Name: Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerini oligodendrosit öncü hücrelere farklılaştırma yöntemini. Küçük moleküller kullanılarak 30 günde yüksek verimli Olig2+NG2+ OPC üretimi ve aksiyon potansiyeli oluşturan spiking OPC tekniği sunulur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüsü (RO1 NS059043 ve RO1 ES015988), Ulusal Multipl Skleroz Derneği, Anemi Araştırma, Feldstein Tıp Vakfı Roche Vakfı ve Çocuk Shriners Hastaneler WD hibe tarafından desteklenmiştir. Biz Dr David Pleasure ve Jennifer Düzlem önerileriniz için teşekkür etmek istiyorum. Biz bu makalede ilgili hiçbir çatışan çıkarları beyan ederim.

GFP-Olig2 fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) oligodendrosit öncü hücreler (OPC) üreten detaylı prosedürler: <ol><li> Fare ES hücre hattı GFP-Olig2 (G-Olig2), American Type Culture Collection (ATCC) satın alınmaktadır. MESCs ışınlanmış bir fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici tabaka üzerine 3 gün rutin olarak her geçişli. MEF hücreleri jelatin kaplı altı kuyu doku kültürü plaka EKH Pasajlanması önce en az bir gün% 0.1 kaplanmıştır. Mesc kültür orta,% 20 fetal sığır serumu (Gibco), 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 0,1 mM β-merkaptoetanol /,% 1 gerekli olmayan amino asitler (ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle Kullanıcı orta (DMEM) (Gibco) NEAA) ve 1000 U / ml lösemi inhibitör faktör. </li><li> MES koloniler tek hücre içine tripsinize (TrypLE, 5 dk, 37 ° C) ve nakavt serum replasmanı (KSR) orta askıya alınır, daha sonra hücrelerin bir hücre Costar ultra-düşük ek altı plaka (Corning) aktarılır 50.000 hücre / cm 2 yoğunluğu. Bu koşullarda, mESCs embriyoid organları (EBS) oluşturur. KSR orta,% 20 KSR, 1 mM sodyum piruvat,% 1 NEAA, 0.1 mM β-mercaptoethanol / ile desteklenmiş-minimal temel orta (MEM) oluşur. </li><li> Günden itibaren 7 gün 4, retinoik asit (RA, 0.2 M) ve purmorphamine (Pur, 1 M) Şekil dahildir. KSR veya N2 orta 1A. N2 orta 1X N2 takviyesi, 1 mM sodyum piruvat,% 1 NEAA ve 0.1 mM β-mercaptoethanol / içeren-MEM. Orta günlük değiştirildi. </li><li> 8 gün, EBS, N2, orta ve fibroblast oluşur OPC orta% 0.01 polyornithine kaplı yemekleri TrypLE (5 dk, 37 ° C) kaplanmıştır kullanarak ayrıştırılmıştır büyüme faktörü-2 (FGF-2, 20 ng / ml). Orta olmak üzere iki günde bir değiştirilir. </li><li> Hücreleri tripsinize (TrypLE, 3 dk, 37 ° C) ve konfluent olunca her hafta yaklaşık replated. 30 gün, hücrelerin% 80 GFP/Olig2 ifade, NG2 pozitif OPC, karakteristik. </li><li> Spike OPC oluşturmak için BacMam Na + kanallı kit bu Mesc türetilen OPC Na v 1.2 altbirim tanıtmak amacıyla kullanılmıştır. BacMam reaktif (1 ml, komponent A), 5 ml nihai hacmi PBS ile karıştırılır. Daha sonra, karma BacMam reaktif önce PBS ile çalkalayın (% 50-70 izdiham) 60 mm kültür çanak Mesc türetilmiş bir OPC kültürü içine eklenir. 2 saat inkübasyondan sonra, karma BacMam reaktif 1X arttırıcı ile desteklenmiş OPC orta ile kaldırılır ve değiştirilir. Arttırıcı bileşeni B DMSO (component C) sulandırılmış. Sonra, ilave 2 saat inkübasyon sonra tam OPC orta arttırıcı ile orta kaldırılır ve değiştirilir. Hücrelerin 24 saat sonra test. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Şekil farklılaşma protokolü takiben. 1A, G-Olig2 mESCs başlangıçta embriyoid organları (EBS) (Şekil 1B) oluşturmak için KSR orta ve 4 gün süreyle askıya alındı. Sonra, sırayla EBS RA ve Pur ile tedavi. EBS 4. Gün herhangi bir GFP floresan ve D8 (Şekil 1B) güçlü GFP floresan ifade vermedi. Bu noktada, EBS tripsinize ve büyüme faktörleri FGF-2 ile desteklenmiş N2 orta kaplanmış. 22 gün (D30) için daha fazla kültür sonra, GFP + hücre yüzdesi 80.3 ulaştı ± flow sitometri sonuçlarına göre% 0.6. Şekil. 1C, GFP + hücreler sürekli NG2 boyama (% 96.4 ± 1.3 GFP pozitif hücreler pozitif NG2 ve% 94.8 ± 1.5 NG2 pozitif hücreler, GFP pozitif idi) ile çakışıyordu. Böylece, bu hücreler OPC olarak tanımlayarak, GFP/Olig2 ve NG2 ifade. Mesc türetilen OPC (76 hücreleri) depolarizasyon (Şekil 2A) üzerine aksiyon potansiyelleri yangın başarısız oldu. Bakülovirüs Na v 1.2 altbirim taşıyan bir uyum sonra, bu Mesc türetilen OPC (17 hücrelerinin% 94.1, 16) spike (Şekil 2B) olarak sınıflandırılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Embriyoid vücut protokol gösteren OPC içine GOlig-Mesc Farklılaşma (A) Programı (EB) tabanlı ve küçük molekül odaklı farklılaşma. D8, EBS ayrıştırılmış ve kaplanmıştır. Konfluent oldu hücreleri haftada bir pasajlandı. (B) D8, ama D4 EBS, GFP ifade gösterdi. (C) NG2 (kırmızı) immün D30 GFP (yeşil) ifadesi ile uyumlu idi. DAPI (mavi), çekirdekleri tanımlamak için kullanılır. Ölçek çubuğu: 20 mm. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/1960/1960fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Mesc türetilen OPC nonspiking, OPC spike nesil virüs aracılı hücre 0 depolarize bile Na v kanal ifade (A) membran potansiyeli -60 mV ve Mesc türevi OPC yapıldı, aksiyon potansiyelleri yangın başarısız mV. (B) Mesc türetilen OPC bir örnekviral transdüksiyon sonra ateş aksiyon potansiyeli (kırmızı vurgulanmıştır).

<ol><li>Xian, H., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dividing+Olig2-expressing+progenitor+cells+derived+from+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells.</a> Glia. 47 (1), 88-101 (2004).</li>
<li>Clair, A., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+ES-cell-derived+neural+cells+marked+by+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting.</a> Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-dependent+Olig2+expression+in+motor+neurons+and+oligodendrocytes+differentiated+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).</li>
<li>Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+timing+of+oligodendrocyte+development+from+genetically+engineered%2C+lineage-selectable+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells.</a> J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).</li>
<li>Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+NG2+proteoglycan+and+PDGF+alpha-receptor+on+O2A+progenitor+cells+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain.</a> J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).</li>
<li>Ligon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+NG2+neural+progenitor+cells+requires+Olig+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).</li>
<li>Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).</li>
<li>Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+in+the+mouse+white+and+grey+matter+display+distinct+physiological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties.</a> J Physiol. 561, 109-122 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+and+nonspiking+classes+of+oligodendrocyte+precursor+glia+in+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter.</a> Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).</li>
</ol>

Oligodendrosit şartname de dahil olmak üzere, erken memeli geliştirme eğitimi için bir in vitro model sistemi sağlayarak, blastokist embriyo izole Embriyonik kök hücreler (EKH), 3, 4, organizmanın tüm hücre soyları ayırt edebilirsiniz. mESCs sonik kirpi (Shh) 5 tedavisinde oligodendrosit öncü hücreler (OPC) ayırt etmek için gösterilmiştir. Ayrıca, mESCs Shh kaynaklı OPC farklılaşma, embriyonik gelişim 6 gözlenen doğru zamanlama korur . Bu nedenle, in vitro OPC farklılaşmasında mESCs doğası in vivo geliştirme öğrendim ne ile tutarlı olarak kabul edilir. Burada, küçük moleküller RA ve Shh agonist Pur kullanarak, yüksek verimlilik ile GFP + Olig2 + NG2 + OPC başarıyla G-Olig2 mESCs farklılaşmış. Toplam hücrelerinin önemli bir yüzdesini oluşturan (~% 5) ve proteoglikan NG2 7 ifadesi ve helix-loop-helix transkripsiyon faktörü Olig2 8 ile karakterize OPC, gelişmekte olan ve olgun MSS oligodendrosit oluşturmak ana prolifere hücre tipi 9. V kanal Na göstermiştir yaklaşık iki yıl araştırmacılar için bir OPC ICSI&#39;nin ifade depolarizasyon 10, 11 üzerine devreye sokulabilir. Ayrıca, son çarpıcı bir gözlem 9 beyaz cevher in situ sıçan MSS, voltaj kapılı sodyum (Na V) kanalları, ifade bağlı olarak zaman depolarize, OPC (~% 50) aksiyon potansiyelleri oluşturulur ve böylece spike bölünmüştür olabilir alt popülasyonlar nonspiking. Ancak, bu spiking özellikleri fonksiyonları halen büyük ölçüde bilinmiyor. Biz elektrofizyolojik, Shh bağımlı protokol ile farklılaşmış Mesc kaynaklı OPC, in situ beyin OPC olarak aynı değildi, o bulundu . Subunit Na V 1.2 tanıttıktan sonra, bu sessiz Mesc türetilen OPC spike kabil edildi. Böylece, spike / Mesc türetilen OPC ve farklılaşma protokol burada açıklanan nonspiking (1) spike ve nonspiking OPC arasındaki işlevsel farklılıklar, (2) Mesc kaynaklı OPC, sodyum kanal ifade teşvik tarama yeni faktörler eğitimi kolaylaştırmak ( 3) geliştirilmesi ve insan ESC veya uyarılan pluripotent kök hücreleri (iPSCs) OPC farklılaşma protokolü optimize.

<table><tbody><tr><td>MEF'ler</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6001G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamin</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009634</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>EMD Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>BacMam Na&lt;sub&gt;V&lt;/sub&gt; 1.2</td><td>Invitrogen</td><td>B10341</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik kök hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrosit, merkezi sinir sistemi myelinating hücreleri vardır. Demiyelinizan hastalıkları rejeneratif hücre tedavisi için, saf bir nüfus nakli için soy taahhüt oligodendrosit öncü hücreler (OPC) kaynaklanan önemli bir ilgi var. OPC, transkripsiyon faktörü Olig2 ve proteoglikan NG2 yüzey ifade aktivitesi ile karakterize edilir. GFP-Olig2 (G-Olig2) fare embriyonik kök hücre (Mesc) muhabiri hattı kullanarak, GFP + Olig2 + NG2 + OPC içine mESCs farklılaşması için koşulları optimize edilmiş. Bizim protokolde, ilk mESCs embriyoid organlarının nesil (EBS) açıklar. İkincisi, küçük moleküller Mesc türetilen EBS tedavi açıklar: (1) retinoik asit (RA) ve (2) belirlenen kültür koşulları altında sonik kirpi (Shh) agonist purmorphamine (Pur) oligodendroglial soy içine doğrudan EB farklılaşma. Bu yaklaşım, OPC 30 gün bir süre yüksek verim (&gt;% 80) ile elde edilebilir. Bu protokolde mESCs türetilen hücreler primer doku kültürü ile elde edilen OPC fenotipik benzer. Mesc türetilen OPC in situ beyin OPC bir ICSI&#39;nin açıklanan spike özelliği görünmüyor. Bu elektrofizyolojik özellik çalışma için, ektopik Na ifade ederek Mesc-türetilen OPC spike nesil tarif<sub&gt; V</sub&gt; 1.2 altbirimlerine. Bu protokol elde spike ve nonspiking hücreleri OPC iki alt popülasyonlar üzerinde önceden fonksiyonel çalışmalara yardımcı olacaktır.

Biz küçük bir molekül tabanlı oligodendrosit öncü hücreler (OPC) içine fare embriyonik kök hücreleri farklılaşma için protokol açıklar. Bu protokol, 30 gün farklılaşma, yüksek verimlilik ile Olig2 + NG2 + OPC üretir. Ayrıca, aksiyon potansiyelleri ateş &quot;spike&quot; OPC oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrositler, merkezi sinir sisteminin miyelin oluşturucu hücreleridir. Demiyelinizan hastalıkların rejeneratif hücre tedavisi için, önemli bir ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, 30 gün boyunca süren bir dizi kültürleme aşaması aracılığıyla embriyonik kök hücrelerden oligodendrosit öncüllerini üretmektir. Bu işlem, öncelikle hücre farklılaşmasını başlatmak için fare ES hücrelerinden embriyo gövdeleri oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, embriyo gövdeleri, hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşmasını bir liganden şeklinde indükleyen retinoik asit ve saf morfin küçük molekülleri ile işleme tabi tutulur.Sit prekürsörleri. Üçüncü adım olarak, embriyo gövdeleri 22 gün sonra tek hücrelere ayrıştırılır. Kültürde, hücrelerin yaklaşık %80'i OPC'lerdir.Ardından, spiking OPC'ler oluşturmak amacıyla, MESC türevli OPC'ler NAV 1.2 alt birimi taşıyan bao virüsleri ile transdüse edilir; immünofloresan mikroskopi ve elektrofizyolojik kayıtlar temel alınarak, bu MESC türevli OBC'lerin OPC markör ekspresyonunu ve spiking özelliklerini gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Kaliforniya Üniversitesi Davis, Hücre Biyolojisi ve İnsan Anatomisi Bölümü'ndeki Dr. Ing laboratuvarından Pong Chiang. Aynı zamanda Kuzey Kaliforniya Shriners Çocuk Hastanesi ile de bağlantılıyız.Merhaba, ben de Deng laboratuvarından Vial Raj. Bugün size mouse embriyonik kök hücrelerinin oligodendrosit öncül hücrelerine farklılaştırılması prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, daha iyi terapötik potansiyele sahip hücreler üretmek amacıyla embriyonik kök hücre kaynaklı oligodendrosit öncüllerinin özelliklerini incelemek için kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Bugün, OG2 GFP fare embriyonik kök hücre hattından oligodendrosit öncül hücreleri veya OPC'ler üretilecektir. Bu embriyonik kök hücrelerin, sağlıklı kalmaları, optimum yoğunlukta tutulmaları ve spontan farklılaşmanın önlenmesi için her üç günde bir pasajlanması gerekir. Pasajlama.ESS hücreleri, laminar akışlı kabin altında %70 konfluense ulaştığında. Kültür üzerindeki besiyerini uzaklaştırın. PBS ile durulayın ve önceden ısıtılmış iki mililitre tripsin ile tripsinizasyon yapın.37 °C'de beş dakika boyunca bir kez LE ekspres işlemi uygulayın. Reaksiyonu durdurun ve hücreleri dört mililitre MES hücre ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 1000 RP'de beş dakika boyunca pelletleyin.Hücrelerin onda birini, MES hücre besiyeri içindeki ışınlanmış meth feeder'ların konfluen tabakası üzerine, MESL besiyeri plağına yeniden süspande edin. Üç gün sonra ES hücreleri yaklaşık %70 konfluen hale gelir ve pasajlanmaya veya embriyo gövdeleri oluşturmak üzere süspande edilmeye hazır olur. Embriyo gövdelerini indüklemek ve diferansiyasyonu başlatmak için, fare ES hücre kolonilerini daha önce olduğu gibi tripsinleyin ve ardından hücreleri knockout serum replacement veya KSR besiyerinde yeniden süspande edin. Hücreleri bir hemositometrede sayın ve süspansiyonu KSR ile seyreltin.Mililitrede 15.000 hücre yoğunluğundaki ortamdan, ultra düşük yapışma özellikli altı kuyucuklu bir kültür plağının her kuyucuğuna üç mililitre ekleyin. Süspansiyon halindeki hücreleri 37 °C'de dört gün boyunca kültüre edin. Besiyerini her iki günde bir tamamen değiştirin.Dördüncü günden itibaren, dördüncü günde besiyerini günlük olarak değiştirin. Beşinci günde KSR'yi 0.2 µM retinoik asit ile takviye edin; altıncı ve yedinci günlerde ise hem retinoik asit hem de 1 µM primor famine ile takviye edin. Embriyo gövdelerini, 0.2 µM retinoik asit ve 1 µM primor famine ile takviye edilmiş iki besiyeri içinde besleyin. Kültürde sekiz gün geçtikten sonra, embriyo gövdelerinin çoğunluğu GFP eksprese eder ve tripsinize edilerek ayrıştırılmaya hazır hale gelir; hücreleri daha önce olduğu gibi sayın.Ardından hücreleri mL başına 3,5 × 10⁵ hücre olacak şekilde süspande edin. OPC ortamında, süspansiyonun 3 mL'sini OPC ortamına yeniden aktarın. Poli-ornitin kaplı 60 mm'lik kaplar kullanarak, yaklaşık her hafta hücreler konfllü hale gelecek ve şu şekilde görünecektir; hücreleri daha önce olduğu gibi üç dakikalık tripsinizasyon ile pasajlayın.Orijinal resus süspansiyonundan 30 gün sonra. KSR medyumunda hücreler, spiking OPC'ler oluşturmak için oligodendrosit öncül hücre karakteristikleri gösterir. %50 ile %70 arasında konflüent olan fare ESL kaynaklı OPC'ler kullanın.Hücreleri durulamak için besiyerini XPBS ile değiştirin. Voltaj kapılı sodyum kanalı 1.2 alfa alt birimini tanıtmak için.Back MAM sodyum kanalı kiti kullanıyoruz. Bir mililitre back MAM bileşen A'yı dört mililitre 1X PBS ile karıştırın. PBS durulama çözeltisini uzaklaştırın ve seyreltilmiş bileşeni ekleyin.A'yı 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Arka bellek ajanını, kitte açıklandığı şekilde B ve C bileşenleri ile zenginleştirilmiş OPC medyumu ile değiştirin. Talimatlar, 37 °C'de iki saat daha inkübe edilmesini belirtmektedir.İnkübasyonun ardından, zenginleştirilmiş besiyeri taze OPC besiyeri ile değiştirilir. 24 saatlik bir kültür süresinin daha ardından, ESL kaynaklı OPC'lerin bu zaman noktasında spiking analizi yapılabilir. EBS'ler herhangi bir GFP floresansı göstermez.EBS'ler, orijinal resüspansiyon süspansiyonundan yaklaşık 30 gün sonra güçlü GFP ekspresyonu gösterir ve disagregasyon kültürü için hazır hale gelirler. KSR ortamında, hücrelerin çoğunluğu NG2 boyaması için immünopozitiftir ve bu durum GFP ekspresyonu ile uyumludur. Ancak, beyin OPC'lerinin aksine, bu MES hücre türevli OPC'ler, hücreler sıfır milivolta depolarize edildiğinde bile aksiyon potansiyeli oluşturamazlar.Viral transdüksiyon ile NAV 1.2 alt birimi tanıtıldıktan sonra, bu MES hücre türevli OPC'ler uyarılır ve aksiyon potansiyelleri oluşturur. Fare embriyonik kök hücrelerinin OPC'lere nasıl farklılaştırılacağını ve viral transdüksiyon yoluyla spike yapan OPC'lerin nasıl üretileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, retinoik asidi, morfini ve FGF 2'yi uygun şekilde saklamayı, her zaman taze alikotlar kullanmayı ve kullanım sonrası fazla retinoik asidi atmayı hatırlamak önemlidir.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

differentiation-embryonic-stem-cells-into-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler...

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Bu video, yetişkin fare beyninden lateral ventrikül duvarlarını izole etmek ve tek hücreler elde etmek için enzimatik doku ayrışması gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücrelerin proliferasyonunu seçici olarak artıran ve bunların oligodendrositlerin ve astrositlerin ko-kültürlerine farklılaşmasını teşvik eden spesifik kültür koşullarına tabi tutulur.

Yetişkin fare nöral kök hücrelerinden karışık oligodendrosit ve astrosit kültürü elde edilmesi

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinden oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) üretilmesi sürecini ve ardından OPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını göstermektedir. Bu oligodendrosit üretme süreci, Alzheimer da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların araştırma ve tedavisini iyileştirmek için çok sayıda yol açar.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Oligodendrositlere Farklılaşması

Bu video, insan kaynaklı nöronların (iN'ler) ve indüklenmiş oligodendrosit öncü hücrelerinin (iOPC'ler) bir ko-kültürünün kurulmasını göstermektedir. iN'ler bir ko-kültürde iOPC'lerle karıştırılır ve daha sonra her iki iN'nin nöronlara ve iOPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını desteklemek için inkübe edilir. Nöronlar, diğer nöronlar ve oligodendrositlerle sinaptik bağlantılar oluştururken, oligodendrositler, nöronların aksonlarının etrafında miyelin kılıfları geliştirir.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Bir Ko-Kültür Yöntemi

Oligodendrositler, merkezi sinir sisteminin miyelinli hücreleridir. Bu protokol, öncülleri olan oligodendrosit progenitör hücrelerinin sıçan kortekslerinden izolasyonu ve kültürü için bir yöntemin yanı sıra, deneysel faktörlere yanıt olarak in vitro oligodendrogenezi değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir kantitatif yöntemi tanımlar.

Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Nörodejenerasyonda nöron-glial etkileşimler yetersiz araç ve yöntemler nedeniyle iyi anlaşılamamıştır. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden indüklenmiş nöronlar, oligodendrosit öncü hücreleri ve oligodendrositler elde etmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz ve Alzheimer hastalığında hücre tipine özgü katkıları anlamada bu yöntemlerin değerlerine örnekler sunuyoruz.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

Olgun oligodendrositlere dönüşen fetal veya yetişkin nöral kök hücrelerden elde edilen astrositlerin ve oligodendrosit öncül hücrelerin karma kültürlerinin üretimini ve zararlı uyaranların in vitro modellemesini anlatıyoruz. Hücre tabanlı yüksek içerikli tarama tekniği ile bağlantı, güvenilir ve sağlam bir ilaç tarama sistemi oluşturur.

Fetal ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Türevi Oligodendrosit Öncül Hücre Kültürlerinin Yüksek İçerik tarama farklılaşması ve olgunlaşma analizi

Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerini oligodendrosit öncü hücrelere farklılaştırma yöntemini. Küçük moleküller kullanılarak 30 günde yüksek verimli Olig2+NG2+ OPC üretimi ve aksiyon potansiyeli oluşturan spiking OPC tekniği sunulur.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Daha fazla video keşfet