi organellerin miktar için sağlar.

Kan - beyin bariyerini yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme: görüntüleme, 3D yeniden yapılanma ve Transcytosis miktar

Bu protokolün amacı lissencephalic ve gyrencephalic omurgalıların merkezi sinir sisteminin birden fazla bölgesinden mikrodamarları izole etmektir.

Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon

Bu makale, domuzların sarnıç magnasında doğrudan canül implantasyonu için adım adım bir protokol sunun.<br...

Domuzların Sarnıç Magnasında Doğrudan Kanın İmplantasyonu

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Kriyo-kesit diseksiyonu, derin nicel proteom analizi için murine beynindeki en büyük nörojenik nişin taze ve donmuş hazırlanmasını sağlar. Yöntem kesin, verimlidir ve minimum doku pertürbasyonuna neden olur. Bu nedenle, bu nişin moleküler mikroçevriminin yanı sıra diğer organların, bölgelerin ve türlerin incelenmesi için idealdir.

Doğru ve Derin Nicel Proteom Analizi için Yetişkin Subependymal Bölgesinin Kriyo-kesit Diseksiyonu

Nörobilimde az çalışılmış bir doku olan koroid pleksus (SP), merkezi sinir sisteminin sağlığında ve hastalığında önemli bir rol oynar. Bu protokol, SP'yi izole etmek için bir mikrodiseksiyon tekniğini ve hücresel yapısının genel bir görünümünü elde etmek için taramalı elektron mikroskobunun kullanımını açıklar.

Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tüm Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi

Canlı sıçanların beyinlerinden nöral kök hücrelerin ve oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem burada deneysel olarak ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Refahlarından ödün vermeden bu hücrelerin aynı hayvanlardan birden fazla toplanmasına izin verir.

Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi

Keşfedin, yetişkin memeli beynindeki subventriküler bölgede nörogenezisi incelemek için lateral ventrikül duvarlarının wholemount preparasyonu ve ependim akışı analizi yöntemini. Bu teknik, sinir kök hücre davranışlarına dair yeni bilgiler sunar.

En yüze Subventricular Bölge: Wholemount Boyama ve ependim Akış

Daha fazla video keşfet