Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, 30 gün boyunca bir dizi kültürleme adımı yoluyla embriyonik kök hücrelerden oligodendrosit öncüleri üretmektir. Bu, hücre farklılaşmasını başlatmak için önce fare ES hücrelerinden embriyo cisimleri üreterek elde edilir. İkinci adım olarak, embriyo cisimleri, hücrelerin bir liga den'e yönlendirilmiş farklılaşmasını indükleyen küçük moleküller, retinoik asit ve saf morfin ile muamele edilir.

Site öncüleri. Üçüncü adım olarak, embriyo cisimleri 22 gün daha sonra tek hücrelere ayrılır. Kültürde, hücrelerin yaklaşık% 80'i OPC'lerdir.

Daha sonra, MESC'den türetilen OPC'ler, immünofloresan mikroskobu ve elektrofizyolojik kayıtlara dayalı olarak OPC markörünün ekspresyonunu ve bu MESC türevi OBC'lerin spiking özelliklerini gösteren sonuçlar elde etmek için NAV 1.2 alt birimini taşıyan bao virüsleri ile transdüksiyona tabi tutulur. Merhaba, ben California Davis Üniversitesi Hücre Biyolojisi ve İnsan Anatomisi Bölümü'nde Dr.Ing'in laboratuvarından Pong Chiang. Ayrıca Kuzey Kaliforniya Shriners Çocuk Hastanesi'ne de bağlıyız.

Merhaba, ben de Deng laboratuvarından flakon Raj. Bugün size fare emron kök hücrelerinin soykırım öncü hücrelerine farklılaşması için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda, daha iyi terapötik potansiyele sahip hücreler üretmek için embriyonik kök hücre derd oligodendrosit öncüllerinin özelliklerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bugün, oligodendrosit öncü hücreleri veya OPC'ler, OG iki GFP fare embriyonik kök hücre hattından üretilecektir. Bu embriyonik kök hücrelerin, optimum yoğunlukta sağlıklı kalmaları ve spontan farklılaşmayı önlemeleri için her üç günde bir pasifize edilmesi gerekir. Pasaj.

ESS hücreleri, laminer akış başlığı altında% 70 oranında birleştiklerinde birleşir. Ortamı kültürün üzerine çıkarın. PBS ile durulayın ve iki mililitre ön ısıtma ile tripsin gözlerini deneyin.

37 santigrat derecede beş dakika boyunca bir x gezi LE ekspres. Reaksiyonu durdurun ve hücreleri dört mililitre MES hücre ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 1000 RP'de pelet haline getirin.

MESL orta plakasında, hücrelerin 10'da birini, MES hücre ortamındaki ışınlanmış metamfetamin besleyicilerin birleşik bir tabakası üzerinde yeniden süspanse edin. Üç gün sonra, ES hücreleri yaklaşık% 70 oranında birleşir ve embriyo cisimciklerini indüklemek ve daha önce olduğu gibi Tripsin fare ES hücre kolonilerini farklılaştırmak için embriyo cisimcikleri oluşturmak üzere geçişe veya askıya alınmaya hazırdır ve daha sonra hücreleri nakavt serum replasmanında veya KSR ortamında yeniden süspanse eder. Bir hemo TER üzerindeki hücreleri sayın, süspansiyonu KSR'de seyreltin.

Mililitre başına orta ila 15.000 hücre, ultra düşük bir ataşman altı Kuyulu plaka kültürünün her bir kuyucuğuna üç mililitre plaka. Hücreler dört gün boyunca 37 santigrat derecede asılı kaldı. Ortamı iki günde bir tamamen değiştirin.

Dördüncü günden başlayarak, ortamı dördüncü günde günlük olarak değiştirin KSR'yi beşinci günde 0.2 mikromolar retinoik asit ile destekleyin, altıncı ve yedinci günlerde hem retinoik asit hem de bir mikromolar primor kıtlığı ile destekleyin. Embriyo cisimciklerini, 0.2 mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar primor kıtlığı ile desteklenmiş iki ortamda besleyin. Kültürde sekiz gün sonra, embriyo cisimlerinin çoğu GFP'yi eksprese eder ve tripsin gözlerini ayrıştırmaya ve hücreleri daha önce olduğu gibi saymaya hazırdır.

Daha sonra bunları mililitre başına 3.5 kez 10 ila beşinci hücrelerde tekrar askıya alın. OPC ortamında, OPC ortamındaki süspansiyonun üç mililitresini refre edin. Yaklaşık her hafta poli ornitin kaplı 60 milimetrelik tabaklar kullanılarak, hücreler birleşik hale gelecek ve üç dakikalık bir tripsin izasyonu ile hücrelere daha önce olduğu gibi bu geçiş gibi görünecektir.

Orijinal Resus süspansiyonundan 30 gün sonra. KSR ortamında, hücreler, sivri OPC'ler oluşturmak için oligodendrosit öncü hücrelerinin özelliklerini gösterir. %50 ile %70 arasında birleşen fare ESL'den türetilmiş OPC'leri kullanın.

Hücreleri durulamak için ortamı bir XPBS ile değiştirin. Gerilim kapılı sodyumu tanıtmak için. Kanal 1.2 alfa alt birimi.

Arka MAM sodyum kanal kitini kullanıyoruz. Bir mililitre arka MAM bileşeni A'yı dört mililitre bir XPBS ile karıştırın. PBS durulamasını çıkarın ve seyreltilmiş bileşeni ekleyin.

İki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Arka bellek aracısını, kitte açıklandığı gibi B ve C bileşenleriyle geliştirilmiş OPC ortamıyla değiştirin. Talimatlar: 37 santigrat derecede iki saat daha inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, geliştirilmiş ortamı taze OPC ortamı ile değiştirin. 24 saatlik bir kültürden sonra, ESL'den türetilen OPC'ler bu zaman noktasında ani yükselme için test edilebilir. EBS herhangi bir GFP floresansı göstermez.

EBS, güçlü GFP ekspresyonu gösterir ve orijinal yeniden askıya alındıktan sonra yaklaşık 30 gün boyunca ayrıştırma kültürüne hazırdır. KSR ortamında, hücrelerin çoğu, GFP ekspresyonu ile tutarlı olan NG iki boyama için immün pozitiftir. Bununla birlikte, beyin OPC'lerinden farklı olarak, bu MES hücresinden türetilmiş OPC'ler, hücreler sıfır milivolta depolarize edildiğinde bile aksiyon potansiyellerini ateşleyemez.

Viral transdüksiyon ile NAV 1.2 alt birimini tanıttıktan sonra, bu MES hücresinden türetilmiş OPC'ler uyarılır ve ateş etme aksiyon potansiyelleri elde eder. Fare embriyonik kök hücrelerini OPC'lere nasıl ayırt edeceğinizi ve viral transdüksiyon yoluyla ani OPC'leri nasıl oluşturacağınızı az önce gösterdik. Bu prosedürü yaparken, retinoid asidi morfin başına ve FGF'yi iki düzgün bir şekilde saklamayı ve her zaman taze alikotlar kullanmayı, kullanımdan sonra fazla t retinoid asidi atmayı unutmamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.